Starożytne DNA - Ancient DNA

Usieciowany DNA wyekstrahowany z 4000-letniej wątroby starożytnego egipskiego kapłana Nekht-Ankh.

Starożytne DNA (aDNA) to DNA wyizolowane ze starożytnych okazów . W wyniku procesów degradacji (m.in. sieciowania , deaminacji i fragmentacji ) pradawny DNA jest bardziej zdegradowany w porównaniu ze współczesnym materiałem genetycznym. Nawet w najlepszych warunkach przechowywania istnieje górna granica 0,4-1,5 miliona lat, aby próbka zawierała wystarczającą ilość DNA do technologii sekwencjonowania. Materiał genetyczny został pozyskany z paleo/archeologicznego i historycznego materiału szkieletowego, zmumifikowanych tkanek, archiwalnych kolekcji niezamrożonych okazów medycznych, zachowanych szczątków roślinnych, lodu i rdzeni wiecznej zmarzliny , osadów morskich i jeziornych oraz brudu wykopaliskowego .

Historia starożytnych badań DNA

lata 80.

Pierwsze badanie tego, co zostanie nazwane aDNA, przeprowadzono w 1984 r., kiedy Russ Higuchi i współpracownicy z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Berkeley donieśli, że ślady DNA z muzealnego okazu kwaggi nie tylko pozostały w okazie ponad 150 lat później. śmierć jednostki, ale można ją wydobyć i zsekwencjonować. W ciągu następnych dwóch lat, poprzez badania naturalnych i sztucznie zmumifikowanych okazów, Svante Pääbo potwierdził, że zjawisko to nie ogranicza się do stosunkowo niedawnych okazów muzealnych, ale może być najwyraźniej replikowane w szeregu zmumifikowanych próbek ludzkich, datowanych nawet na kilka tysięcy lat. .

Żmudne procesy, które były wówczas wymagane do sekwencjonowania takiego DNA (poprzez klonowanie bakterii ) były skutecznym hamulcem rozwoju dziedziny dawnego DNA (aDNA). Jednak wraz z rozwojem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) pod koniec lat 80-tych, dziedzina zaczęła szybko się rozwijać. Amplifikacja aDNA w reakcji PCR z podwójnym starterem (skokowy PCR) może dawać wysoce zniekształcone i nieautentyczne artefakty sekwencji. W celu przezwyciężenia tych niedociągnięć zastosowano strategię zagnieżdżonego PCR z wieloma starterami .

1990

Era post-PCR zapowiadała falę publikacji, ponieważ liczne grupy badawcze odniosły sukces w izolowaniu aDNA. Wkrótce opublikowano serię niesamowitych odkryć, twierdzących, że autentyczne DNA można wyekstrahować z okazów sprzed milionów lat, w sferę tego, co Lindahl (1993b) nazwał DNA przedpotopowym . Większość tych twierdzeń opierała się na pozyskaniu DNA z organizmów zachowanych w bursztynie . Z bursztynu dominikańskiego datowanego na epokę oligocenu podobno pozyskiwano owady, takie jak pszczoły bezżądłe, termity i komary drzewne, a także sekwencje roślinne i bakteryjne . Jeszcze starsze źródła libańskich ryjkowców w bursztynie , datowane na epokę kredową , również dostarczyły autentycznego DNA. Twierdzenia o odzyskaniu DNA nie ograniczały się do bursztynu.

Opublikowano raporty o kilku zachowanych w osadach szczątkach roślin datowanych na miocen . Następnie w 1994 roku Woodward i in. opisał to, co w tamtym czasie nazywano najbardziej ekscytującymi do tej pory wynikami — mitochondrialne sekwencje cytochromu b, które najwyraźniej zostały wyekstrahowane z kości dinozaurów sprzed ponad 80 milionów lat. Kiedy w 1995 roku dwa kolejne badania doniosły o sekwencjach DNA dinozaurów wyekstrahowanych z kredowego jaja, wydawało się, że dziedzina ta zrewolucjonizuje wiedzę o ewolucyjnej przeszłości Ziemi. Nawet te niezwykłe wieki zostały zwieńczone rzekomym pobraniem 250-milionowych sekwencji halobakterii z halitu .

Rozwój lepszego zrozumienia kinetyki konserwacji DNA, ryzyka zanieczyszczenia próbki i innych czynników komplikujących sprawił, że badacze zaczęli bardziej sceptycznie podchodzić do tych wyników. Liczne staranne próby nie zdołały powtórzyć wielu ustaleń, a wszystkie twierdzenia o wielomilionowym aDNA sprzed dekady zostałyby odrzucone jako nieautentyczne.

2000s

Amplifikacja wydłużania pojedynczego startera została wprowadzona w 2007 r., aby przeciwdziałać uszkodzeniom pośmiertnych modyfikacji DNA. Od 2009 roku dziedzina badań aDNA została zrewolucjonizowana przez wprowadzenie znacznie tańszych technik badawczych. Zastosowanie wysokoprzepustowych technik sekwencjonowania nowej generacji (NGS) w dziedzinie badań nad starożytnym DNA ma zasadnicze znaczenie dla rekonstrukcji genomów dawnych lub wymarłych organizmów. Metoda przygotowania biblioteki jednoniciowego DNA (ssDNA) wzbudziła duże zainteresowanie wśród badaczy starożytnego DNA (aDNA).

Oprócz tych technicznych innowacji, na początku dekady w tej dziedzinie zaczęto opracowywać lepsze standardy i kryteria oceny wyników DNA, a także lepsze zrozumienie potencjalnych pułapek.

Problemy i błędy

Procesy degradacji

Ze względu na procesy degradacji (w tym sieciowania, deaminacji i fragmentacji) pradawne DNA jest gorszej jakości w porównaniu z nowoczesnym materiałem genetycznym. Charakterystyki uszkodzeń i zdolność aDNA do przetrwania w czasie ograniczają możliwe analizy i wyznaczają górną granicę wieku udanych próbek. Istnieje teoretyczna korelacja między czasem a degradacją DNA, chociaż różnice w warunkach środowiskowych komplikują sprawę. Próbki poddane różnym warunkom prawdopodobnie nie będą w przewidywalny sposób dopasować się do jednolitej zależności wiek-degradacja. Skutki środowiskowe mogą mieć nawet znaczenie po wykopaniu, ponieważ tempo rozpadu DNA może wzrosnąć, szczególnie w zmiennych warunkach przechowywania. Nawet w najlepszych warunkach przechowywania istnieje górna granica 0,4-1,5 miliona lat, aby próbka zawierała wystarczającą ilość DNA dla współczesnych technologii sekwencjonowania.

Badania nad rozpadem mitochondrialnego i jądrowego DNA w kościach Moa umożliwiły modelowanie degradacji mitochondrialnego DNA do średniej długości 1 pary zasad po 6830 000 lat w temperaturze -5 °C. Kinetykę rozpadu zmierzono za pomocą eksperymentów przyspieszonego starzenia, które dodatkowo wykazały silny wpływ temperatury i wilgotności przechowywania na rozpad DNA. Jądrowy DNA ulega degradacji co najmniej dwa razy szybciej niż mtDNA. W związku z tym wczesne badania, które wykazały odzyskanie znacznie starszego DNA, na przykład ze szczątków dinozaurów z okresu kredy , mogły wynikać z zanieczyszczenia próbki.

Limit wieku

Krytyczny przegląd literatury o starożytnym DNA poprzez rozwój tej dziedziny podkreśla, że ​​w kilku badaniach po około 2002 r. udało się wzmocnić DNA ze szczątków starszych niż kilkaset tysięcy lat. Większe uznanie dla ryzyka zanieczyszczenia środowiska i badania stabilności chemicznej DNA wywołały obawy dotyczące wcześniej zgłoszonych wyników. Domniemane DNA dinozaurów okazało się później ludzkim chromosomem Y , podczas gdy DNA z enkapsulowanych halobakterii zostało skrytykowane ze względu na podobieństwo do współczesnych bakterii, co wskazuje na zanieczyszczenie. Badanie z 2007 roku sugeruje również, że te próbki bakteryjnego DNA mogły nie przetrwać od czasów starożytnych, ale zamiast tego mogą być produktem długotrwałej aktywności metabolicznej na niskim poziomie .

aDNA może zawierać dużą liczbę mutacji pośmiertnych , rosnących z czasem. Niektóre regiony polinukleotydów są bardziej podatne na tę degradację, więc dane sekwencyjne mogą ominąć filtry statystyczne używane do sprawdzania poprawności danych. Ze względu na błędy w sekwencjonowaniu należy zachować dużą ostrożność w interpretacji liczebności populacji. Podstawienia powstałe z dezaminacji od cytozyny pozostałości są znacznie nadreprezentację w dawnych sekwencji DNA. Błędne kodowanie C do T i G do A stanowi większość błędów.

Zanieczyszczenie

Innym problemem związanym ze starożytnymi próbkami DNA jest zanieczyszczenie współczesnym ludzkim DNA i DNA drobnoustrojów (z których większość jest również starożytna). W ostatnich latach pojawiły się nowe metody zapobiegania ewentualnemu zanieczyszczeniu próbek aDNA, w tym przeprowadzanie ekstrakcji w ekstremalnie sterylnych warunkach, stosowanie specjalnych adapterów do identyfikacji endogennych cząsteczek próbki (powyżej tych, które mogły zostać wprowadzone podczas analizy) oraz zastosowanie bioinformatyki do sekwencje oparte na znanych odczytach w kolejności przybliżonych wskaźników zanieczyszczenia.

Nie-ludzkie aDNA

Pomimo problemów związanych z „przedpotopowym” DNA, opublikowano obecnie szeroki i stale rosnący zakres sekwencji aDNA z szeregu taksonów zwierzęcych i roślinnych . Badane tkanki obejmują sztucznie lub naturalnie zmumifikowane szczątki zwierzęce, kości, paleofea, próbki konserwowane alkoholem, gryzoni, suszone szczątki roślinne, a ostatnio także ekstrakcje zwierzęcego i roślinnego DNA bezpośrednio z próbek gleby .

W czerwcu 2013 r. grupa badaczy, w tym Eske Willerslev , Marcus Thomas Pius Gilbert i Orlando Ludovic z Centre for Geogenetics , Natural History Museum of Denmark na Uniwersytecie w Kopenhadze , ogłosiła, że ​​zsekwencjonowała DNA 560–780 tysięcy lat. stary koń, używając materiału wydobytego z kości nogi znalezionej w wiecznej zmarzlinie na terytorium Jukonu w Kanadzie . Niemiecki zespół doniósł również w 2013 r. o zrekonstruowanym genomie mitochondrialnym niedźwiedzia Ursus deningeri , który ma ponad 300 000 lat, co dowodzi, że autentyczne starożytne DNA można zachować przez setki tysięcy lat poza wieczną zmarzliną. Sekwencja DNA jeszcze starszego DNA jądrowego została zgłoszona w 2021 r. z zachowanych w wiecznej zmarzlinie zębów dwóch mamutów syberyjskich , oba mające ponad milion lat.

Naukowcy w 2016 roku zmierzyli DNA chloroplastów w rdzeniach osadów morskich i znaleźli DNA okrzemek sprzed 1,4 miliona lat. To DNA miało okres półtrwania znacznie dłuższy niż w poprzednich badaniach, do 15 000 lat. Zespół Kirkpatricka odkrył również, że DNA rozpadało się tylko wraz z okresem półtrwania do około 100 tysięcy lat, w którym to momencie nastąpiło wolniejsze tempo rozpadu zgodnie z prawem potęgowym.

ludzkie aDNA

Mapa skamielin ludzkich w wieku co najmniej ~40 000 lat, która dostarczyła danych dotyczących całego genomu

Ze względu na duże zainteresowanie antropologiczne , archeologiczne i publiczne, skierowane na ludzkie szczątki, przyciągnęły one znaczną uwagę społeczności DNA. Istnieją również głębsze problemy z zanieczyszczeniem, ponieważ okazy należą do tego samego gatunku, co badacze zbierający i oceniający próbki.

Źródła

Ze względu na konserwację morfologiczną mumii, wiele badań z lat 90. i 2000. wykorzystywało zmumifikowaną tkankę jako źródło starożytnego ludzkiego DNA. Przykłady obejmują zarówno okazy konserwowane naturalnie, na przykład te konserwowane w lodzie, takie jak Lodziarz Ötzi , lub poprzez szybkie wysychanie , takie jak mumie z Andów na dużych wysokościach, a także różne źródła sztucznie konserwowanej tkanki (takie jak poddane obróbce chemicznej mumie starożytnego Egiptu). Jednak zmumifikowane szczątki są ograniczonym zasobem. Większość badań nad ludzkim aDNA skupiała się na ekstrakcji DNA z dwóch źródeł, które są znacznie częstsze w danych archeologicznychkości i zębów . Kość najczęściej wykorzystywana do ekstrakcji DNA to kość skalista , ponieważ jej gęsta struktura zapewnia dobre warunki do zachowania DNA. Kilka innych źródeł również dostarczyło DNA, w tym paleofaeces i włosy . Zanieczyszczenie pozostaje głównym problemem podczas pracy na starożytnym materiale ludzkim.

DNA starożytnych patogenów zostało z powodzeniem pobrane z próbek datowanych na ponad 5000 lat u ludzi i aż 17 000 lat temu u innych gatunków. Oprócz typowych źródeł zmumifikowanej tkanki, kości i zębów, takie badania obejmowały również szereg innych próbek tkanek, w tym zwapniałą opłucną , tkankę zatopioną w parafinie i tkankę utrwaloną w formalinie . Opracowano wydajne narzędzia obliczeniowe do analizy aDNA patogenów i mikroorganizmów w małej (QIIME) i dużej skali (FALCON ).

Wyniki

Podejmując środki zapobiegawcze w swojej procedurze przeciwko takiemu skażeniu, w badaniu z 2012 r. przeanalizowano próbki kości grupy neandertalskiej w jaskini El Sidrón, znajdując nowy wgląd w potencjalne pokrewieństwo i różnorodność genetyczną z aDNA. W listopadzie 2015 roku, naukowcy zgłaszane znalezienie 110000-letniego zębów zawierających DNA z człowiek z denisowej jaskini hominin , an wymarłych gatunków z człowiekiem w rodzaju Homo .

Badania dodały nową złożoność do zaludnienia Eurazji. Ujawniła również nowe informacje na temat powiązań między przodkami Azji Środkowej a rdzenną ludnością obu Ameryk. W Afryce starsze DNA ulega szybkiej degradacji ze względu na cieplejszy klimat tropikalny, chociaż we wrześniu 2017 r. odnotowano próbki starożytnego DNA, mające nawet 8100 lat.

Co więcej, starożytne DNA pomogło naukowcom oszacować dywergencję współczesnego człowieka. Dzięki zsekwencjonowaniu afrykańskich genomów trzech zbieraczy z epoki kamienia (w wieku 2000 lat) i czterech rolników z epoki żelaza (w wieku od 300 do 500 lat), Schlebusch i współpracownicy byli w stanie przesunąć datę najwcześniejszej rozbieżności między populacjami ludzkimi do 350 000 do 260 000 lat temu.

Według stanu na 2021 r. najstarsze całkowicie zrekonstruowane ludzkie genomy mają około 45 000 lat . Takie dane genetyczne dostarczają wglądu w historię migracji i genetyki – np. Europy – w tym o krzyżowaniu się ludzi archaicznych i współczesnych, jak powszechna domieszka pomiędzy pierwotnymi europejskimi współczesnymi ludźmi i neandertalczykami.

Naukowcy specjalizujący się w starożytnym DNA

Zobacz też

Bibliografia

Dalsza lektura

Zewnętrzne linki