Białko fuzyjne - Fusion protein
Białka fuzyjne lub chimerycznym (Ki-miR-ik) białka (dosłownie, wykonane z części z różnych źródeł), są białkami, utworzone przez połączenie dwóch lub większej liczby genów , które oryginalnie zakodowanych dla poszczególnych białek. Translacja tego genu fuzyjnego skutkuje powstaniem jednego lub wielu polipeptydów o właściwościach funkcjonalnych pochodzących z każdego z oryginalnych białek. Rekombinowane białka fuzyjne są tworzone sztucznie za pomocą technologii rekombinacji DNA do wykorzystania w badaniach biologicznych lub terapeutycznych . Chimeryczne lub chimerowe zwykle oznaczają białka hybrydowe zbudowane z polipeptydów o różnych funkcjach lub wzorach fizykochemicznych. Zmutowane białka chimeryczne występują naturalnie, gdy złożona mutacja , taka jak translokacja chromosomowa , duplikacja tandemowa lub retrotranspozycja, tworzy nową sekwencję kodującą zawierającą części sekwencji kodujących z dwóch różnych genów. Naturalnie występujące białka fuzyjne są powszechnie spotykane w komórkach nowotworowych, gdzie mogą funkcjonować jako onkoproteiny . Białko fuzyjne BCR-Abl jest dobrze znanym przykładem białka fuzyjnego onkogenu, i jest uważana za główny onkogenne kierowca przewlekłej białaczki szpikowej .
Funkcje
Niektóre białka fuzyjne łączą całe peptydy i dlatego zawierają wszystkie funkcjonalne domeny oryginalnych białek. Jednak inne białka fuzyjne, zwłaszcza te, które występują naturalnie, łączą tylko części sekwencji kodujących, a zatem nie zachowują pierwotnych funkcji genów rodzicielskich, które je utworzyły.
Wiele fuzji całych genów jest w pełni funkcjonalnych i nadal może działać w celu zastąpienia oryginalnych peptydów. Niektórzy jednak doświadczają interakcji między dwoma białkami, które mogą modyfikować ich funkcje. Poza tymi efektami, niektóre fuzje genów mogą powodować zmiany regulacyjne, które zmieniają czas i miejsce działania tych genów. W przypadku częściowych fuzji genów tasowanie różnych miejsc aktywnych i domen wiążących może potencjalnie skutkować powstaniem nowych białek o nowych funkcjach.
Fluorescencyjne tagi białkowe
Fuzja znaczników fluorescencyjnych z białkami w komórce gospodarza jest szeroko popularną techniką stosowaną w eksperymentalnych badaniach nad komórkami i biologią w celu śledzenia interakcji białek w czasie rzeczywistym. Pierwszy znacznik fluorescencyjny, białko zielonej fluorescencji (GFP), został wyizolowany z Aequorea Victoria i nadal jest często stosowany we współczesnych badaniach. Nowsze ustalenia obejmują fotokonwertowalne białka fluorescencyjne (PCFP), które po raz pierwszy wyizolowano z Anthozoa . Najczęściej stosowanym PCFP jest znacznik fluorescencyjny Kaede , ale opracowanie Kikume zielono-czerwonego (KikGR) w 2005 r. zapewnia jaśniejszy sygnał i wydajniejszą fotokonwersję. Zaletą stosowania znaczników fluorescencyjnych PCFP jest możliwość śledzenia interakcji nakładających się szlaków biochemicznych w czasie rzeczywistym. Znacznik zmieni kolor z zielonego na czerwony, gdy białko osiągnie interesujący punkt na ścieżce, a białko o innym kolorze może być monitorowane przez czas trwania szlaku. Ta technika jest szczególnie przydatna podczas badania szlaków recyklingu receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR). Losy regenerowanych receptorów białka G mogą być albo wysłane do błony plazmatycznej w celu recyklingu, oznaczone zielonym znacznikiem fluorescencyjnym, albo mogą być wysłane do lizosomu w celu degradacji, oznaczonego czerwonym znacznikiem fluorescencyjnym.
Chimeryczne leki białkowe
Celem tworzenia białek fuzyjnych w rozwoju leków jest nadanie właściwości z każdego z białek „macierzystych” powstałemu białku chimerycznemu. Obecnie do użytku medycznego dostępnych jest kilka chimerycznych leków białkowych .
Wiele chimerycznych leków białkowych to przeciwciała monoklonalne, których specyficzność względem cząsteczki docelowej została opracowana przy użyciu myszy i stąd początkowo były to przeciwciała „mysie”. Jako białka inne niż ludzkie, mysie przeciwciała mają tendencję do wywoływania reakcji immunologicznej po podaniu ludziom. Proces chimeryzacji obejmuje inżynierię zastąpienia segmentów cząsteczki przeciwciała, które odróżniają ją od przeciwciała ludzkiego. Na przykład, można wprowadzić ludzkie domeny stałe , eliminując w ten sposób większość potencjalnie immunogennych części leku bez zmiany jego specyficzności względem zamierzonego celu terapeutycznego. Nomenklatura przeciwciał wskazuje ten typ modyfikacji przez wstawienie -xi- do niezastrzeżonej nazwy (np. abci- xi -mab ). Jeśli części domen zmiennych są również zastąpione częściami ludzkimi, uzyskuje się humanizowane przeciwciała. Chociaż nie jest koncepcyjnie odróżnieniu od chimer tego typu jest pokazana z użyciem -zu- takich jak dacli- zu -mab . Zobacz listę przeciwciał monoklonalnych, aby uzyskać więcej przykładów.
Oprócz przeciwciał chimerycznych i humanizowanych istnieją inne cele farmaceutyczne do tworzenia konstruktów chimerycznych. Etanercept , na przykład, jest TNFa bloker utworzony poprzez połączenie z receptorem czynnika martwicy nowotworów (TNFR) z G immunoglobuliny 1 segmentu Fc . TNFR zapewnia swoistość dla celu leku i uważa się, że segment Fc przeciwciała zwiększa stabilność i dostarczalność leku. Dodatkowe białka chimeryczne wykorzystywane do zastosowań terapeutycznych obejmują:
- Aflibercept : ludzkie rekombinowane białko , które pomaga w leczeniu opornego na oksaliplatynę raka jelita grubego z przerzutami , neowaskularnego zwyrodnienia plamki żółtej i obrzęku plamki .
- Rilonacept : zmniejsza stan zapalny poprzez zapobieganie aktywacji receptorów IL-1 w leczeniu okresowych zespołów związanych z kriopiryną (CAPS).
- Alefacept : Regulowane odpowiedzi komórek T poprzez selektywne ukierunkowanie na efektorowe komórki T pamięci w leczeniu łuszczycy pospolitej .
- Romiplostim : peptibody, który leczy małopłytkowość immunologiczną .
- Abatacept / Belatacept : zakłóca kostymulację komórek T w leczeniu chorób autoimmunologicznych , takich jak reumatoidalne zapalenie stawów , łuszczycowe zapalenie stawów i łuszczyca .
- Denileukin- diftitox : leczy chłoniaka skóry .
Technologia rekombinowana
Rekombinowane białko fuzyjne jest białkiem utworzony przez inżynierię genetyczną genu fuzyjnego. Zwykle obejmuje to usunięcie kodonu stop z sekwencji cDNA kodującej pierwsze białko, a następnie dołączenie sekwencji cDNA drugiego białka w ramce odczytu przez ligację lub wydłużanie zachodzące na siebie metodą PCR . Ta sekwencja DNA będzie następnie wyrażana przez komórkę jako pojedyncze białko. Białko można zaprojektować tak, aby zawierało pełną sekwencję obu oryginalnych białek lub tylko część jednego z nich.
Jeśli te dwie jednostki są białkami, często dodaje się również peptydy łącznikowe (lub „przerywnikowe”), co zwiększa prawdopodobieństwo, że białka fałdują się niezależnie i zachowują się zgodnie z oczekiwaniami. Zwłaszcza w przypadku, gdy łączniki umożliwiają oczyszczanie białka , łączniki w fuzjach białek lub peptydów są czasami konstruowane z miejscami cięcia dla proteaz lub środków chemicznych, które umożliwiają uwolnienie dwóch oddzielnych białek. Technika ta jest często stosowana do identyfikacji i oczyszczania białek poprzez fuzję białka GST , peptydu FLAG lub peptydu heksa-his (6xHis-tag), które można wyizolować za pomocą chromatografii powinowactwa z żywicami niklowymi lub kobaltowymi. Di- lub multimeryczne białka chimeryczne można wytwarzać poprzez inżynierię genetyczną przez fuzję z oryginalnymi białkami domen peptydowych, które indukują di- lub multimeryzację sztucznych białek (np. streptawidyna lub suwaki leucynowe ). Białka fuzyjne można również wytwarzać z dołączonymi do nich toksynami lub przeciwciałami w celu badania rozwoju choroby. Hydrogenazę promotor P SH badano budowę ap SH promoter- GFP fuzji stosując białko fluorescencyjne (zielony GFP) genu reportera .
Funkcjonalność rekombinowana
Nowatorskie technologie rekombinacji umożliwiły ulepszenie projektowania białek fuzyjnych do zastosowania w dziedzinach tak różnorodnych, jak biodetekcja, przemysł papierniczy i spożywczy oraz biofarmaceutyki. Ostatnie ulepszenia obejmowały fuzję pojedynczych peptydów lub fragmentów białek z regionami istniejących białek, takimi jak końce N i C , i wiadomo, że zwiększają następujące właściwości:
- Wydajność katalityczna : Fuzja niektórych peptydów pozwala na większą wydajność katalityczną poprzez zmianę trzeciorzędowej i czwartorzędowej struktury białka docelowego.
- Rozpuszczalność : Częstym wyzwaniem w projektowaniu białek fuzyjnych jest kwestia nierozpuszczalności nowo zsyntetyzowanych białek fuzyjnych w rekombinowanym gospodarzu, co prowadzi do nadmiernej agregacji białka docelowego w komórce. Można dodać chaperony molekularne, które są w stanie pomóc w fałdowaniu białka, tym samym lepiej segregując oddziaływania hydrofobowe i hydrofilowe w substancji rozpuszczonej w celu zwiększenia rozpuszczalności białka.
- Termostabilność : Pojedyncze peptydy lub fragmenty białka są zazwyczaj dodawane w celu zmniejszenia elastyczności końca N lub C białka docelowego, co wzmacnia termostabilność i stabilizuje zakres pH .
- Aktywność enzymatyczna: fuzja, która obejmuje wprowadzenie wiązań wodorowych, może być wykorzystana do rozszerzenia ogólnej aktywności enzymatycznej.
- Poziomy ekspresji: dodanie licznych fragmentów fuzyjnych, takich jak białko wiążące maltozę (MBP) lub mała cząsteczka podobna do ubikwityny ( SUMO ), służy do zwiększenia ekspresji enzymu i wydzielania białka docelowego.
- Immobilizacja: Syntaza PHA, enzym, który umożliwia immobilizację białek będących przedmiotem zainteresowania, jest ważnym znacznikiem fuzyjnym w badaniach przemysłowych.
- Jakość kryształów: jakość kryształów można poprawić, dodając wiązania kowalencyjne między białkami, pomagając w technikach określania struktury.
Projekt rekombinowanego białka
Najwcześniejsze zastosowania projektowania rekombinowanych białek można udokumentować w zastosowaniu pojedynczych znaczników peptydowych do oczyszczania białek w chromatografii powinowactwa . Od tego czasu opracowano różnorodne techniki projektowania białek fuzyjnych do zastosowań tak różnorodnych, jak znaczniki fluorescencyjne białek po rekombinowane leki na bazie białek fuzyjnych. Trzy powszechnie stosowane techniki projektowania obejmują fuzję tandemową, wstawianie domen i koniugację potranslacyjną.
Fuzja tandemowa
Białka będące przedmiotem zainteresowania są po prostu połączone od końca do końca poprzez fuzję końców N lub C między białkami. Zapewnia to elastyczną strukturę mostka, która zapewnia wystarczającą przestrzeń między partnerami fuzyjnymi, aby zapewnić prawidłowe składanie . Jednakże końce N lub C peptydu są często kluczowymi składnikami w uzyskiwaniu pożądanego wzoru fałdowania rekombinowanego białka, co sprawia, że proste łączenie domen typu koniec do końca jest w tym przypadku nieskuteczne. Z tego powodu często potrzebny jest linker białkowy do utrzymania funkcjonalności domen białkowych będących przedmiotem zainteresowania.
Wstawianie domeny
Technika ta obejmuje fuzję kolejnych domen białkowych poprzez kodowanie pożądanych struktur w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym, ale czasami może wymagać wstawienia domeny w innej domenie. Technika ta jest zazwyczaj uważana za trudniejszą do przeprowadzenia niż fuzja tandemowa, ze względu na trudności w znalezieniu odpowiedniego miejsca ligacji w genie będącym przedmiotem zainteresowania.
Koniugacja potranslacyjna
Ta technika łączy domeny białkowe po translacji rybosomalnej białek będących przedmiotem zainteresowania, w przeciwieństwie do fuzji genetycznej przed translacją stosowaną w innych technologiach rekombinacji.
Linkery białkowe
Łączniki białkowe wspomagają projektowanie białek fuzyjnych, zapewniając odpowiednie odstępy między domenami, wspierając prawidłowe fałdowanie białka w przypadku, gdy interakcje N lub C końca są kluczowe dla fałdowania. Zazwyczaj łączniki białkowe umożliwiają ważne interakcje między domenami, wzmacniają stabilność i zmniejszają przeszkodę steryczną, co czyni je preferowanymi do stosowania w projektowaniu białek fuzyjnych, nawet gdy końce N i C mogą być połączone. Trzy główne typy łączników są elastyczne, sztywne i rozszczepialne in vivo.
- Elastyczne łączniki mogą składać się z wielu małych reszt glicyny , co daje im zdolność zwijania się w dynamiczny, przystosowujący się kształt.
- Sztywne łączniki mogą być utworzone z dużych, cyklicznych reszt proliny , co może być pomocne, gdy trzeba zachować wysoce specyficzne odstępy między domenami.
- Łączniki rozszczepialne in vivo są unikalne, ponieważ są zaprojektowane tak, aby umożliwić uwalnianie jednej lub większej liczby połączonych domen w określonych warunkach reakcji, takich jak określony gradient pH lub w kontakcie z inną biocząsteczką w komórce.
Naturalne występowanie
Naturalnie występujące geny fuzyjne są najczęściej tworzone, gdy translokacja chromosomowa zastępuje końcowe eksony jednego genu nienaruszonymi eksonami drugiego genu. W ten sposób powstaje pojedynczy gen, który może podlegać transkrypcji , splicingowi i translacji w celu wytworzenia funkcjonalnego białka fuzyjnego. Wiele ważnych rak -promoting onkogenów są geny fuzyjne wytwarzane w ten sposób.
Przykłady obejmują:
Przeciwciała są białkami fuzyjnymi wytwarzanymi przez rekombinację V(D)J .
Istnieją również rzadkie przykłady naturalnie występujących polipeptydów, które wydają się być fuzją dwóch jasno określonych modułów, w których każdy moduł wykazuje swoją charakterystyczną aktywność lub funkcję, niezależnie od drugiego. Dwa główne przykłady to: podwójna chimera PP2C u Plasmodium falciparum (pasożyta malarii), w której każdy moduł PP2C wykazuje aktywność enzymatyczną fosfatazy białkowej 2C, oraz immunofiliny dwurodzinne, które występują w wielu organizmach jednokomórkowych (takich jak pierwotniaki pasożytnicze i Flavobacteria). ) i zawierają pełnej długości moduły opiekuńcze cyklofiliny i FKBP. Ewolucyjne pochodzenie takiej chimery pozostaje niejasne.
Zobacz też
Bibliografia
Zewnętrzne linki
|
Zasoby biblioteczne dotyczące białka Fusion |
- Mutant+Chimeric+Białka w Narodowej Bibliotece Medycznej USA Medical Subject Headings (MeSH)
- ChiPPI : Interakcja białko-białko serwera białek chimerycznych.