Kriokonserwacja - Cryopreservation

Probówki z próbkami biologicznymi umieszczone w ciekłym azocie.
Próbki zakonserwowane kriogenicznie wyjęte z dewara z ciekłym azotem .

Kriokonserwacja lub kriokonserwacja to proces, w którym organelle , komórki , tkanki , macierz zewnątrzkomórkowa , narządy lub wszelkie inne konstrukcje biologiczne podatne na uszkodzenia spowodowane nieuregulowaną kinetyką chemiczną są konserwowane przez schłodzenie do bardzo niskich temperatur (zazwyczaj -80 °C przy użyciu stały dwutlenek węgla lub -196 ° C przy użyciu ciekłego azotu ). W dostatecznie niskich temperaturach, jakakolwiek aktywność enzymatyczna lub chemiczna, która mogłaby spowodować uszkodzenie materiału biologicznego, o którym mowa, jest skutecznie zatrzymana. Metody kriokonserwacji dążą do osiągnięcia niskich temperatur bez powodowania dodatkowych uszkodzeń spowodowanych tworzeniem się kryształków lodu podczas zamrażania. Tradycyjna kriokonserwacja polega na powlekaniu materiału przeznaczonego do zamrożenia klasą cząsteczek zwanych krioprotektantami . Nowe metody są badane ze względu na nieodłączną toksyczność wielu krioprotektantów. Kriokonserwacja zasobów genetycznych zwierząt ma na celu zachowanie rasy.

Naturalna kriokonserwacja

Niedźwiedzie wodne ( Tardigrada ), mikroskopijne organizmy wielokomórkowe, mogą przetrwać zamarzanie , zastępując większość swojej wewnętrznej wody trehalozą cukrową , zapobiegając jej krystalizacji, która w przeciwnym razie uszkadza błony komórkowe . Podobne efekty mogą osiągnąć mieszaniny substancji rozpuszczonych. Niektóre substancje rozpuszczone, w tym sole, mają tę wadę, że mogą być toksyczne w intensywnych stężeniach. Oprócz niedźwiedzia wodnego żaby drzewne mogą tolerować zamrażanie ich krwi i innych tkanek. Mocznik gromadzi się w tkankach w ramach przygotowań do zimowania, a glikogen wątrobowy jest przekształcany w dużych ilościach w glukozę w odpowiedzi na tworzenie się wewnętrznego lodu. Zarówno mocznik, jak i glukoza działają jako „krioprotektanty”, aby ograniczyć ilość tworzącego się lodu i zmniejszyć osmotyczne kurczenie się komórek. Żaby mogą przetrwać wiele przypadków zamarzania/rozmrażania w okresie zimowym, jeśli zamarznie nie więcej niż około 65% całkowitej wody w organizmie. Badania nad zjawiskiem „zamrażania żab” przeprowadził przede wszystkim kanadyjski badacz, dr Kenneth B. Storey .

Tolerancja na mróz , w której organizmy przeżywają zimę zamrażając stałe i zaprzestając funkcji życiowych, znana jest u kilku kręgowców: pięciu gatunków żab ( Rana sylvatica , Pseudacris triseriata , Hyla crucifer , Hyla versicolor , Hyla chrysoscelis ), jeden z salamandr ( Salamandrella ) keyserlingii ), jednego z węży ( Thamnophis sirtalis ) i trzech żółwi ( Chrysemys picta , Terrapene carolina , Terrapene ornata ). Żółwie jaszczurowate Chelydra serpentina i jaszczurki ścienne Podarcis muralis również przeżywają nominalne zamarzanie, ale nie ustalono, aby przystosowało się do zimowania. W przypadku Rana sylvatica jednym kriokonserwantem jest zwykła glukoza, której stężenie wzrasta o około 19 mmol/l przy powolnym chłodzeniu żab.

Historia

Zobacz także: krionika § Historia

Jednym z wczesnych teoretyków kriokonserwacji był James Lovelock . W 1953 zasugerował, że uszkodzenie czerwonych krwinek podczas zamrażania było spowodowane stresem osmotycznym i że zwiększenie stężenia soli w odwadniającej się komórce może ją uszkodzić. W połowie lat pięćdziesiątych eksperymentował z kriokonserwacją gryzoni, stwierdzając, że chomiki można zamrozić z 60% wody w mózgu skrystalizowanej w lód bez żadnych negatywnych skutków; inne narządy okazały się podatne na uszkodzenia.

Krioprezerwację zastosowano na materiałach ludzkich począwszy od 1954 roku z trzema ciążami wynikającymi z inseminacji uprzednio zamrożonych plemników. Plemniki ptactwa zostały poddane kriokonserwacji w 1957 r. przez zespół naukowców w Wielkiej Brytanii kierowany przez Christophera Polge . W 1963 roku Peter Mazur z Oak Ridge National Laboratory w USA wykazał, że można uniknąć śmiercionośnego zamrażania wewnątrzkomórkowego, jeśli chłodzenie było na tyle powolne, aby podczas postępującego zamrażania płynu pozakomórkowego woda mogła opuścić komórkę. Szybkość ta różni się między komórkami o różnej wielkości i przepuszczalności wody: typowa szybkość chłodzenia około 1 °C/minutę jest odpowiednia dla wielu komórek ssaków po traktowaniu krioprotektantami, takimi jak glicerol lub dimetylosulfotlenek, ale szybkość ta nie jest uniwersalnym optimum.

22 kwietnia 1966 roku pierwsze ludzkie ciało zostało zamrożone — chociaż balsamowano je od dwóch miesięcy — umieszczając je w ciekłym azocie i przechowując w temperaturze nieco powyżej zera. Starsza kobieta z Los Angeles, której nazwisko nie jest znane, została wkrótce rozmrożona i pochowana przez krewnych. Pierwszym ludzkim ciałem, które zostało zamrożone z nadzieją na przyszłe przebudzenie, było ciało Jamesa Bedforda , kilka godzin po jego śmierci spowodowanej rakiem w 1967 roku. Bedford jest jedynym pacjentem krionicznym zamrożonym przed 1974 rokiem, który zachował się do dziś.

Temperatura

Zakłada się, że przechowywanie w bardzo niskich temperaturach zapewnia komórkom nieograniczoną żywotność, chociaż rzeczywista żywotność jest raczej trudna do udowodnienia. Naukowcy eksperymentujący z suszonymi nasionami wykazali zauważalną zmienność pogorszenia, gdy próbki były przechowywane w różnych temperaturach – nawet w bardzo niskich temperaturach . Temperatury niższe niż temperatura zeszklenia (Tg) wodnych roztworów poliolu , około -136 °C (137 K; -213°F), wydają się być akceptowane jako zakres, w którym aktywność biologiczna znacznie spada, a -196 ° C (77 K; -321 ° F), temperatura wrzenia ciekłego azotu , jest preferowaną temperaturą do przechowywania ważnych okazów. Podczas gdy lodówki , zamrażarki i superzimne zamrażarki są używane do wielu przedmiotów, generalnie ultrazimny ciekły azot jest niezbędny do pomyślnego zachowania bardziej złożonych struktur biologicznych, aby praktycznie zatrzymać wszelką aktywność biologiczną.

Zagrożenia

Zjawiska, które mogą powodować uszkodzenie komórek podczas kriokonserwacji, występują głównie podczas etapu zamrażania i obejmują efekt rozpuszczenia, tworzenie lodu pozakomórkowego , odwodnienie i tworzenie lodu wewnątrzkomórkowego . Wiele z tych efektów można zredukować za pomocą krioprotektantów . Po zamrożeniu zakonserwowany materiał jest stosunkowo bezpieczny przed dalszymi uszkodzeniami.

Efekty rozwiązania
Ponieważ kryształki lodu rosną w zamarzającej wodzie, substancje rozpuszczone są wykluczane, powodując ich koncentrację w pozostałej ciekłej wodzie. Wysokie stężenia niektórych substancji rozpuszczonych mogą być bardzo szkodliwe.
Tworzenie się lodu pozakomórkowego
Gdy tkanki schładzają się powoli, woda migruje z komórek i tworzy lód w przestrzeni pozakomórkowej. Zbyt dużo lodu zewnątrzkomórkowego może spowodować mechaniczne uszkodzenie błony komórkowej w wyniku zmiażdżenia.
Odwodnienie
Migracja wody, powodująca tworzenie się lodu pozakomórkowego, może również powodować odwodnienie komórek. Związane z tym naprężenia na komórce mogą bezpośrednio spowodować uszkodzenie.
Tworzenie się lodu wewnątrzkomórkowego
Podczas gdy niektóre organizmy i tkanki mogą tolerować pewien lód zewnątrzkomórkowy, każdy znaczący lód wewnątrzkomórkowy jest prawie zawsze śmiertelny dla komórek.

Główne metody zapobiegania zagrożeniom

Główne techniki zapobiegania uszkodzeniom kriokonserwacji to dobrze znane połączenie kontrolowanej szybkości i powolnego zamrażania oraz nowszy proces szybkiego zamrażania znany jako witryfikacja .

Powolne programowalne zamrażanie

Zbiornik ciekłego azotu , służący do zasilania zamrażarki kriogenicznej (do przechowywania próbek laboratoryjnych w temperaturze ok. -150 °C)

Zamrażanie o kontrolowanym tempie i powolne , znane również jako powolne programowalne zamrażanie (SPF) , to zestaw dobrze znanych technik opracowanych na początku lat 70., które umożliwiły pierwsze zamrożone zarodki ludzkie Zoe Leyland w 1984 r. Od tego czasu maszyny zamrażające próbki biologiczne przy użyciu programowalnych sekwencji lub kontrolowanych szybkości były stosowane na całym świecie w biologii ludzi, zwierząt i komórek – „zamrażanie” próbki, aby lepiej ją zachować do ewentualnego rozmrożenia, zanim zostanie zamrożona lub kriokonserwowana w ciekłym azocie. Takie maszyny są używane do zamrażania oocytów, skóry, produktów krwiopochodnych, zarodków, nasienia, komórek macierzystych i ogólnej konserwacji tkanek w szpitalach, gabinetach weterynaryjnych i laboratoriach badawczych na całym świecie. Na przykład, liczbę żywych urodzeń z zamrożonych embrionów „wolno zamrażanych” szacuje się na około 300 000 do 400 000 lub 20% szacowanych 3 milionów urodzeń z zapłodnienia in vitro ( IVF ).

Można uniknąć śmiercionośnego zamrażania wewnątrzkomórkowego, jeśli chłodzenie jest na tyle powolne, że wystarczająca ilość wody może opuścić komórkę podczas postępującego zamrażania płynu pozakomórkowego. Aby zminimalizować wzrost zewnątrzkomórkowych kryształków lodu i rekrystalizację, biomateriały, takie jak alginiany , polialkohol winylowy lub chitozan, mogą być stosowane do zahamowania wzrostu kryształków lodu wraz z tradycyjnymi krioprotektantami drobnocząsteczkowymi. Szybkość ta różni się między komórkami o różnej wielkości i przepuszczalności wody : typowa szybkość chłodzenia około 1 °C/minutę jest odpowiednia dla wielu komórek ssaków po traktowaniu krioprotektantami, takimi jak glicerol lub dimetylosulfotlenek , ale szybkość ta nie jest uniwersalnym optimum. Szybkość 1 °C na minutę można osiągnąć za pomocą urządzeń takich jak zamrażarka z kontrolowaną szybkością lub przenośny pojemnik do zamrażania na stole.

Kilka niezależnych badań dostarczyło dowodów na to, że zamrożone zarodki przechowywane przy użyciu technik powolnego zamrażania mogą być pod pewnymi względami „lepsze” niż świeże w IVF. Badania wskazują, że stosowanie zamrożonych zarodków i jaj zamiast świeżych zarodków i jaj zmniejsza ryzyko urodzenia martwego dziecka i przedwczesnego porodu, chociaż dokładne powody są nadal badane.

Witryfikacja

Badacze Greg Fahy i William F. Rall pomogli wprowadzić zeszklenie do kriokonserwacji reprodukcyjnej w połowie lat 80. XX wieku. Od 2000 r. naukowcy twierdzą, że witryfikacja zapewnia korzyści kriokonserwacji bez uszkodzeń spowodowanych tworzeniem się kryształków lodu. Sytuacja stała się bardziej złożona wraz z rozwojem inżynierii tkankowej, ponieważ zarówno komórki, jak i biomateriały muszą pozostać wolne od lodu, aby zachować wysoką żywotność i funkcje komórek, integralność konstruktów i strukturę biomateriałów. Witryfikacja konstruktów inżynierii tkankowej została po raz pierwszy opisana przez Lilia Kulehova, która była również pierwszym naukowcem, który dokonał witryfikacji oocytów , co doprowadziło do żywych narodzin w 1999 roku. W przypadku klinicznej kriokonserwacji witryfikacja zazwyczaj wymaga dodania krioprotektantów przed ochłodzeniem. Krioprotektanty to makrocząsteczki dodawane do pożywki zamrażającej w celu ochrony komórek przed szkodliwym wpływem tworzenia się wewnątrzkomórkowych kryształków lodu lub przed działaniem roztworu podczas procesu zamrażania i rozmrażania. Pozwalają na wyższy stopień przeżycia komórek podczas zamrażania, obniżają temperaturę zamarzania, aby chronić błonę komórkową przed uszkodzeniem związanym z zamarzaniem. Krioprotektanty mają wysoką rozpuszczalność, niską toksyczność w wysokich stężeniach, niską masę cząsteczkową i zdolność do interakcji z wodą poprzez wiązania wodorowe.

Zamiast krystalizować , syropowaty roztwór staje się amorficznym lodem — zeszknieje . Zamiast zmiany fazy z cieczy w ciało stałe przez krystalizację, stan amorficzny jest jak „stała ciecz”, a transformacja odbywa się w małym zakresie temperatur opisanym jako temperatura „ zeszklenia ”.

Zeszklenie wody jest wspomagane przez szybkie chłodzenie i można je osiągnąć bez krioprotektantów przez niezwykle szybki spadek temperatury (megakelwiny na sekundę). Stopień wymagany do uzyskania stanu szklistego w czystej wodzie uznano za niemożliwy do 2005 roku.

Dwa warunki zwykle wymagane do umożliwienia zeszklenia to wzrost lepkości i spadek temperatury zamarzania. Wiele substancji rozpuszczonych robi jedno i drugie, ale większe cząsteczki na ogół mają większy wpływ, szczególnie na lepkość. Szybkie chłodzenie sprzyja również zeszkleniu.

W przypadku ustalonych metod kriokonserwacji substancja rozpuszczona musi przenikać przez błonę komórkową, aby osiągnąć zwiększoną lepkość i obniżyć temperaturę zamrażania wewnątrz komórki. Cukry nie przenikają łatwo przez błonę. Te substancje rozpuszczone, takie jak dimetylosulfotlenek , powszechny krioprotektant, są często toksyczne w intensywnym stężeniu. Jeden z trudnych kompromisów zeszklenia kriokonserwacji dotyczy ograniczenia uszkodzeń powodowanych przez sam krioprotektant z powodu toksyczności krioprotektanta. Mieszaniny krioprotektantów i stosowanie blokerów lodu umożliwiły firmie Twenty-First Century Medicine zeszklenie nerki królika do temperatury -135 °C za pomocą zastrzeżonej mieszanki witryfikacyjnej. Po ogrzaniu nerka została z powodzeniem przeszczepiona królikowi, z pełną funkcjonalnością i żywotnością, która była w stanie utrzymać królika bez końca jako jedyna funkcjonująca nerka. W 2000 roku FM-2030 stał się pierwszym człowiekiem, któremu udało się pośmiertnie zeszklić.

Persuflacja

Krew można zastąpić obojętnymi gazami szlachetnymi i/lub ważnymi dla metabolizmu gazami, takimi jak tlen , dzięki czemu narządy mogą szybciej schłodzić się i potrzeba mniej środków przeciw zamarzaniu. Ponieważ obszary tkanki są oddzielone gazem, niewielkie rozszerzenia nie kumulują się, chroniąc w ten sposób przed rozbiciem. Mała firma, Arigos Biomedical, „odzyskała już świńskie serca ze 120 stopni poniżej zera”, chociaż definicja „odzyskanych” nie jest jasna. Ciśnienie 60 atm może pomóc w zwiększeniu szybkości wymiany ciepła. Perfuzja/persuflacja tlenem gazowym może poprawić zachowanie narządów w porównaniu z przechowywaniem w chłodni statycznej lub perfuzją w maszynie hipotermicznej, ponieważ niższa lepkość gazów może pomóc w dotarciu do większej liczby obszarów zakonserwowanych narządów i dostarczaniu większej ilości tlenu na gram tkanki.

Chusteczki do zamrażania

Ogólnie rzecz biorąc, kriokonserwacja jest łatwiejsza w przypadku cienkich próbek i zawieszonych komórek, ponieważ można je szybciej schłodzić, a zatem wymagają mniejszych dawek toksycznych krioprotektantów. Dlatego kriokonserwacja ludzkich wątrób i serc do przechowywania i przeszczepu jest nadal niepraktyczna.

Niemniej jednak, odpowiednie kombinacje krioprotektantów i reżimy chłodzenia i płukania podczas ogrzewania często pozwalają na skuteczną kriokonserwację materiałów biologicznych, w szczególności zawiesin komórek lub cienkich próbek tkanek. Przykłady obejmują:

Zarodki

Główny artykuł: Kriokonserwacja zarodków

Krioprezerwacja zarodków jest stosowana do przechowywania zarodków, np. gdy zapłodnienie in vitro (IVF) doprowadziło do powstania większej liczby zarodków niż jest to obecnie potrzebne.

Odnotowano jedną ciążę i wynikający z niej zdrowy poród z zarodka przechowywanego przez 27 lat, po udanej ciąży zarodka z tej samej partii trzy lata wcześniej. Wiele badań oceniało dzieci urodzone z zamrożonych embrionów lub „mrozów”. Wynik był jednolicie pozytywny, bez wzrostu wad wrodzonych lub nieprawidłowości rozwojowych. Badanie ponad 11 000 kriokonserwowanych ludzkich embrionów nie wykazało znaczącego wpływu czasu przechowywania na przeżycie po rozmrożeniu w cyklach IVF lub dawstwa oocytów, ani w przypadku zarodków zamrożonych w stadium przedjądrza lub cięcia. Dodatkowo, czas przechowywania nie miał żadnego istotnego wpływu na ciążę kliniczną, poronienie, implantację lub wskaźnik żywych urodzeń, czy to z cyklu IVF, czy dawstwa oocytów. To raczej wiek oocytów, odsetek przeżywalności i liczba przeniesionych zarodków są predyktorami wyniku ciąży.

Tkanka jajnika

Główny artykuł: Kriokonserwacja tkanki jajnika

Kriokonserwacja tkanki jajnikowej jest przedmiotem zainteresowania kobiet, które chcą zachować swoje funkcje rozrodcze poza naturalnymi granicami lub których potencjał rozrodczy jest zagrożony terapią nowotworową, na przykład w nowotworach hematologicznych lub raku piersi. Procedura polega na pobraniu części jajnika i powolnym zamrażaniu przed przechowywaniem jej w ciekłym azocie na czas leczenia. Tkanka może być następnie rozmrożona i wszczepiona w pobliżu jajowodu, albo ortotopowo (w naturalnej lokalizacji), albo heterotopowo (na ścianie brzucha), gdzie zaczyna wytwarzać nowe jaja, umożliwiając normalne poczęcie. Tkankę jajnika można również przeszczepić myszom z obniżoną odpornością ( myszy SCID ), aby uniknąć odrzucenia przeszczepu , a tkankę można pobrać później, gdy rozwiną się dojrzałe pęcherzyki.

Oocyty

Główny artykuł: kriokonserwacja oocytów

Kriokonserwacja ludzkich oocytów to nowa technologia polegająca na ekstrakcji, zamrażaniu i przechowywaniu kobiecych komórek jajowych ( oocytów ). Później, gdy jest gotowa do zajścia w ciążę, jajeczka można rozmrozić, zapłodnić i przenieść do macicy jako zarodki . Od 1999 r., kiedy Kuleszowa i współpracownicy donieśli na łamach czasopisma Human Reproduction narodziny pierwszego dziecka z zarodka pochodzącego z zeszklonych, ogrzanych jaj kobiecych, koncepcja ta została rozpoznana i rozpowszechniona. Ten przełom w osiągnięciu witryfikacji oocytów kobiety spowodował istotny postęp w naszej wiedzy i praktyce procesu IVF, ponieważ wskaźnik ciąż klinicznych jest czterokrotnie wyższy po witryfikacji oocytów niż po powolnym zamrażaniu. Witryfikacja oocytów ma kluczowe znaczenie dla zachowania płodności u młodych pacjentów onkologicznych oraz u osób poddawanych zapłodnieniu in vitro, które z powodów religijnych lub etycznych sprzeciwiają się praktyce zamrażania zarodków.

Sperma

Główny artykuł: Kriokonserwacja nasienia

Nasienie po kriokonserwacji może być z powodzeniem stosowane niemal bezterminowo. Najdłuższy odnotowany udany okres przechowywania to 22 lata. Może być stosowany do dawstwa nasienia, gdy biorca chce poddać się leczeniu w innym czasie lub miejscu lub jako środek zachowania płodności u mężczyzn poddawanych wazektomii lub zabiegom, które mogą zagrozić ich płodności, takim jak chemioterapia , radioterapia lub zabieg chirurgiczny.

Tkanka jądra

Główny artykuł: Kriokonserwacja tkanki jąder

Kriokonserwacja niedojrzałych tkanek jąder to rozwijająca się metoda, która ma na celu ułatwienie reprodukcji młodym chłopcom, którzy wymagają terapii gonadotoksycznej. Dane na zwierzętach są obiecujące, ponieważ zdrowe potomstwo uzyskano po przeszczepieniu zamrożonych zawiesin jąder komórkowych lub fragmentów tkanek. Jednak żadna z opcji przywracania płodności z zamrożonej tkanki, tj. przeszczep zawiesiny komórek, przeszczep tkanek i dojrzewanie in vitro (IVM) nie okazała się jak dotąd skuteczna i bezpieczna u ludzi.

Mech

Cztery różne ekotypów z Physcomitrella patens przechowywane w IMSC .

Krioprezerwacja całych mchu roślin , zwłaszcza Physcomitrella patens , został opracowany przez Ralf Reski i współpracowników i jest wykonywana w Międzynarodowym Moss Stock Center . Ten biobank gromadzi, konserwuje i dystrybuuje mutanty mchu i ekotypy mchu .

Mezenchymalne komórki zrębowe (MSC)

MSC, po przetoczeniu natychmiast w ciągu kilku godzin po rozmrożeniu, mogą wykazywać zmniejszoną funkcję lub wykazywać zmniejszoną skuteczność w leczeniu chorób w porównaniu z tymi MSC, które są w fazie logarytmicznej wzrostu komórek (świeże). W rezultacie kriokonserwowane MSC należy przywrócić do fazy logarytmicznej wzrostu komórek w hodowli in vitro, zanim zostaną one podane do badań klinicznych lub terapii eksperymentalnych. Ponowna hodowla MSC pomoże w odzyskaniu sił po szoku, jaki doznają komórki podczas zamrażania i rozmrażania. Nie powiodły się różne badania kliniczne MSC, w których stosowano produkty kriokonserwowane bezpośrednio po rozmrożeniu, w porównaniu z badaniami klinicznymi, w których stosowano świeże MSC.

Konserwacja kultur mikrobiologicznych

Bakterie i grzyby można przechowywać krótkoterminowo (w zależności od miesięcy do około roku) w lodówce, jednak podział komórek i metabolizm nie są całkowicie zatrzymane, a zatem nie jest to optymalna opcja do długoterminowego przechowywania (lata) lub genetycznego przechowywania kultur lub fenotypowo, ponieważ podziały komórkowe mogą prowadzić do mutacji, a podhodowle mogą powodować zmiany fenotypowe. Preferowaną opcją, zależną od gatunku, jest kriokonserwacja. Nicienie to jedyne wielokomórkowe eukarionty, które przetrwały kriokonserwację. Szatilowicz AV, Tchesunov AV, Neretina TV, Grabarnik IP, Gubin SV, Vishnivetskaya TA, Onstott TC, Rivkina EM (maj 2018). „Żywe nicienie z późnego plejstocenu wiecznej zmarzliny nizinnej rzeki Kołymy”. Dokłady Nauk Biologicznych . 480 (1): 100–102. doi : 10.1134/S0012496618030079 . PMID  30009350 . S2CID  49743808 .

Grzyby

Grzyby, zwłaszcza zygomycetes, ascomycetes i wyższe podstawczaki, niezależnie od sporulacji, mogą być przechowywane w ciekłym azocie lub głęboko zamrożone. Kriokonserwacja jest metodą charakterystyczną dla grzybów, które nie zarodnikują (w przeciwnym razie można zastosować inne metody konserwacji zarodników przy niższych kosztach i z łatwością), zarodnikują, ale mają delikatne zarodniki (duże lub wrażliwe na liofilizację), są patogenne (niebezpieczne dla zachowania aktywności metabolicznej grzyba) lub mają być wykorzystane do zasobów genetycznych (najlepiej, aby miały identyczny skład jak depozyt pierwotny). Podobnie jak w przypadku wielu innych organizmów, stosuje się krioprotektanty, takie jak DMSO lub glicerol (np. grzyby nitkowate 10% glicerol lub drożdże 20% glicerol). Różnice między wyborem krioprotektantów zależą od gatunku (lub klasy), ale generalnie dla grzybów penetrujących krioprotektanty, takie jak DMSO, glicerol lub glikol polietylenowy są najbardziej skuteczne (inne niepenetrujące to cukry mannitol, sorbitol, dekstran itp.). Nie zaleca się powtarzania zamrażania-rozmrażania, ponieważ może to zmniejszyć żywotność. Zalecane są zapasowe zamrażarki lub miejsca przechowywania ciekłego azotu. Poniżej podsumowano wiele protokołów zamrażania (w każdym z nich używa się polipropylenowych krioprobówek z zakrętką):

Bakteria

Wiele powszechnie stosowanych do hodowli szczepów laboratoryjnych jest głęboko mrożonych w celu zachowania stabilnych genetycznie i fenotypowo, długoterminowych stad. Podhodowywanie i przedłużone przechowywanie próbek w lodówce może prowadzić do utraty plazmidu(ów) lub mutacji. Wspólne końcowe zawartości procentowe glicerolu wynoszą 15, 20 i 25. Ze świeżej płytki hodowlanej wybiera się jedną interesującą kolonię i wykonuje się hodowlę płynną. Z hodowli płynnej pożywkę miesza się bezpośrednio z równą ilością glicerolu; kolonię należy sprawdzić pod kątem wszelkich defektów, takich jak mutacje. Wszystkie antybiotyki należy wypłukać z hodowli przed długotrwałym przechowywaniem. Metody różnią się, ale mieszanie można przeprowadzić delikatnie przez odwrócenie lub szybko przez wirowanie, a chłodzenie może się różnić, umieszczając kriotubę bezpośrednio w temperaturze od -50 do -95°C, zamrażając szokowo w ciekłym azocie lub stopniowo schładzając, a następnie przechowując w temperaturze -80°C C lub chłodniej (ciekły azot lub para ciekłego azotu). Odzyskiwanie bakterii może się również różnić, a mianowicie, jeśli kulki są przechowywane w probówce, wówczas kilka kulek można wykorzystać do posiewu lub zamrożony wywar można zeskrobać za pomocą ezy, a następnie wysiać, ponieważ potrzebna jest tylko niewielka ilość materiału w całej probówce nigdy nie należy całkowicie rozmrażać i należy unikać wielokrotnego zamrażania-rozmrażania. Odzyskiwanie 100% nie jest możliwe bez względu na metodologię.

Tolerancja zamrażania u zwierząt

Robaki

Mikroskopijne glebowych nicień glisty Panagrolaimus detritophagus i parvus Plectus są organizmy eukariotyczne tylko, że okazały się być opłacalne po długotrwałej kriokonserwacji do tej pory. W tym przypadku konserwacja była naturalna, a nie sztuczna, ze względu na wieczną zmarzlinę .

Kręgowce

Wykazano, że kilka gatunków zwierząt, w tym ryby, płazy i gady, toleruje zamrażanie. Gatunki te obejmują co najmniej cztery gatunki żab ( Pseudacris crucifer , Hyla versicolor , Pseudacris triseriata , Lithobates sylvaticus ) oraz kilka gatunków żółwi ( Terrapene carolina , pisklę Chrysemys picta ) , jaszczurki i węże mają rozwiniętą tolerancję na zamrażanie . Podczas gdy niektóre żaby hibernują pod ziemią lub w wodzie, temperatura ciała wciąż spada do -5 do -7 ° C, powodując zamarznięcie. Żaba drewna (lithobates sylvaticus) wytrzymuje wielokrotnego zamrażania, w którym około 65% jego płynie pozakomórkowym, przekształca się w lód.

Zobacz też

Bibliografia

Dalsza lektura