Embrionalna komórka macierzysta - Embryonic stem cell

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste w hodowli komórkowej
Pluripotencjalne: embrionalne komórki macierzyste są w stanie rozwinąć się w dowolny typ komórki, z wyjątkiem komórek łożyska. Tylko embrionalne komórki macierzyste morulitotipotencjalne : zdolne do przekształcenia się w dowolny typ komórki, w tym komórki łożyska.

Embrionalne komórki macierzyste ( ES komórki lub RSG ) są pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące z wewnętrznej masy komórkowej z blastocysty , wczesnym stadium wstępnie implantacji zarodka . Zarodki ludzkie osiągają stadium blastocysty 4–5 dni po zapłodnieniu , w którym to czasie składają się z 50–150 komórek. Izolowanie embryoblast lub wewnętrznej masy komórkowej (ICM) wyniki w niszczeniu blastocysty, proces który podnosi kwestie etyczne , w tym, czy zarodki na etapie pre-implantacji mają te same względy moralne jako zarodki w stadium po implantacji rozwój.

Naukowcy koncentrują się obecnie na terapeutycznym potencjale embrionalnych komórek macierzystych, a ich zastosowanie kliniczne jest celem wielu laboratoriów. Potencjalne zastosowania obejmują leczenie cukrzycy i chorób serca . Komórki są badane pod kątem zastosowania jako terapii klinicznych, modeli zaburzeń genetycznych i naprawy komórkowej/DNA. Zgłaszano jednak również niekorzystne skutki w badaniach i procesach klinicznych, takie jak nowotwory i niepożądane odpowiedzi immunologiczne .

Nieruchomości

Transkryptom embrionalnych komórek macierzystych

Embrionalne komórki macierzyste (ESC), pochodzące z stadium blastocysty wczesnych zarodków ssaków, wyróżniają się zdolnością do różnicowania się w dowolny typ komórek embrionalnych oraz zdolnością do samoodnawiania się. To właśnie te cechy sprawiają, że są cenne w dziedzinie naukowej i medycznej. ESC mają prawidłowy kariotyp , utrzymują wysoką aktywność telomerazy i wykazują niezwykły długoterminowy potencjał proliferacyjny .

pluripotencjalny

Embrionalne komórki macierzyste wewnętrznej masy komórkowej są pluripotencjalne , co oznacza, że ​​są w stanie różnicować się w celu wygenerowania prymitywnej ektodermy, która ostatecznie różnicuje się podczas gastrulacji we wszystkie pochodne trzech podstawowych listków zarodkowych : ektodermy , endodermy i mezodermy . Te listki zarodkowe generują każdy z ponad 220 typów komórek w ciele dorosłego człowieka. Po dostarczeniu odpowiednich sygnałów ESC początkowo tworzą komórki prekursorowe, które następnie różnicują się w pożądane typy komórek. Pluripotencja odróżnia embrionalne komórki macierzyste od dorosłych komórek macierzystych , które są multipotencjalne i mogą wytwarzać tylko ograniczoną liczbę typów komórek.

Samoodnawianie i naprawa konstrukcji

W określonych warunkach embrionalne komórki macierzyste są zdolne do samoodnawiania się w nieskończoność w niezróżnicowanym stanie. Warunki samoodnowy muszą zapobiegać zlepianiu się komórek i utrzymywać środowisko, które wspiera stan niewyspecjalizowany. Zazwyczaj odbywa się to w laboratorium z pożywką zawierającą surowicę i czynnik hamujący białaczkę lub suplementy pożywek bez surowicy z dwoma lekami hamującymi („2i”), inhibitorem MEK PD03259010 i inhibitorem GSK-3 CHIR99021.

Wzrost

ESC dzielą się bardzo często ze względu na skróconą fazę G1 w ich cyklu komórkowym . Szybki podział komórek pozwala komórkom na szybki wzrost liczby, ale nie rozmiaru, co jest ważne dla wczesnego rozwoju zarodka. W ESC białka cykliny A i cykliny E zaangażowane w przejście G1/S są zawsze wyrażane na wysokim poziomie. Kinazy zależne od cyklin, takie jak CDK2, które promują progresję cyklu komórkowego, są nadaktywne, częściowo z powodu regulacji w dół ich inhibitorów. Białka siatkówczaka, które hamują czynnik transkrypcyjny E2F do momentu, gdy komórka jest gotowa do wejścia w fazę S, ulegają hiperfosforylacji i inaktywacji w ESC, co prowadzi do ciągłej ekspresji genów proliferacji. Zmiany te powodują przyspieszone cykle podziału komórek. Chociaż wysokie poziomy ekspresji białek proproliferacyjnych i skrócona faza G1 zostały powiązane z utrzymaniem pluripotencji, ESC hodowane w warunkach 2i bez surowicy wykazują ekspresję hipofosforylowanych aktywnych białek siatkówczaka i mają wydłużoną fazę G1. Pomimo tej różnicy w cyklu komórkowym w porównaniu z ESC hodowanymi w pożywce zawierającej surowicę, komórki te mają podobne cechy pluripotencjalne. Czynniki pluripotencji Oct4 i Nanog odgrywają rolę w regulacji transkrypcyjnej cyklu komórkowego ESC.

Zastosowania

Ze względu na ich plastyczność i potencjalnie nieograniczoną zdolność do samoodnowy, terapie zarodkowymi komórkami macierzystymi zostały zaproponowane w medycynie regeneracyjnej i wymianie tkanek po urazie lub chorobie. Pluripotencjalne komórki macierzyste okazały się obiecujące w leczeniu wielu różnych schorzeń, w tym między innymi: urazów rdzenia kręgowego , zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem , cukrzycy , zaburzeń neurodegeneracyjnych (takich jak choroba Parkinsona ), AIDS itp. medycyna regeneracyjna, embrionalne komórki macierzyste stanowią możliwe alternatywne źródło tkanek/narządów, które służy jako możliwe rozwiązanie dylematu niedoboru dawców. Istnieją jednak pewne kontrowersje etyczne wokół tego (patrz sekcja Debata etyczna poniżej). Oprócz tych zastosowań, ESC mogą być również wykorzystywane do badań nad wczesnym rozwojem człowieka, niektórymi chorobami genetycznymi i testami toksykologicznymi in vitro .

Wykorzystanie

Zgodnie z artykułem w PNAS z 2002 roku , „Ludzkie embrionalne komórki macierzyste mają potencjał do różnicowania się w różne typy komórek, a zatem mogą być przydatne jako źródło komórek do przeszczepów lub inżynierii tkankowej”.

Inżynieria tkankowa

W inżynierii tkankowej niedawno odkryto i wiadomo, że zastosowanie komórek macierzystych ma duże znaczenie. Aby skutecznie zaprojektować tkankę, użyte komórki muszą być zdolne do wykonywania określonych funkcji biologicznych, takich jak wydzielanie cytokin, molekuły sygnalizacyjne, interakcje z sąsiednimi komórkami i wytwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej w prawidłowej organizacji. Komórki macierzyste wykazują te specyficzne funkcje biologiczne oraz zdolność do samoodnawiania się i różnicowania w jeden lub więcej typów wyspecjalizowanych komórek. Embrionalne komórki macierzyste są jednym z aktualnych źródeł rozważanych do wykorzystania w inżynierii tkankowej. Wykorzystanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych otworzyło wiele nowych możliwości w inżynierii tkankowej, jednak istnieje wiele przeszkód, które należy poczynić, zanim będzie można w ogóle wykorzystać ludzkie embrionalne komórki macierzyste. Istnieje teoria, że ​​jeśli embrionalne komórki macierzyste można zmienić tak, aby nie wywoływały odpowiedzi immunologicznej po wszczepieniu pacjentowi, byłby to rewolucyjny krok w inżynierii tkankowej.

Ciała embrionalne 24 godziny po uformowaniu.

Jednak embrionalne komórki macierzyste nie ograniczają się do inżynierii komórkowej/tkankowej.

Terapie wymiany komórek

Obecne badania skupiają się na różnicowaniu ESC na różne typy komórek do ostatecznego wykorzystania jako terapie zastępowania komórek (CRT). Niektóre z typów komórek, które mają lub są obecnie opracowywane, obejmują kardiomiocyty (CM), neurony , hepatocyty , komórki szpiku kostnego, komórki wysepek i komórki śródbłonka . Jednak wyprowadzenie tego typu komórek z ESC nie jest pozbawione przeszkód, dlatego obecne badania koncentrują się na pokonaniu tych barier. Na przykład trwają badania mające na celu rozróżnienie ESC na CM specyficzne dla tkanek i wyeliminowanie ich niedojrzałych właściwości, które odróżniają je od CM dorosłych.

Potencjał kliniczny

  • Naukowcy zróżnicowali ESC w komórki wytwarzające dopaminę, mając nadzieję, że neurony te będą mogły zostać wykorzystane w leczeniu choroby Parkinsona.
  • ESC zostały zróżnicowane do komórek NK i tkanki kostnej.
  • Trwają badania z udziałem ESC, które mają zapewnić alternatywne leczenie cukrzycy. Na przykład D'Amour i in. byli w stanie różnicować ESC w komórki produkujące insulinę, a naukowcy z Uniwersytetu Harvarda byli w stanie wytworzyć duże ilości komórek beta trzustki z ES.
  • Artykuł opublikowany w European Heart Journal opisuje translacyjny proces generowania komórek progenitorowych pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do wykorzystania w badaniach klinicznych pacjentów z ciężką niewydolnością serca.

Odkrycie narkotyków

Poza tym, że stają się ważną alternatywą dla przeszczepów narządów, ESC są również wykorzystywane w dziedzinie toksykologii oraz jako ekrany komórkowe do odkrywania nowych jednostek chemicznych (NCE), które można opracować jako leki drobnocząsteczkowe. Badania wykazały, że kardiomiocyty pochodzące z ESC są zwalidowane w modelach in vitro do testowania odpowiedzi na leki i przewidywania profili toksyczności. Wykazano, że kardiomiocyty pochodzące z ES reagują na bodźce farmakologiczne, a zatem mogą być wykorzystywane do oceny kardiotoksyczności, jak Torsades de Pointes .

Hepatocyty pochodzące z ESC są również użytecznymi modelami, które można wykorzystać na przedklinicznych etapach odkrywania leków. Jednak rozwój hepatocytów z ESC okazał się trudny, co utrudnia testowanie metabolizmu leków. Dlatego obecne badania skupiają się na ustaleniu w pełni funkcjonalnych hepatocytów pochodzących z ESC o stabilnej aktywności enzymatycznej fazy I i II.

Modele zaburzeń genetycznych

Kilka nowych badań rozpoczęło pracę nad koncepcją modelowania zaburzeń genetycznych za pomocą embrionalnych komórek macierzystych. Modelowanie zaburzeń genetycznych jest czymś, co udało się osiągnąć za pomocą komórek macierzystych poprzez genetyczną manipulację komórkami lub, ostatnio, poprzez wyprowadzenie chorych linii komórkowych zidentyfikowanych przez prenatalną diagnostykę genetyczną (PGD). Takie podejście może bardzo dobrze okazać się przydatne w badaniu zaburzeń, takich jak zespół łamliwego chromosomu X , mukowiscydoza i inne choroby genetyczne, które nie mają wiarygodnego systemu modelowego.

Yury Verlinsky , rosyjsko-amerykański badacz medyczny, który specjalizował się w genetyce zarodków i komórek ( cytologia genetyczna ), opracował metody testowania diagnostyki prenatalnej w celu określenia zaburzeń genetycznych i chromosomalnych półtora miesiąca wcześniej niż standardowa amniopunkcja . Techniki te są obecnie stosowane przez wiele kobiet w ciąży i przyszłych rodziców, zwłaszcza par, które mają historię nieprawidłowości genetycznych lub gdy kobieta ma powyżej 35 lat (gdy ryzyko zaburzeń genetycznych jest wyższe). Ponadto, pozwalając rodzicom na wybór zarodka bez zaburzeń genetycznych, mogą oni uratować życie rodzeństwa, które już cierpiało na podobne zaburzenia i choroby, wykorzystując komórki potomstwa wolnego od choroby.

Naprawa uszkodzeń DNA

Zróżnicowane komórki somatyczne i komórki ES wykorzystują różne strategie radzenia sobie z uszkodzeniami DNA. Na przykład ludzkie fibroblasty napletka, jeden rodzaj komórek somatycznych, wykorzystują niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) , podatny na błędy proces naprawy DNA, jako główny szlak naprawy pęknięć dwuniciowych (DSB) podczas wszystkich etapów cyklu komórkowego. Ze względu na swój podatny na błędy charakter, NHEJ ma tendencję do wytwarzania mutacji w klonalnych potomkach komórki.

Komórki ES stosują inną strategię radzenia sobie z DSB. Ponieważ z komórek ES powstają wszystkie typy komórek organizmu, w tym komórki linii zarodkowej, mutacje powstające w komórkach ES z powodu wadliwej naprawy DNA stanowią poważniejszy problem niż w zróżnicowanych komórkach somatycznych. W związku z tym w komórkach ES potrzebne są solidne mechanizmy do dokładnej naprawy uszkodzeń DNA, a jeśli naprawa się nie powiedzie, do usunięcia komórek z nienaprawionymi uszkodzeniami DNA. Zatem mysie komórki ES głównie wykorzystują naprawę homologiczną (HRR) o wysokiej wierności do naprawy DSB. Ten rodzaj naprawy zależy od interakcji dwóch siostrzanych chromosomów utworzonych podczas fazy S i obecnych razem podczas fazy G2 cyklu komórkowego. HRR może dokładnie naprawić DSB w jednym chromosomie siostrzanym, wykorzystując nienaruszone informacje z drugiego chromosomu siostrzanego. Komórki w fazie G1 cyklu komórkowego (tj. po metafazie/podziale komórki, ale przed następną rundą replikacji) mają tylko jedną kopię każdego chromosomu (tj. nie występują chromosomy siostrzane). Mysie komórki ES nie mają punktu kontrolnego G1 i nie ulegają zatrzymaniu cyklu komórkowego po nabyciu uszkodzenia DNA. Przechodzą raczej zaprogramowaną śmierć komórki (apoptozę) w odpowiedzi na uszkodzenie DNA. Apoptozę można wykorzystać jako bezpieczną strategię usuwania komórek z nienaprawionymi uszkodzeniami DNA w celu uniknięcia mutacji i progresji do raka. Zgodnie z tą strategią, mysie komórki macierzyste ES mają częstotliwość mutacji około 100 razy niższą niż izogeniczne mysie komórki somatyczne.

Badanie kliniczne

W dniu 23 stycznia 2009 r. Faza I badań klinicznych dotyczących przeszczepu oligodendrocytów (rodzaj komórek mózgu i rdzenia kręgowego) pochodzących z ludzkich komórek ES osobom z uszkodzeniem rdzenia kręgowego uzyskała zgodę amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA), oznaczenie Jest to pierwsza na świecie próba na ludziach z komórkami ES na ludziach. Badanie prowadzi do tego awansu naukowego zostało przeprowadzone przez Hansa Keirstead i kolegów na University of California, Irvine i wspierane przez Geron Corporation w Menlo Park, Kalifornia , założona przez Michaela D. Zachodzie , PhD. Poprzednie doświadczenie wykazało poprawę regeneracji lokomotorycznej u szczurów z uszkodzeniem rdzenia kręgowego po 7-dniowym opóźnionym przeszczepie ludzkich komórek ES, które zostały wepchnięte do linii oligodendrocytów. Badanie kliniczne fazy I miało na celu włączenie około ośmiu do dziesięciu paraplegików, którzy doznali obrażeń nie dłużej niż dwa tygodnie przed rozpoczęciem badania, ponieważ komórki muszą zostać wstrzyknięte, zanim będzie mogła powstać tkanka bliznowata. Naukowcy podkreślili, że zastrzyki nie powinny w pełni wyleczyć pacjentów i przywrócić pełną mobilność. Opierając się na wynikach prób na gryzoniach, naukowcy spekulowali, że może nastąpić przywrócenie osłonek mielinowych i zwiększenie mobilności. Ta pierwsza próba została zaprojektowana przede wszystkim w celu sprawdzenia bezpieczeństwa tych procedur i jeśli wszystko pójdzie dobrze, miano nadzieję, że doprowadzi to do przyszłych badań z udziałem osób z cięższą niepełnosprawnością. Badanie zostało wstrzymane w sierpniu 2009 r. z powodu obaw FDA dotyczących niewielkiej liczby mikroskopijnych torbieli znalezionych w kilku leczonych modelach szczurów, ale wstrzymanie zostało zniesione 30 lipca 2010 r.

W październiku 2010 naukowcy zapisali i podali EST pierwszemu pacjentowi w Shepherd Center w Atlancie . Twórcy terapii komórkami macierzystymi, Geron Corporation , oszacowali, że replikacja komórek macierzystych i ocena terapii GRNOPC1 pod kątem sukcesu lub niepowodzenia zajmie kilka miesięcy .

W listopadzie 2011 r. Geron ogłosił, że wstrzymuje badania i rezygnuje z badań nad komórkami macierzystymi z powodów finansowych, ale będzie nadal monitorował obecnych pacjentów i próbował znaleźć partnera, który mógłby kontynuować ich badania. W 2013 r. firma BioTime , kierowana przez dyrektora generalnego dr Michaela D. Westa , nabyła wszystkie aktywa związane z komórkami macierzystymi Gerona, z deklarowanym zamiarem wznowienia badań klinicznych Geron na embrionalnych komórkach macierzystych w celu zbadania uszkodzenia rdzenia kręgowego .

Firma BioTime Asterias Biotherapeutics (NYSE MKT: AST) otrzymała nagrodę Partnerstwa Strategicznego w wysokości 14,3 miliona dolarów przyznaną przez Kalifornijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej (CIRM) za ponowne rozpoczęcie pierwszego na świecie badania klinicznego na ludziach z użyciem embrionalnych komórek macierzystych pod kątem uszkodzenia rdzenia kręgowego. Wspierany przez kalifornijskie fundusze publiczne, CIRM jest największym na świecie fundatorem badań i rozwoju związanych z komórkami macierzystymi.

Nagroda zapewnia fundusze dla Asterias na wznowienie rozwoju klinicznego AST-OPC1 u pacjentów z urazem rdzenia kręgowego oraz na rozszerzenie badań klinicznych rosnących dawek w populacji docelowej przeznaczonej do przyszłych kluczowych badań.

AST-OPC1 to populacja komórek pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC), która zawiera komórki progenitorowe oligodendrocytów (OPC). OPC i ich dojrzałe pochodne zwane oligodendrocytami zapewniają krytyczne wsparcie funkcjonalne dla komórek nerwowych w rdzeniu kręgowym i mózgu. Asterias niedawno przedstawił wyniki badań klinicznych I fazy z niską dawką AST-OPC1 u pacjentów z neurologicznie całkowitym urazem rdzenia kręgowego w odcinku piersiowym. Wyniki wykazały, że AST-OPC1 został z powodzeniem dostarczony do uszkodzonego miejsca rdzenia kręgowego. Pacjenci obserwowani 2–3 lata po podaniu AST-OPC1 nie wykazali żadnych dowodów poważnych zdarzeń niepożądanych związanych z komórkami w szczegółowych badaniach kontrolnych, w tym częstych badaniach neurologicznych i MRI. Monitorowanie immunologiczne osobników przez jeden rok po przeszczepie nie wykazało dowodów na odpowiedź immunologiczną na AST-OPC1 na podstawie przeciwciał lub komórek. U czterech z pięciu badanych seryjne badania MRI wykonane w ciągu 2-3 lat obserwacji wskazują, że mogło wystąpić zmniejszone kawitacja rdzenia kręgowego i że AST-OPC1 mógł mieć pozytywny wpływ na zmniejszenie pogorszenia tkanki rdzenia kręgowego. Nie było nieoczekiwanych zwyrodnień neurologicznych ani poprawy u pięciu pacjentów biorących udział w badaniu, co oceniono w badaniu International Standards for Neurological Classification of Spinal Injury (ISNCSCI).

Grant Partnerstwa Strategicznego III przyznany przez CIRM zapewni finansowanie firmie Asterias na wsparcie następnego badania klinicznego AST-OPC1 u pacjentów z urazem rdzenia kręgowego oraz na prace nad rozwojem produktów firmy Asterias mające na celu udoskonalenie i skalowanie metod produkcji w celu wsparcia badań na późniejszym etapie i ostatecznie komercjalizacja. Finansowanie CIRM będzie uzależnione od zgody FDA na przeprowadzenie próby, zawarcia ostatecznej umowy między Asterias i CIRM oraz ciągłego postępu Asterias w osiąganiu określonych z góry określonych kamieni milowych projektu.

Troska i kontrowersje

Niekorzystne skutki

Głównym problemem związanym z możliwym przeszczepieniem ESC pacjentom w ramach terapii jest ich zdolność do tworzenia guzów, w tym potworniaka. Kwestie bezpieczeństwa skłoniły FDA do wstrzymania pierwszego badania klinicznego ESC, jednak nie zaobserwowano żadnych guzów.

Główną strategią zwiększania bezpieczeństwa ESC do potencjalnego zastosowania klinicznego jest różnicowanie ESC do określonych typów komórek (np. neuronów, mięśni, komórek wątroby), które mają zmniejszoną lub wyeliminowaną zdolność do wywoływania nowotworów. Po zróżnicowaniu komórki poddaje się sortowaniu metodą cytometrii przepływowej w celu dalszego oczyszczenia. Przewiduje się, że ESC są z natury bezpieczniejsze niż komórki IPS stworzone z genetycznie integrujących wektorów wirusowych, ponieważ nie są modyfikowane genetycznie genami, takimi jak c-Myc, które są powiązane z rakiem. Niemniej jednak ESC ekspresjonuje bardzo wysoki poziom genów indukujących iPS i te geny, w tym Myc, są niezbędne dla samoodnowy i pluripotencji ESC, a potencjalne strategie poprawy bezpieczeństwa poprzez wyeliminowanie ekspresji c-Myc prawdopodobnie nie zachowają „łodygi” komórek. Jednakże zidentyfikowano, że N-myc i L-myc indukują komórki iPS zamiast c-myc z podobną wydajnością. Nowsze protokoły indukowania pluripotencji całkowicie omijają te problemy przez zastosowanie nieintegrujących wektorów wirusowych RNA, takich jak wirus sendai lub transfekcja mRNA .

Debata etyczna

Ze względu na charakter badań nad embrionalnymi komórkami macierzystymi pojawia się wiele kontrowersyjnych opinii na ten temat. Ponieważ pobranie embrionalnych komórek macierzystych wiąże się z niszczeniem embrionu, z którego te komórki są uzyskiwane, stan moralny embrionu staje pod znakiem zapytania. Niektórzy twierdzą, że 5-dniowa masa komórek jest zbyt młoda, aby osiągnąć osobowość, lub że embrion, jeśli zostanie oddany z kliniki IVF (z której laboratoria zazwyczaj pozyskują embriony), w przeciwnym razie i tak poszedłby na marnotrawstwo medyczne. Przeciwnicy badań ESC twierdzą, że embrion jest życiem ludzkim, dlatego jego zniszczenie jest morderstwem, a embrion musi być chroniony zgodnie z tym samym poglądem etycznym, co człowiek bardziej rozwinięty.

Historia

  • 1964: Lewis Kleinsmith i G. Barry Pierce Jr. wyizolowali pojedynczy typ komórki z potworniaka , nowotworu znanego obecnie z komórki zarodkowej . Komórki te zostały wyizolowane z potworniaka replikowanego i hodowane w hodowli komórkowej jako komórki macierzyste i są obecnie znane jako komórki raka embrionalnego (EC). Chociaż podobieństwa morfologii i potencjału różnicującego ( pluripotencji ) doprowadziły do ​​wykorzystania komórek EC jako modelu in vitro dla wczesnego rozwoju myszy, komórki EC zawierają mutacje genetyczne i często nieprawidłowe kariotypy, które nagromadziły się podczas rozwoju potworniaka . Te aberracje genetyczne dodatkowo podkreślają potrzebę możliwości hodowli komórek pluripotencjalnych bezpośrednio z wewnętrznej masy komórkowej .
Martin Evans ujawnił nową technikę hodowli mysich zarodków w macicy, aby umożliwić pozyskiwanie komórek ES z tych zarodków.
  • 1981: Embrionalne komórki macierzyste (komórki ES) zostały najpierw niezależnie wyprowadzone z zarodków myszy przez dwie grupy. Martin Evans i Matthew Kaufman z Wydziału Genetyki Uniwersytetu w Cambridge opublikowali po raz pierwszy w lipcu, ujawniając nową technikę hodowli zarodków myszy w macicy, aby umożliwić wzrost liczby komórek, umożliwiając pozyskiwanie komórek ES z tych zarodków . Gail R. Martin z Wydziału Anatomii Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco opublikowała swoją pracę w grudniu i ukuła termin „embrionalna komórka macierzysta”. Pokazała, że ​​embriony można hodować in vitro i że komórki ES mogą pochodzić z tych embrionów.
  • 1989: Mario R. Cappechi, Martin J. Evans i Oliver Smithies publikują swoje badania, które szczegółowo opisują ich izolację i modyfikacje genetyczne embrionalnych komórek macierzystych, tworząc pierwsze „ myszy nokautowe ”. W tworzeniu myszy z nokautem ta publikacja zapewniła naukowcom zupełnie nowy sposób badania chorób.
  • 1998: Zespół z University of Wisconsin, Madison (James A. Thomson, Joseph Itskovitz-Eldor, Sander S. Shapiro, Michelle A. Waknitz, Jennifer J. Swiergiel, Vivienne S. Marshall i Jeffrey M. Jones) publikuje artykuł zatytułowany „Zarodkowe linie komórek macierzystych pochodzące z ludzkich blastocyst”. Naukowcy stojący za tym badaniem nie tylko stworzyli pierwsze embrionalne komórki macierzyste, ale także rozpoznali ich pluripotencję, a także zdolność do samoodnowy. Streszczenie artykułu zwraca uwagę na znaczenie odkrycia w odniesieniu do dziedziny biologii rozwoju i odkrywania leków.
  • 2001: Prezydent George W. Bush zezwala na finansowanie badań federalnych na około 60 — w tym czasie już istniejących — liniach embrionalnych komórek macierzystych. Widząc, że ograniczone linie, na których badania zezwolił Bush, zostały już ustalone, prawo to wspierało badania nad embrionalnymi komórkami macierzystymi, nie podnosząc żadnych kwestii etycznych, które mogłyby się pojawić przy tworzeniu nowych linii w ramach budżetu federalnego.
  • 2006: Japońscy naukowcy Shinya Yamanaka i Kazutoshi Takashi publikują artykuł opisujący indukcję pluripotencjalnych komórek macierzystych z hodowli fibroblastów dorosłych myszy . Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) są ogromnym odkryciem, ponieważ są pozornie identyczne z embrionalnymi komórkami macierzystymi i mogą być używane bez wzbudzania tych samych kontrowersji moralnych.
  • Styczeń 2009: Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) wyraża zgodę na przeprowadzenie przez Geron Corporation I fazy badania leczenia urazów rdzenia kręgowego na bazie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych . Ogłoszenie spotkało się z podekscytowaniem społeczności naukowej, ale także ostrożnością ze strony przeciwników komórek macierzystych. Jednak leczone komórki pochodziły z linii komórkowych zatwierdzonych zgodnie z polityką ESC George'a W. Busha .
  • Marzec 2009: Prezydent Barack Obama podpisuje Zarządzenie 13505, które znosi ograniczenia nałożone przez poprzednią administrację prezydencką na federalne finansowanie ludzkich komórek macierzystych. Umożliwiłoby to krajowym instytutom zdrowia (NIH) zapewnienie finansowania badań nad hESC. Dokument stwierdza również, że NIH musi dostarczyć zrewidowane wytyczne dotyczące finansowania federalnego w ciągu 120 dni od podpisania nakazu.

Techniki i warunki wyprowadzania i kultury

Pochodzenie od ludzi

Zapłodnienie in vitro generuje wiele zarodków. Nadmiar zarodków nie jest wykorzystywany klinicznie lub nie nadaje się do implantacji pacjentowi, dlatego może zostać oddany przez dawcę za zgodą. Ludzkie embrionalne komórki macierzyste mogą pochodzić z tych oddawanych zarodków lub dodatkowo można je również ekstrahować ze sklonowanych zarodków przy użyciu komórki od pacjenta i oddanego jaja. Wewnętrzna masa komórkowa (komórki będące przedmiotem zainteresowania) ze stadium blastocysty zarodka jest oddzielona od trofektodermy, komórek, które różnicowałyby się w tkankę pozazarodkową. Immunochirurgia, proces, w którym przeciwciała są wiązane z trofektodermą i usuwane przez inny roztwór, a także mechaniczne rozwarstwienie w celu uzyskania separacji. Powstałe komórki masy komórek wewnętrznych są umieszczane na komórkach, które dostarczają wsparcia. Komórki wewnętrznej masy komórkowej przyczepiają się i dalej rozszerzają, tworząc ludzką embrionalną linię komórkową, która jest niezróżnicowana. Komórki te są codziennie karmione i enzymatycznie lub mechanicznie oddzielane co cztery do siedmiu dni. Aby nastąpiło różnicowanie, linia ludzkich embrionalnych komórek macierzystych jest usuwana z komórek podporowych w celu wytworzenia ciał embrioidalnych, jest współhodowana z surowicą zawierającą niezbędne sygnały lub jest przeszczepiana na trójwymiarowe rusztowanie.

Pochodzenie od innych zwierząt

Embrionalne komórki macierzyste pochodzą z wewnętrznej masy komórek wczesnego zarodka , które są pobierane od matki-dawcy. Martin Evans i Matthew Kaufman opisali technikę, która opóźnia implantację zarodka, pozwalając na zwiększenie wewnętrznej masy komórek. Proces ten obejmuje usunięcie jajników matki dawcy i podanie jej progesteronu , zmieniając środowisko hormonalne, co powoduje, że zarodki pozostają wolne w macicy. Po 4-6 dniach tej hodowli wewnątrzmacicznej zarodki są zbierane i hodowane w hodowli in vitro, aż wewnętrzna masa komórkowa utworzy „struktury podobne do cylindra jaja”, które są dysocjowane na pojedyncze komórki i umieszczane na fibroblastach traktowanych mitomycyną-c (aby zapobiec mitozie fibroblastów ). Klonalne linie komórkowe są tworzone przez wzrost pojedynczej komórki. Evans i Kaufman wykazali, że komórki wyhodowane z tych kultur mogą tworzyć potworniaki i ciała zarodkowe oraz różnicować się in vitro, co wskazuje na to, że komórki są pluripotencjalne .

Gail Martin inaczej wyprowadziła i hodowała swoje komórki ES. Pobrała zarodki od matki dawcy około 76 godzin po kopulacji i hodowała je przez noc w pożywce zawierającej surowicę. Następnego dnia usunęła wewnętrzną masę komórkową z późnej blastocysty za pomocą mikrochirurgii . Wyekstrahowaną wewnętrzną masę komórkową hodowano na fibroblastach traktowanych mitomycyną-c w pożywce zawierającej surowicę i kondycjonowano komórkami ES. Po około tygodniu wyrosły kolonie komórek. Komórki te rosły w hodowli i wykazywały cechy pluripotencjalne , o czym świadczy zdolność do tworzenia potworniaków , różnicowania in vitro i tworzenia ciał zarodkowych . Martin określił te komórki jako komórki ES.

Obecnie wiadomo, że komórki odżywcze dostarczają czynnik hamujący białaczkę (LIF), a surowica dostarcza białka morfogenetyczne kości (BMP), które są niezbędne do zapobiegania różnicowaniu się komórek ES. Czynniki te są niezwykle ważne dla wydajności pozyskiwania ogniw ES. Ponadto wykazano, że różne szczepy myszy mają różne wydajności w izolowaniu komórek ES. Obecne zastosowania mysich komórek ES obejmują generowanie myszy transgenicznych , w tym myszy knockout . W leczeniu ludzi istnieje zapotrzebowanie na komórki pluripotencjalne specyficzne dla pacjenta. Wytwarzanie ludzkich komórek ES jest trudniejsze i wiąże się z problemami etycznymi. Tak więc, oprócz badań nad ludzkimi komórkami ES, wiele grup koncentruje się na wytwarzaniu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (komórek iPS).

Potencjalne metody pozyskiwania nowej linii komórkowej

23 sierpnia 2006 r. w internetowym wydaniu czasopisma naukowego Nature opublikowano list dr. Roberta Lanzy (dyrektora medycznego Advanced Cell Technology w Worcester, MA) stwierdzający, że jego zespół znalazł sposób na ekstrakcję embrionalnych komórek macierzystych bez niszczenia rzeczywistych komórek macierzystych. zarodek. To techniczne osiągnięcie potencjalnie umożliwiłoby naukowcom pracę z nowymi liniami embrionalnych komórek macierzystych uzyskanych z funduszy publicznych w Stanach Zjednoczonych, gdzie finansowanie federalne ograniczało się wówczas do badań z wykorzystaniem linii embrionalnych komórek macierzystych uzyskanych przed sierpniem 2001 r. W marcu 2009 r. ograniczenie zostało zniesione.

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste uzyskano również poprzez transfer jądra komórki somatycznej (SCNT) . To podejście jest również czasami określane jako „klonowanie terapeutyczne”, ponieważ SCNT wykazuje podobieństwo do innych rodzajów klonowania, ponieważ jądra są przenoszone z komórki somatycznej do wyłuszczonej zygoty. Jednak w tym przypadku SCNT wykorzystano do wytworzenia linii embrionalnych komórek macierzystych w laboratorium, a nie żywych organizmów przez ciążę. „Terapeutyczna” część nazwy została uwzględniona w nadziei, że embrionalne komórki macierzyste wyprodukowane przez SCNT mogą mieć zastosowanie kliniczne.

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Technologia IPSC zostało zainicjowane przez Shinya Yamanaka „s laboratorium w Kyoto , Japonia , który pokazał w 2006 roku, że wprowadzenie czterech genów kodujących specyficzne czynniki transkrypcyjne można przekonwertować dorosłych komórek w pluripotencjalne komórki macierzyste. Otrzymał Nagrodę Nobla 2012 wraz z Sir Johnem Gurdonem „za odkrycie, że dojrzałe komórki można przeprogramować, aby stały się pluripotencjalne”.

W 2007 roku wykazano, że pluripotencjalne komórki macierzyste bardzo podobne do embrionalnych komórek macierzystych mogą być generowane przez dostarczenie trzech genów ( Oc4 , Sox2 i Klf4 ) do zróżnicowanych komórek. Dostarczenie tych genów „przeprogramowuje” zróżnicowane komórki w pluripotencjalne komórki macierzyste, umożliwiając wytwarzanie pluripotencjalnych komórek macierzystych bez zarodka. Ponieważ obawy etyczne dotyczące embrionalnych komórek macierzystych zazwyczaj dotyczą ich pochodzenia z embrionów poddanych terminacji, uważa się, że przeprogramowanie na te „indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste” (komórki iPS) może być mniej kontrowersyjne. Za pomocą tej metodologii można przeprogramować zarówno komórki ludzkie, jak i mysie, generując zarówno ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste, jak i mysie pluripotencjalne komórki macierzyste bez zarodka.

Może to umożliwić generowanie specyficznych dla pacjenta linii komórek ES, które mogłyby być potencjalnie wykorzystane w terapiach zastępowania komórek. Ponadto umożliwi to generowanie linii komórkowych ES od pacjentów z różnymi chorobami genetycznymi i dostarczy nieocenionych modeli do badania tych chorób.

Jednak jako pierwsza wskazówka, że ​​technologia indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) może w krótkim czasie prowadzić do nowych leków, została wykorzystana przez zespół badawczy kierowany przez Rudolfa Jaenischa z Whitehead Institute for Biomedical Research w Cambridge , Massachusetts , aby wyleczyć myszy z anemii sierpowatej , jak doniesiono w internetowym wydaniu czasopisma Science z 6 grudnia 2007 r.

16 stycznia 2008 roku kalifornijska firma Stemagen ogłosiła, że ​​stworzyła pierwsze dojrzałe sklonowane ludzkie embriony z pojedynczych komórek skóry pobranych od dorosłych. Zarodki te można zebrać w celu dopasowania embrionalnych komórek macierzystych do pacjenta.

Zanieczyszczenie przez odczynniki stosowane w hodowli komórkowej

Internetowe wydanie Nature Medicine opublikowało badanie 24 stycznia 2005 r., w którym stwierdzono, że ludzkie embrionalne komórki macierzyste dostępne do badań finansowanych przez władze federalne są zanieczyszczone cząsteczkami innymi niż ludzkie z podłoża hodowlanego używanego do hodowli komórek. Powszechną techniką jest wykorzystywanie komórek mysich i innych komórek zwierzęcych do utrzymania pluripotencji aktywnie dzielących się komórek macierzystych. Według naukowców z Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Diego problem został odkryty, gdy w pożywce hodowlanej stwierdzono, że kwas sialowy niepochodzący od człowieka zagraża potencjalnemu wykorzystaniu embrionalnych komórek macierzystych u ludzi .

Jednak badanie opublikowane w internetowym wydaniu Lancet Medical Journal z 8 marca 2005 r. zawiera szczegółowe informacje na temat nowej linii komórek macierzystych, która została uzyskana z ludzkich embrionów w warunkach całkowicie wolnych od komórek i surowicy. Po ponad 6 miesiącach niezróżnicowanej proliferacji komórki te wykazały potencjał tworzenia pochodnych wszystkich trzech listków zarodkowych embrionów zarówno in vitro, jak i potworniakami . Właściwości te zostały również z powodzeniem utrzymane (przez ponad 30 pasaży) w przypadku ustalonych linii komórek macierzystych.

Zobacz też

Bibliografia

Zewnętrzne linki