Immunofluorescencja - Immunofluorescence

Zdjęcie mikrofotograficzne wycinka histologicznego skóry ludzkiej przygotowanej do bezpośredniej immunofluorescencji przy użyciu przeciwciała anty-IgA. Skóra pochodzi od pacjenta z plamicą Henocha-Schönleina : złogi IgA znajdują się na ściankach małych naczyń włosowatych powierzchownych (żółte strzałki). Blado pofalowany zielony obszar na górze to naskórek , dolny obszar włóknisty to skóra właściwa .
Te figury pokazują podstawowy mechanizm immunofluorescencji. Pierwotna immunofluorescencja jest przedstawiona po lewej stronie, co pokazuje przeciwciało z przyłączoną do niego grupą fluoroforową bezpośrednio wiążące się z epitopem antygenu, dla którego jest ono specyficzne. Gdy przeciwciało zwiąże się z epitopem, próbkę można obejrzeć pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby potwierdzić obecność antygenu w próbce. Odwrotnie, wtórna immunofluorescencja jest przedstawiona po prawej stronie, co pokazuje, że najpierw nieoznakowane pierwotne przeciwciało wiąże się z epitopem antygenu w mechanizmie podobnym do opisanego powyżej. Jednak po tym, jak przeciwciała pierwszorzędowe zwiążą się ze swoim celem, pojawia się przeciwciało drugorzędowe (oznaczone fluoroforem). Miejsca wiązania tego przeciwciała drugorzędowego są specyficzne dla przeciwciała pierwszorzędowego, które jest już związane z antygenem, a zatem przeciwciało drugorzędowe wiąże się z przeciwciałem pierwszorzędowym. Ta metoda pozwala na przyłączenie większej liczby przeciwciał znakowanych fluoroforem do ich celu, zwiększając w ten sposób sygnał fluorescencyjny podczas mikroskopii.

Immunofluorescencja to technika stosowana do mikroskopii świetlnej z użyciem mikroskopu fluorescencyjnego, stosowana głównie na próbkach mikrobiologicznych . Ta technika wykorzystuje specyficzność przeciwciał do ich antygenu w celu ukierunkowania barwników fluorescencyjnych na określone cele biocząsteczek w komórce, a zatem umożliwia wizualizację dystrybucji docelowej cząsteczki w próbce. Specyficzny region rozpoznawany przez przeciwciało na antygenie nazywany jest epitopem. Podjęto wysiłki w mapowaniu epitopów, ponieważ wiele przeciwciał może wiązać ten sam epitop, a poziomy wiązania między przeciwciałami, które rozpoznają ten sam epitop, mogą się różnić. Dodatkowo, wiązanie fluoroforu z samym przeciwciałem nie może zakłócać swoistości immunologicznej przeciwciała lub zdolności wiązania jego antygenu. Immunofluorescencja jest szeroko stosowanym przykładem immunobarwienia (stosowanie przeciwciał do barwienia białek) i specyficznym przykładem immunohistochemii (zastosowanie relacji przeciwciało-antygen w tkankach). Ta technika wykorzystuje przede wszystkim fluorofory do wizualizacji lokalizacji przeciwciał.

Immunofluorescencję można zastosować na skrawkach tkanek, hodowanych liniach komórkowych lub pojedynczych komórkach i można ją wykorzystać do analizy dystrybucji białek , glikanów oraz małych cząsteczek biologicznych i niebiologicznych. Technikę tę można nawet wykorzystać do wizualizacji struktur, takich jak włókna średniej wielkości. Jeśli topologia błony komórkowej nie została jeszcze określona, ​​insercję epitopu do białek można zastosować w połączeniu z immunofluorescencją w celu określenia struktur. Immunofluorescencja może być również stosowana jako metoda „półilościowa” w celu uzyskania wglądu w poziomy i wzorce lokalizacji metylacji DNA, ponieważ jest to metoda bardziej czasochłonna niż prawdziwe metody ilościowe i istnieje pewna subiektywność w analizie poziomów metylacja. Immunofluorescencję można stosować w połączeniu z innymi metodami barwienia fluorescencyjnego bez przeciwciał, na przykład z zastosowaniem DAPI do znakowania DNA . Do analizy próbek immunofluorescencyjnych można użyć kilku modeli mikroskopów; najprostszy jest mikroskop epifluorescencyjny , a szeroko stosowany jest również mikroskop konfokalny . Można również zastosować różne konstrukcje mikroskopów o super rozdzielczości, które są w stanie uzyskać znacznie wyższą rozdzielczość.

Rodzaje

Zdjęcie mikrofotograficzne wycinka histologicznego skóry ludzkiej przygotowanej do bezpośredniej immunofluorescencji przy użyciu przeciwciała anty-IgG. Skóra pochodzi od pacjenta z toczniem rumieniowatym układowym i wykazuje złogi IgG w dwóch różnych miejscach: Pierwszym z nich jest złogi podobne do prążków wzdłuż błony podstawnej naskórka ("test prążków toczniowych" jest dodatni). Drugi znajduje się w jądrach komórek naskórka (przeciwciała przeciwjądrowe).

Przygotowanie fluorescencji

Aby wytworzyć przeciwciała znakowane fluorochromem, fluorochrom musi być sprzężony („oznakowany”) z przeciwciałem. Podobnie antygen można również sprzęgać z przeciwciałem za pomocą sondy fluorescencyjnej w technice zwanej techniką antygenu fluorescencyjnego. Procedury barwienia mogą dotyczyć zarówno antygenów utrwalonych w cytoplazmie, jak i antygenów powierzchniowych komórek na żywych komórkach, zwanych „immunofluorescencją błonową”. Możliwe jest również znakowanie dopełniacza kompleksu przeciwciało-antygen sondą fluorescencyjną. Oprócz elementu, do którego dołączone są sondy fluorescencyjne, istnieją dwie ogólne klasy technik immunofluorescencyjnych: pierwotna i wtórna. Poniższe opisy skupią się głównie na tych klasach pod względem sprzężonych przeciwciał.

Istnieją dwie klasy technik immunofluorescencji, pierwotne (lub bezpośrednie) i wtórne (lub pośrednie).

Podstawowy (bezpośredni)

Pierwotna (bezpośrednia) immunofluorescencja wykorzystuje pojedyncze, pierwszorzędowe przeciwciało, chemicznie połączone z fluoroforem . Pierwotne przeciwciało rozpoznaje cząsteczkę docelową (antygen) i wiąże się z określonym regionem zwanym epitopem. Odbywa się to poprzez proces, który manipuluje odpowiedzią immunologiczną organizmu z odpornością nabytą. Dołączony fluorofor można wykryć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, która, w zależności od użytego posłańca, po wzbudzeniu będzie emitować światło o określonej długości fali. Immunofluorescencja bezpośrednia, choć nieco mniej powszechna, ma wyraźną przewagę nad procedurą wtórną (pośrednią). Bezpośrednie przyłączenie komunikatora do przeciwciała zmniejsza liczbę etapów procedury, oszczędzając czas i redukując nieswoisty sygnał tła. Ogranicza to również możliwość reaktywności krzyżowej przeciwciał i możliwych błędów podczas całego procesu. Jednak ta metoda ma pewne wady. Ponieważ liczba cząsteczek fluorescencyjnych, które można związać z przeciwciałem pierwszorzędowym, jest ograniczona, immunofluorescencja bezpośrednia jest znacznie mniej czuła niż immunofluorescencja pośrednia i może dawać wyniki fałszywie ujemne. Bezpośrednia immunofluorescencja wymaga również użycia znacznie większej ilości przeciwciał pierwotnych, które są niezwykle drogie, czasami sięgają 400,00 USD/ml.

Wtórny (pośredni)

Fluorescencyjny barwnik do aktyny w mięśniach gładkich skóry.

Wtórna (pośrednia) immunofluorescencja wykorzystuje dwa przeciwciała; nieoznakowane pierwsze (pierwotne) przeciwciało specyficznie wiąże cząsteczkę docelową, a drugorzędowe przeciwciało, które niesie fluorofor, rozpoznaje pierwotne przeciwciało i wiąże się z nim. Wiele przeciwciał drugorzędowych może wiązać pojedyncze przeciwciało pierwszorzędowe. Zapewnia to wzmocnienie sygnału poprzez zwiększenie liczby cząsteczek fluoroforu na antygen. Ten protokół jest bardziej złożony i czasochłonny niż pierwszy (lub bezpośredni) protokół powyżej, ale zapewnia większą elastyczność, ponieważ dla danego przeciwciała pierwszorzędowego można zastosować różne przeciwciała drugorzędowe i techniki wykrywania.

Ten protokół jest możliwy, ponieważ przeciwciało składa się z dwóch części, regionu zmiennego (który rozpoznaje antygen) i regionu stałego (który tworzy strukturę cząsteczki przeciwciała). Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że ten podział jest sztuczny i w rzeczywistości cząsteczka przeciwciała to cztery łańcuchy polipeptydowe: dwa łańcuchy ciężkie i dwa łańcuchy lekkie. Badacz może wygenerować kilka przeciwciał pierwotnych, które rozpoznają różne antygeny (mają różne regiony zmienne), ale wszystkie mają ten sam region stały. Wszystkie te przeciwciała mogą zatem być rozpoznawane przez pojedyncze przeciwciało drugorzędowe. Oszczędza to koszty modyfikacji pierwotnych przeciwciał, aby bezpośrednio przenosiły fluorofor.

Różne przeciwciała pierwszorzędowe z różnymi regionami stałymi są zazwyczaj wytwarzane przez hodowanie przeciwciała w różnych gatunkach. Na przykład badacz może wytworzyć u kozy przeciwciała pierwszorzędowe, które rozpoznają kilka antygenów, a następnie zastosować sprzężone z barwnikiem królicze przeciwciała drugorzędowe, które rozpoznają region stały przeciwciała koziego (przeciwciała „królicze anty-kozie”). Badacz może następnie stworzyć drugi zestaw pierwotnych przeciwciał u myszy, które mogą być rozpoznawane przez oddzielne drugorzędowe przeciwciało „osioł anty-mysie”. Pozwala to na ponowne wykorzystanie trudnych do wytworzenia przeciwciał sprzężonych z barwnikiem w wielu eksperymentach.

Ograniczenia

Jak w przypadku większości technik fluorescencyjnych, istotnym problemem związanym z immunofluorescencją jest fotowybielanie . Utrata aktywności spowodowana fotowybielaniem może być kontrolowana poprzez zmniejszenie lub ograniczenie intensywności lub czasu ekspozycji na światło, zwiększenie stężenia fluoroforów lub zastosowanie bardziej wytrzymałych fluoroforów, które są mniej podatne na wybielanie (np. Alexa Fluors , Seta Fluors lub DyLight Fluors ). Niektóre problemy, które mogą wyniknąć z tej techniki, obejmują autofluorescencję, zewnętrzną niepożądaną specyficzną fluorescencję i niespecyficzną fluorescencję. Autofluorescencja obejmuje fluorescencję emitowaną z próbki tkanki lub samej komórki. Zewnętrzna niepożądana swoista fluorescencja występuje, gdy docelowy antygen jest zanieczyszczony i zawiera zanieczyszczenia antygenowe. Niespecyficzna fluorescencja obejmuje utratę specyficzności sondy z powodu fluoroforu, niewłaściwego utrwalenia lub wysuszenia próbki.

Immunofluorescencja jest ograniczona tylko do utrwalonych (tj. martwych) komórek, gdy mają być wizualizowane struktury wewnątrz komórki, ponieważ przeciwciała nie przenikają przez błonę komórkową podczas reakcji ze znacznikami fluorescencyjnymi. Materiał antygenowy musi być mocno utrwalony w miejscu jego naturalnej lokalizacji wewnątrz komórki. Nienaruszone przeciwciała mogą być również zbyt duże, aby barwić komórki rakowe in vivo . Ich wielkość powoduje powolną penetrację guza i długi okres półtrwania w krążeniu. Przeprowadzono badania nad wykorzystaniem diaciał w celu obejścia tego ograniczenia. Białka w supernatancie lub na zewnątrz błony komórkowej mogą być wiązane przez przeciwciała; pozwala to na zabarwienie żywych komórek. W zależności od użytego utrwalacza, białka będące przedmiotem zainteresowania mogą zostać usieciowane, co może skutkować fałszywie dodatnimi lub fałszywie ujemnymi sygnałami z powodu niespecyficznego wiązania.

Alternatywnym podejściem jest zastosowanie białek rekombinowanych zawierających domeny białek fluorescencyjnych, np. białko zielonej fluorescencji (GFP). Zastosowanie takich „oznakowanych” białek pozwala na określenie ich lokalizacji w żywych komórkach. Chociaż wydaje się to być elegancką alternatywą dla immunofluorescencji, komórki muszą być transfekowane lub transdukowane znacznikiem GFP, w wyniku czego stają się organizmami co najmniej S1 lub wyższymi, które wymagają bardziej rygorystycznych standardów bezpieczeństwa w laboratorium. Ta technika polega na zmianie informacji genetycznej komórek.

Zaliczki

Wiele ulepszeń tej metody polega na ulepszeniu mikroskopów fluorescencyjnych i fluoroforów. Metody super rozdzielczości ogólnie odnoszą się do zdolności mikroskopu do uzyskania rozdzielczości poniżej granicy Abbego (limit nałożony na światło ze względu na jego długość fali). Ta granica dyfrakcji wynosi około 200-300 nm w kierunku poprzecznym i 500-700 nm w kierunku osiowym. Granica ta jest porównywalna lub większa niż niektóre struktury w komórce, a co za tym idzie, granica ta uniemożliwiła naukowcom określenie szczegółów ich struktury. W szczególności superrozdzielczość w fluorescencji odnosi się do zdolności mikroskopu do zapobiegania jednoczesnej fluorescencji sąsiednich spektralnie identycznych fluoroforów. Proces ten skutecznie wyostrza funkcję rozproszenia punktowego mikroskopu. Przykłady ostatnio opracowanych metod superrozdzielczych mikroskopów fluorescencyjnych obejmują mikroskopię stymulowanego zubożenia emisji (STED), mikroskopię z nasyconym iluminacją strukturalną (SSIM), mikroskopię lokalizacyjną z fotoaktywacją fluorescencyjną (FPALM) i mikroskopię stochastycznej rekonstrukcji optycznej (STORM).

Zobacz też

Bibliografia

Zewnętrzne linki