Mikroskop - Microscope
.JPG) Mikroskop
| |
| Zastosowania | Obserwacja małej próbki |
|---|---|
| Wybitne eksperymenty | Odkrycie komórek |
| Powiązane przedmioty | Mikroskop optyczny Mikroskop elektronowy |
Mikroskop (od starogreckiego : μικρός MIKROS „małe” i σκοπεῖν skopeîn „patrzeć (na); badać, sprawdzać”) jest instrumentem laboratorium wykorzystywane do badania obiektów, które są zbyt małe, aby być postrzegane przez gołym okiem . Mikroskopia to nauka o badaniu małych obiektów i struktur za pomocą mikroskopu. Mikroskopowy oznacza bycie niewidocznym dla oka, chyba że wspomagany jest przez mikroskop.
Istnieje wiele rodzajów mikroskopów i można je pogrupować na różne sposoby. Jednym ze sposobów jest opisanie metody, której instrument używa do interakcji z próbką i wytwarzania obrazów, albo poprzez wysyłanie wiązki światła lub elektronów przez próbkę na jej drodze optycznej , przez wykrywanie emisji fotonów z próbki lub przez skanowanie w poprzek i w niewielkiej odległości od powierzchni próbki za pomocą sondy. Najpopularniejszym mikroskopem (i pierwszym, który został wynaleziony) jest mikroskop optyczny , który wykorzystuje soczewki do załamywania światła widzialnego, które przeszło przez cienką próbkę, aby uzyskać obserwowalny obraz. Inne główne typy mikroskopów to mikroskop fluorescencyjny , mikroskopu elektronowego (zarówno transmisyjnego mikroskopu elektronowego i skaningowego mikroskopu elektronowego ) i różne rodzaje skaningowym mikroskopem sondy .
Historia
Chociaż obiekty przypominające soczewki pochodzą sprzed 4000 lat i istnieją greckie opisy właściwości optycznych sfer wypełnionych wodą (V wiek p.n.e.), po których następuje wiele wieków pism o optyce, najwcześniejsze znane zastosowanie prostych mikroskopów ( szkół powiększających ) datuje się na powszechne stosowanie soczewek w okularach w XIII wieku. Najwcześniejsze znane przykłady mikroskopów złożonych, które łączą soczewkę obiektywu w pobliżu próbki z okularem, aby zobaczyć rzeczywisty obraz , pojawiły się w Europie około 1620 roku. Wynalazca jest nieznany, mimo że na przestrzeni lat pojawiło się wiele twierdzeń. Kilka z nich kręci się wokół ośrodków produkcji spektakli w Holandii , w tym twierdzenia, że zostały wynalezione w 1590 roku przez Zachariasa Janssena (zgłoszone przez jego syna) lub ojca Zachariasa, Hansa Martensa, lub obu twierdzi, że został wynaleziony przez ich sąsiada i rywala. ekspres, Hans Lippershey (który zastosowano do pierwszego teleskopu patentu w 1608 roku), a roszczenia Wynaleziony przez emigrantów Korneliusz Drebbel , który odnotowano mieć wersję w Londynie w 1619 Galileo Galilei (również czasami cytowane jako związek mikroskopu wynalazcy) wydaje odkrył po 1610 r., że może zbliżyć swój teleskop do obserwacji małych obiektów, a po obejrzeniu złożonego mikroskopu zbudowanego przez Drebbela wystawionego w Rzymie w 1624 r. zbudował własną ulepszoną wersję. Giovanni Faber ukuł nazwę mikroskopu dla złożonego mikroskopu Galileo złożonego do Accademia dei Lincei w 1625 roku (Galileo nazwał go occhiolino „małym okiem”).
Powstanie nowoczesnych mikroskopów świetlnych
.jpg)
Pierwszy szczegółowy opis mikroskopowej anatomii tkanki organicznej, oparty na użyciu mikroskopu, pojawił się dopiero w 1644 r. w L'occhio della mosca Giambattisty Odierny , czyli Oku muchy .
Mikroskop był nadal w dużej mierze nowością aż do lat 60. i 70. XVII wieku, kiedy przyrodnicy we Włoszech, Holandii i Anglii zaczęli używać go do badania biologii. Włoski naukowiec Marcello Malpighi , nazywany przez niektórych historyków biologii ojcem histologii , swoją analizę struktur biologicznych rozpoczął od płuc. Publikacja w 1665 roku od Robert Hooke „s Micrographia miał ogromny wpływ, głównie z powodu jego imponujących ilustracjami. Znaczący wkład wniósł Antonie van Leeuwenhoek, który osiągnął nawet 300-krotne powiększenie przy użyciu prostego mikroskopu jednosoczewkowego. Umieścił bardzo mały szklany obiektyw w kształcie kuli między otworami w dwóch metalowych płytkach nitowanych razem z regulowaną za pomocą śrub igłą dołączoną do mocowania próbki. Następnie Van Leeuwenhoek na nowo odkrył czerwone krwinki (za Janem Swammerdamem ) i plemniki oraz pomógł spopularyzować użycie mikroskopów do obserwacji ultrastruktury biologicznej. 9 października 1676 van Leeuwenhoek poinformował o odkryciu mikroorganizmów.
Wydajność mikroskopu świetlnego zależy od jakości i prawidłowego zastosowania systemu soczewek kondensora do skupiania światła na próbce oraz soczewki obiektywu do przechwytywania światła z próbki i tworzenia obrazu. Wczesne instrumenty były ograniczone, dopóki ta zasada nie została w pełni doceniona i rozwinięta od końca XIX do początku XX wieku, a także do czasu, gdy lampy elektryczne były dostępne jako źródła światła. W 1893 August Köhler opracował kluczową zasadę oświetlenia próbki, oświetlenie Köhler , które ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia teoretycznych granic rozdzielczości dla mikroskopu świetlnego. Ta metoda oświetlenia próbki zapewnia równomierne oświetlenie i przezwycięża ograniczony kontrast i rozdzielczość narzucone przez wczesne techniki oświetlenia próbki. Dalsze postępy w oświetleniu próbki pochodziły z odkrycia kontrastu fazowego przez Fritsa Zernike'a w 1953 r. i oświetlenia kontrastowego interferencyjnego różnicowego przez Georges'a Nomarskiego w 1955 r.; obie pozwalają na obrazowanie niezabarwionych, przezroczystych próbek.
Mikroskopy elektronowe
Na początku XX wieku opracowano znaczącą alternatywę dla mikroskopu świetlnego, instrument, który do generowania obrazu wykorzystuje wiązkę elektronów zamiast światła . Niemiecki fizyk Ernst Ruska we współpracy z inżynierem elektrykiem Maxem Knollem opracował w 1931 roku pierwszy prototypowy mikroskop elektronowy, transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM). Transmisyjny mikroskop elektronowy działa na podobnych zasadach jak mikroskop optyczny, ale wykorzystuje elektrony zamiast światła i elektromagnesy zamiast szklanych soczewek. Użycie elektronów zamiast światła pozwala na uzyskanie znacznie większej rozdzielczości.
Rozwój transmisyjnego mikroskopu elektronowego został szybko poprzedzony w 1935 roku przez opracowanie skaningowego mikroskopu elektronowego przez Maxa Knolla . Chociaż TEM były wykorzystywane do badań przed II wojną światową i stały się popularne później, SEM nie był dostępny na rynku aż do 1965 roku.
Transmisyjne mikroskopy elektronowe stały się popularne po II wojnie światowej . Ernst Ruska, pracujący w firmie Siemens , opracował pierwszy komercyjny transmisyjny mikroskop elektronowy, a w latach pięćdziesiątych rozpoczęły się duże konferencje naukowe z zakresu mikroskopii elektronowej. W 1965 roku profesor Sir Charles Oatley i jego doktorant Gary Stewart opracowali pierwszy komercyjny skaningowy mikroskop elektronowy, który został wprowadzony na rynek przez Cambridge Instrument Company jako „Stereoscan”.
Jednym z najnowszych odkryć dotyczących używania mikroskopu elektronowego jest możliwość identyfikacji wirusa. Ponieważ ten mikroskop wytwarza widoczny, wyraźny obraz małych organelli, w mikroskopie elektronowym nie ma potrzeby stosowania odczynników, aby zobaczyć wirusa lub szkodliwe komórki, co zapewnia bardziej skuteczny sposób wykrywania patogenów.
Mikroskopy z sondą skanującą
Od 1981 do 1983 roku Gerd Binnig i Heinrich Rohrer pracował w IBM w Zurychu , Szwajcaria studiować kwantowa tunelowania zjawisko. Stworzyli praktyczny instrument, mikroskop z sondą skanującą z teorii tunelowania kwantowego, który odczytuje bardzo małe siły wymieniane między sondą a powierzchnią próbki. Sonda zbliża się do powierzchni tak blisko, że elektrony mogą w sposób ciągły przepływać między sondą a próbką, wytwarzając prąd z powierzchni do sondy. Mikroskop początkowo nie został dobrze przyjęty ze względu na złożoną naturę leżących u jego podstaw wyjaśnień teoretycznych. W 1984 Jerry Tersoff i DR Hamann, podczas pracy w Bell Laboratories AT&T w Murray Hill, New Jersey, zaczęli publikować artykuły, które wiązały teorię z wynikami eksperymentów uzyskanymi przez instrument. To było dokładnie śledzone w 1985 r. z funkcjonującymi instrumentami komercyjnymi, aw 1986 r. wraz z wynalezieniem mikroskopu sił atomowych przez Gerda Binniga, Quate'a i Gerbera , a następnie uhonorowaniem Binniga i Rohrera Nagrodą Nobla w dziedzinie fizyki dla SPM.
W miarę rozwoju możliwości obróbki ultracienkich sond i końcówek wciąż opracowywane są nowe typy mikroskopów z sondą skanującą.
Mikroskopy fluorescencyjne
Najnowsze osiągnięcia w mikroskopie świetlnym w dużej mierze koncentrują się na rozwoju mikroskopii fluorescencyjnej w biologii . W ciągu ostatnich dekadach 20 wieku, szczególnie w post- genomowego epoki, wiele technik fluorescencyjnych barwienia z komórkowych zostały opracowane struktur. Główne grupy technik obejmują ukierunkowane barwienie chemiczne poszczególnych struktur komórkowych, na przykład związek chemiczny DAPI do znakowania DNA , zastosowanie przeciwciał sprzężonych z reporterami fluorescencyjnymi, patrz immunofluorescencja oraz białka fluorescencyjne, takie jak białko zielonej fluorescencji . Techniki te wykorzystują te różne fluorofory do analizy struktury komórki na poziomie molekularnym zarówno w próbkach żywych, jak i utrwalonych.
Rozwój mikroskopii fluorescencyjnej przyczynił się do opracowania ważnego projektu nowoczesnego mikroskopu — mikroskopu konfokalnego . Zasada została opatentowana w 1957 roku przez Marvina Minsky'ego , chociaż technologia laserowa ograniczała praktyczne zastosowanie tej techniki. Dopiero w 1978 roku Thomas i Christoph Cremer opracowali pierwszy praktyczny laserowy mikroskop konfokalny, a technika ta szybko zyskała popularność w latach 80. XX wieku.
Mikroskopy o super rozdzielczości
Wiele obecnych badań (na początku XXI wieku) nad technikami mikroskopów optycznych koncentruje się na opracowaniu analizy superrozdzielczej próbek znakowanych fluorescencyjnie. Oświetlenie strukturalne może poprawić rozdzielczość od około dwóch do czterech razy, a techniki, takie jak mikroskopia stymulowanego wyczerpania emisji (STED), zbliżają się do rozdzielczości mikroskopów elektronowych. Dzieje się tak, ponieważ granica dyfrakcji pochodzi od światła lub wzbudzenia, co powoduje, że rozdzielczość musi zostać podwojona, aby uzyskać przesycenie. Stefan Hell otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii 2014 za opracowanie techniki STED, wraz z Ericiem Betzigiem i Williamem Moernerem, którzy zaadaptowali mikroskopię fluorescencyjną do wizualizacji pojedynczych cząsteczek.
Mikroskopy rentgenowskie
Mikroskopy rentgenowskie to instrumenty wykorzystujące promieniowanie elektromagnetyczne zwykle w miękkim paśmie rentgenowskim do obrazowania obiektów. Postęp technologiczny w optyce soczewek rentgenowskich na początku lat 70. sprawił, że instrument stał się realnym wyborem do obrazowania. Są one często wykorzystywane w tomografii (patrz tomografia mikrokomputerowa ) do tworzenia trójwymiarowych obrazów obiektów, w tym materiałów biologicznych, które nie zostały utrwalone chemicznie. Obecnie prowadzone są badania nad udoskonaleniem optyki dla twardych promieni rentgenowskich, które mają większą moc penetracji.
Rodzaje
Mikroskopy można podzielić na kilka różnych klas. Jedno grupowanie opiera się na tym, co oddziałuje z próbką w celu wygenerowania obrazu, tj. światło lub fotony (mikroskopy optyczne), elektrony (mikroskopy elektronowe) lub sonda (mikroskopy z sondą skanującą). Alternatywnie, mikroskopy można klasyfikować na podstawie tego, czy analizują próbkę za pomocą punktu skanującego (mikroskopy optyczne konfokalne, skaningowe mikroskopy elektronowe i mikroskopy ze skanującą sondą), czy analizują próbkę w całości (mikroskopy optyczne o szerokim polu widzenia i transmisyjne mikroskopy elektronowe).
Zarówno szerokokątne mikroskopy optyczne, jak i transmisyjne mikroskopy elektronowe wykorzystują teorię soczewek ( optyka do mikroskopów świetlnych i soczewki elektromagnetyczne do mikroskopów elektronowych) w celu powiększenia obrazu generowanego przez przejście fali przechodzącej przez próbkę lub odbitej przez próbkę. Stosowane są fale elektromagnetyczne (w mikroskopach optycznych ) lub wiązki elektronów (w mikroskopach elektronowych ). Rozdzielczość w tych mikroskopach jest ograniczona długością fali promieniowania użytego do obrazowania próbki, przy czym krótsze długości fal pozwalają na wyższą rozdzielczość.
Skaningowe mikroskopy optyczne i elektronowe, takie jak mikroskop konfokalny i skaningowy mikroskop elektronowy, wykorzystują soczewki do skupienia plamki światła lub elektronów na próbce, a następnie analizują sygnały generowane przez wiązkę oddziałującą z próbką. Punkt jest następnie skanowany nad próbką w celu przeanalizowania prostokątnego obszaru. Powiększenie obrazu uzyskuje się poprzez wyświetlenie danych ze skanowania fizycznie małego obszaru próbki na stosunkowo dużym ekranie. Mikroskopy te mają takie same ograniczenia rozdzielczości jak szerokokątne mikroskopy optyczne, sondy i mikroskopy elektronowe.
Mikroskopy z sondą skanującą analizują również pojedynczy punkt w próbce, a następnie skanują sondę nad prostokątnym obszarem próbki, aby zbudować obraz. Ponieważ mikroskopy te nie wykorzystują do obrazowania promieniowania elektromagnetycznego ani elektronowego, nie podlegają one tej samej rozdzielczości co mikroskopy optyczne i elektronowe opisane powyżej.
Optyczny
Najpopularniejszym rodzajem mikroskopu (i pierwszym wynalezionym) jest mikroskop optyczny . Jest to przyrząd optyczny zawierający jedną lub więcej soczewek, wytwarzający powiększony obraz próbki umieszczonej w płaszczyźnie ogniskowej. Mikroskopy optyczne mają szkło refrakcyjne (czasami plastikowe lub kwarcowe ), które skupia światło na oku lub na innym detektorze światła. W ten sam sposób działają mikroskopy optyczne oparte na lustrze. Typowe powiększenie mikroskopu świetlnego, przy założeniu zakresu widzialnego światła, wynosi do 1250x z teoretyczną granicą rozdzielczości około 0,250 mikrometrów lub 250 nanometrów . Ogranicza to praktyczne powiększenie do ~1500x. Specjalistyczne techniki (np. skaningowa mikroskopia konfokalna , Vertico SMI ) mogą przekraczać to powiększenie, ale rozdzielczość jest ograniczona dyfrakcją . Zastosowanie krótszych długości fal światła, takich jak ultrafiolet, jest jednym ze sposobów poprawy rozdzielczości przestrzennej mikroskopu optycznego, podobnie jak urządzenia takie jak skaningowy mikroskop optyczny bliskiego pola .
Sarfus to najnowsza technika optyczna, która zwiększa czułość standardowego mikroskopu optycznego do punktu, w którym możliwa jest bezpośrednia wizualizacja błon nanometrycznych (do 0,3 nanometra) i izolowanych nanoobiektów (do 2 nm średnicy). Technika ta opiera się na zastosowaniu nieodblaskowych podłoży do mikroskopii z krzyżowo spolaryzowanym światłem odbitym.
Światło ultrafioletowe umożliwia rozdzielczość mikroskopijnych cech, a także obrazowanie próbek, które są przezroczyste dla oka. Światło bliskiej podczerwieni może być wykorzystywane do wizualizacji obwodów wbudowanych w urządzenia krzemowe, ponieważ krzem jest przezroczysty w tym obszarze długości fal.
W mikroskopii fluorescencyjnej wiele długości fal światła, od ultrafioletu do światła widzialnego, może być użytych do wywołania fluorescencji próbek , co umożliwia oglądanie okiem lub za pomocą szczególnie czułych kamer.
Mikroskopia z kontrastem fazowym to technika naświetlania mikroskopem optycznym , w której niewielkie przesunięcia fazowe światła przechodzącego przez przezroczystą próbkę są przekształcane w zmiany amplitudy lub kontrastu obrazu. Użycie kontrastu fazowego nie wymaga barwienia w celu obejrzenia szkiełka. Ta technika mikroskopowa umożliwiła badanie cyklu komórkowego w żywych komórkach.
Tradycyjny mikroskop optyczny przekształcił się ostatnio w mikroskop cyfrowy . Oprócz lub zamiast bezpośredniego oglądania obiektu przez okulary , do uzyskania obrazu, który jest następnie wyświetlany na monitorze komputera , stosuje się rodzaj czujnika podobnego do stosowanego w aparacie cyfrowym . Czujniki te mogą wykorzystywać technologię CMOS lub urządzenie ze sprzężeniem ładunkowym (CCD), w zależności od zastosowania.
Mikroskopia cyfrowa z bardzo niskimi poziomami światła, aby uniknąć uszkodzenia wrażliwych próbek biologicznych, jest dostępna przy użyciu czułych aparatów cyfrowych zliczających fotony . Wykazano, że źródło światła dostarczające pary splątanych fotonów może zminimalizować ryzyko uszkodzenia próbek najbardziej światłoczułych. W tym zastosowaniu obrazowania widmowego do mikroskopii z rzadkimi fotonami próbkę oświetla się fotonami w podczerwieni, z których każdy jest skorelowany przestrzennie ze splątanym partnerem w paśmie widzialnym w celu wydajnego obrazowania za pomocą kamery zliczającej fotony.
Elektron
Dwa główne typy mikroskopów elektronowych to transmisyjne mikroskopy elektronowe (TEM) i skaningowe mikroskopy elektronowe (SEM). Oba mają szereg soczewek elektromagnetycznych i elektrostatycznych, które skupiają wiązkę elektronów o wysokiej energii na próbce. W TEM elektrony przechodzą przez próbkę, analogicznie do podstawowej mikroskopii optycznej . Wymaga to starannego przygotowania próbki, ponieważ elektrony są silnie rozpraszane przez większość materiałów. Próbki muszą być również bardzo cienkie (poniżej 100 nm), aby elektrony mogły przez nie przejść. Przekroje komórek barwionych osmem i metalami ciężkimi ujawniają przejrzyste błony organelli i białka, takie jak rybosomy. Przy poziomie rozdzielczości 0,1 nm można uzyskać szczegółowe widoki wirusów (20 – 300 nm) i nici DNA (o szerokości 2 nm). W przeciwieństwie do tego SEM ma cewki rastrowe do skanowania powierzchni obiektów masowych drobną wiązką elektronów. Dlatego próbka nie musi być koniecznie dzielona na sekcje, ale w przypadku próbek nieprzewodzących może być konieczne powlekanie nanometryczną warstwą metalu lub węgla. SEM umożliwia szybkie obrazowanie powierzchni próbek, prawdopodobnie w cienkiej parze wodnej, aby zapobiec wysychaniu.
Sonda skanująca
Różne typy mikroskopów z sondą skanującą wynikają z wielu różnych rodzajów interakcji, które występują, gdy mała sonda jest skanowana i wchodzi w interakcję z próbką. Te interakcje lub tryby mogą być rejestrowane lub mapowane jako funkcja położenia na powierzchni w celu utworzenia mapy charakterystyki. Trzy najpopularniejsze typy mikroskopów z sondą skanującą to mikroskopy sił atomowych (AFM), skaningowe mikroskopy optyczne bliskiego pola (MSOM lub SNOM, skaningowa mikroskopia optyczna bliskiego pola) oraz skaningowe mikroskopy tunelowe (STM). Mikroskop sił atomowych ma cienką sondę, zwykle z krzemu lub azotku krzemu, przymocowaną do wspornika; sonda jest skanowana nad powierzchnią próbki, a siły powodujące interakcję między sondą a powierzchnią próbki są mierzone i mapowane. Skaningowy mikroskop optyczny bliskiego pola jest podobny do AFM, ale jego sonda składa się ze źródła światła w światłowodzie pokrytego końcówką, która zwykle ma aperturę, przez którą światło przechodzi. Mikroskop może przechwytywać światło przechodzące lub odbite w celu pomiaru bardzo lokalnych właściwości optycznych powierzchni, zwykle próbki biologicznej. Skaningowe mikroskopy tunelowe mają metalową końcówkę z pojedynczym atomem wierzchołkowym; końcówka jest przymocowana do rurki, przez którą przepływa prąd. Końcówka jest skanowana nad powierzchnią próbki przewodzącej, dopóki nie popłynie prąd tunelowy; prąd jest utrzymywany na stałym poziomie dzięki komputerowemu ruchowi końcówki, a obraz tworzony jest przez zarejestrowane ruchy końcówki.
Inne rodzaje
Skaningowe mikroskopy akustyczne wykorzystują fale dźwiękowe do pomiaru zmian impedancji akustycznej. Podobnie jak w zasadzie Sonar , służą one do takich prac, jak wykrywanie defektów podpowierzchniowych materiałów, w tym tych występujących w układach scalonych. 4 lutego 2013 r. australijscy inżynierowie zbudowali „mikroskop kwantowy”, który zapewnia niezrównaną precyzję.
