Mikroskopia - Microscopy

Badanie mikroskopowe w laboratorium biochemicznym

Mikroskopia to techniczna dziedzina używania mikroskopów do oglądania obiektów i obszarów obiektów, których nie można zobaczyć gołym okiem (obiekty, które nie mieszczą się w zakresie rozdzielczości normalnego oka). Istnieją trzy dobrze znane gałęzie mikroskopii: mikroskopia optyczna , elektronowa i skaningowa wraz z powstającą dziedziną mikroskopii rentgenowskiej .

Mikroskopia elektronowa mikroskopia optyczna i wiąże się z dyfrakcji , odbicie lub załamanie z promieniowania elektromagnetycznego / wiązek elektronów interakcji z próbki , a zbiór promieniowania rozproszonego lub innego sygnału w celu utworzenia obrazu. Proces ten można przeprowadzić przez napromieniowanie próbki w szerokim polu (na przykład standardowa mikroskopia świetlna i transmisyjna mikroskopia elektronowa ) lub przez skanowanie cienkiej wiązki nad próbką (na przykład współogniskowa laserowa mikroskopia skaningowa i skaningowa mikroskopia elektronowa ). Mikroskopia sondy skanującej obejmuje interakcję sondy skanującej z powierzchnią obiektu zainteresowania. Rozwój mikroskopii zrewolucjonizowały biologii , dała początek dziedzinie histologii i tak pozostaje istotnym technika w życiu i nauk fizycznych . Mikroskopia rentgenowska jest trójwymiarowa i nieniszcząca, umożliwiając wielokrotne obrazowanie tej samej próbki w badaniach in situ lub 4D i zapewniając możliwość „zajrzenia do wnętrza” badanej próbki przed poświęceniem jej na techniki o wyższej rozdzielczości. Mikroskop rentgenowski 3D wykorzystuje technikę tomografii komputerowej (microCT), obracając próbkę o 360 stopni i rekonstruując obrazy. Tomografia komputerowa jest zwykle przeprowadzana za pomocą płaskiego wyświetlacza panelowego. Mikroskop rentgenowski 3D wykorzystuje szereg obiektywów, np. od 4X do 40X, a także może zawierać płaski panel.

Historia

Często uważany za pierwszego uznanego mikroskopistę i mikrobiologa , Antonie van Leeuwenhoek jest najbardziej znany ze swojej pionierskiej pracy w dziedzinie mikroskopii oraz ze swojego wkładu w ustanowienie mikrobiologii jako dyscypliny naukowej.

Dziedzina mikroskopii (mikroskopia optyczna ) sięga co najmniej XVII wieku. Wcześniejsze mikroskopy, pojedyncze soczewki powiększające okulary z ograniczoną powiększeniu, data przynajmniej tak daleko jak szerokiego rozpowszechnienia soczewek w okularach w wieku 13, ale bardziej zaawansowanych mikroskopów złożonych po raz pierwszy pojawił się w Europie około 1620 Najwcześniejsze praktycy mikroskopii obejmują Galileo Galilei , który odkrył w 1610 r., że może z bliska zogniskować swój teleskop, aby oglądać z bliska małe obiekty i Cornelis Drebbel , który mógł wynalazł złożony mikroskop około 1620 r. Antonie van Leeuwenhoek opracował prosty mikroskop o bardzo dużym powiększeniu w 1670 r. i jest często uważany za pierwszy uznany mikroskopista i mikrobiolog .

Mikroskopia optyczna

Mikroskop stereoskopowy

Mikroskopia optyczna lub świetlna polega na przepuszczaniu światła widzialnego przechodzącego przez lub odbitego od próbki przez pojedynczą soczewkę lub wiele soczewek, aby umożliwić powiększony widok próbki. Powstały obraz może być wykryty bezpośrednio przez oko, zobrazowany na kliszy fotograficznej lub uchwycony cyfrowo . Pojedyncza soczewka wraz z przystawkami, czyli system soczewek i sprzętu do obrazowania wraz z odpowiednim sprzętem oświetleniowym, stolikiem do próbkowania i wspornikiem, tworzy podstawowy mikroskop świetlny. Najnowszym osiągnięciem jest mikroskop cyfrowy , który wykorzystuje kamerę CCD do skupienia się na interesującym eksponacie. Obraz jest wyświetlany na ekranie komputera, więc okulary są niepotrzebne.

Ograniczenia

Ograniczenia standardowej mikroskopii optycznej (mikroskopia jasnego pola ) leżą w trzech obszarach;

  • Ta technika może skutecznie obrazować tylko ciemne lub silnie załamujące się obiekty.
  • Jest dyfrakcja ograniczona rozdzielczość w zależności od długości fali padającego; w zakresie widzialnym rozdzielczość mikroskopii optycznej jest ograniczona do około 0,2   mikrometra ( patrz: mikroskop ), a praktyczna granica powiększenia do ~1500x.
  • Nieostre światło z punktów poza płaszczyzną ogniskowania zmniejsza wyrazistość obrazu.


Zwłaszcza żywym komórkom na ogół brakuje wystarczającego kontrastu, aby można było je z powodzeniem badać, ponieważ wewnętrzne struktury komórki są bezbarwne i przezroczyste. Najczęstszym sposobem zwiększenia kontrastu jest barwienie różnych struktur selektywnymi barwnikami, ale często wiąże się to z zabijaniem i utrwalaniem próbki. Barwienie może również wprowadzić artefakty , które są widocznymi szczegółami strukturalnymi, które są spowodowane obróbką próbki, a zatem nie są uzasadnionymi cechami próbki. Ogólnie rzecz biorąc, techniki te wykorzystują różnice we współczynniku załamania struktur komórkowych. Mikroskopia jasnego pola jest porównywalna do patrzenia przez szybę: nie widać szyby, a jedynie brud na szybie. Istnieje różnica, ponieważ szkło jest gęstszym materiałem, a to powoduje różnicę w fazie przechodzącego światła. Ludzkie oko nie jest wrażliwe na tę różnicę faz, ale wynaleziono sprytne rozwiązania optyczne, aby zmienić tę różnicę faz na różnicę amplitudy (natężenia światła).

Techniki

Aby poprawić kontrast próbki lub uwydatnić pewne struktury w próbce, należy zastosować specjalne techniki. Dostępny jest ogromny wybór technik mikroskopowych w celu zwiększenia kontrastu lub oznaczenia próbki.

Jasne pole

Mikroskopia jasnego pola jest najprostszą ze wszystkich technik mikroskopii świetlnej. Oświetlenie próbki odbywa się za pomocą światła przechodzącego, tj. oświetlanego od dołu i obserwowanego z góry. Ograniczenia obejmują niski kontrast większości próbek biologicznych i niską rozdzielczość pozorną z powodu rozmycia nieostrego materiału. Prostota techniki i minimalne wymagane przygotowanie próbki to znaczące zalety.

Ukośne oświetlenie

Zastosowanie oświetlenia ukośnego (z boku) nadaje obrazowi trójwymiarowy (3D) wygląd i może uwydatnić niewidoczne w inny sposób cechy. Nowszą techniką opartą na tej metodzie jest kontrast modulacyjny Hoffmanna , system stosowany w mikroskopach odwróconych do stosowania w hodowli komórkowej. Oświetlenie skośne ma te same ograniczenia, co mikroskopia w jasnym polu (niski kontrast wielu próbek biologicznych; niska rozdzielczość pozorna z powodu nieostrych obiektów).

Ciemne pole

Mikroskopia ciemnego pola to technika poprawiająca kontrast niezabarwionych, przezroczystych próbek. Oświetlenie ciemnego pola wykorzystuje starannie ustawione źródło światła, aby zminimalizować ilość bezpośrednio przepuszczanego (nierozproszonego) światła wpadającego do płaszczyzny obrazu, zbierając tylko światło rozproszone przez próbkę. Ciemne pole może radykalnie poprawić kontrast obrazu – zwłaszcza obiektów przezroczystych – jednocześnie wymagając niewielkiej konfiguracji sprzętu lub przygotowania próbki. Jednak technika ta cierpi z powodu niskiej intensywności światła w końcowym obrazie wielu próbek biologicznych i nadal ma na nią wpływ niska rozdzielczość pozorna.

Okrzemek pod oświetlenie Rheinberg

Oświetlenie Rheinberga jest specjalną odmianą oświetlenia ciemnego pola, w której przezroczyste, kolorowe filtry są umieszczane tuż przed kondensorem, dzięki czemu promienie świetlne przy dużej aperturze mają inny kolor niż przy małej aperturze (tj. tło próbki może być niebieskie, podczas gdy obiekt wydaje się samoświecący na czerwono). Możliwe są inne kombinacje kolorystyczne, ale ich skuteczność jest dość zmienna.

Barwienie dyspersyjne

Barwienie dyspersyjne to technika optyczna dająca kolorowy obraz bezbarwnego obiektu. Jest to technika barwienia optycznego, która nie wymaga bejc ani barwników, aby uzyskać efekt kolorystyczny. Istnieje pięć różnych konfiguracji mikroskopów stosowanych w szerszej technice barwienia dyspersyjnego. Należą do nich: linia Becke w jasnym polu, ukośne, ciemne pole, kontrast fazowy i obiektywne barwienie z zatrzymaniem dyspersji.

Kontrast fazowy

Mikrofotografia z kontrastem fazowym nieodwapnionej chrząstki szklistej ukazująca chondrocyty i organelle , luki i macierz zewnątrzkomórkową .
W mikroskopii elektronowej : Obrazowanie z kontrastem fazowym

Bardziej wyrafinowane techniki pokażą proporcjonalne różnice w gęstości optycznej. Kontrast fazowy to szeroko stosowana technika, która pokazuje różnice we współczynniku załamania światła jako różnicę kontrastu. Został opracowany przez holenderskiego fizyka Fritsa Zernike w latach 30. (za co otrzymał Nagrodę Nobla w 1953 r.). Na przykład jądro w komórce będzie widoczne na tle otaczającej cytoplazmy. Kontrast jest doskonały; jednak nie nadaje się do użytku z grubymi przedmiotami. Często nawet wokół małych obiektów tworzy się aureola, która przesłania szczegóły. System składa się z okrągłego pierścienia w kondensatorze, który wytwarza stożek światła. Stożek ten nakłada się na pierścień o podobnej wielkości w ramach celu fazowego. Każdy obiektyw ma inny rozmiar pierścienia, więc dla każdego obiektywu należy wybrać inne ustawienie kondensora. Pierścień w obiektywie ma specjalne właściwości optyczne: przede wszystkim zmniejsza natężenie światła bezpośredniego, ale co ważniejsze, tworzy sztuczną różnicę faz około ćwierć długości fali. Ponieważ zmieniły się właściwości fizyczne tego bezpośredniego światła, pojawia się interferencja z ugiętym światłem, co skutkuje powstaniem obrazu z kontrastem fazowym. Jedną z wad mikroskopii z kontrastem fazowym jest tworzenie się halo (pierścień światła halo).

Kontrast interferencji różnicowej

Lepszym i znacznie droższym jest zastosowanie kontrastu interferencyjnego . Różnice w gęstości optycznej pokażą się jako różnice w reliefie. Według Georgesa Nomarskiego jądro w komórce faktycznie pojawi się jako kulka w najczęściej używanym systemie kontrastu różnicowej interferencji . Trzeba jednak pamiętać, że jest to efekt optyczny , a relief niekoniecznie oddaje prawdziwy kształt. Kontrast jest bardzo dobry, a aperturę kondensora można wykorzystać w pełni otwartą, zmniejszając w ten sposób głębię ostrości i maksymalizując rozdzielczość.

System ten składa się ze specjalnego pryzmatu ( Nomarskiego do graniastosłupa , pryzmat wollastona ) w kondensatorze, które rozdziela światło w zwyczajnym i nadzwyczajnego belki. Różnica przestrzenna między dwiema wiązkami jest minimalna (mniejsza niż maksymalna rozdzielczość obiektywu). Po przejściu przez próbkę wiązki są ponownie łączone przez podobny pryzmat w obiektywie.

W jednorodnej próbce nie ma różnicy między dwiema wiązkami i nie jest generowany kontrast. Jednak w pobliżu granicy refrakcyjnej (powiedzmy jądra w cytoplazmie) różnica między wiązką zwykłą i niezwykłą wygeneruje na obrazie relief. Kontrast interferencji różnicowej wymaga do działania spolaryzowanego źródła światła ; na drodze światła należy zamontować dwa filtry polaryzacyjne, jeden pod kondensorem (polaryzator), a drugi nad obiektywem (analizator).

Uwaga: W przypadkach, w których konstrukcja optyczna mikroskopu powoduje znaczne boczne oddzielenie dwóch wiązek, mamy do czynienia z klasyczną mikroskopią interferencyjną , która nie daje obrazów wypukłych, ale mimo to może być stosowana do ilościowego określania grubości masy mikroskopijnych przedmiotów.

Odbicie interferencyjne

Dodatkową techniką wykorzystującą interferencję jest mikroskopia odbicia interferencyjnego (znana również jako odbity kontrast interferencyjny lub RIC). Opiera się na adhezji komórek do szkiełka w celu wytworzenia sygnału interferencyjnego. Jeśli do szkła nie ma komórki, nie będzie żadnych zakłóceń.

Mikroskopię odbiciową interferencyjną można uzyskać przy użyciu tych samych elementów, co DIC, ale bez pryzmatów. Ponadto wykrywane światło jest odbijane, a nie przepuszczane, jak w przypadku zastosowania DIC.

Fluorescencja

Obrazy mogą również zawierać artefakty . To konfokalnej skaningowej laserowego fluorescencyjnego mikrofotografia z thale rzeżuchy pylnika (część pręcika ). Zdjęcie pokazuje między innymi ładną, czerwoną, spływającą strukturę przypominającą kołnierz tuż pod pylnikiem. Jednak nienaruszony pręcik rzeżuchy thale nie ma takiego kołnierza, jest to artefakt fiksacji: pręcik został wycięty poniżej ramy obrazu, a naskórek (górna warstwa komórek) łodygi pręcika złuszczył się, tworząc niecharakterystyczną strukturę . Zdjęcie: Heiti Paves z Politechniki w Tallinie .

Kiedy pewne związki są oświetlone światłem o wysokiej energii, emitują światło o niższej częstotliwości. Efekt ten jest znany jako fluorescencja . Często okazy wykazują charakterystyczny obraz autofluorescencyjny , wynikający z ich składu chemicznego.

Ta metoda ma kluczowe znaczenie we współczesnych naukach przyrodniczych, ponieważ może być niezwykle czuła, umożliwiając detekcję pojedynczych cząsteczek. Do barwienia różnych struktur lub związków chemicznych można zastosować wiele różnych barwników fluorescencyjnych . Jedną szczególnie skuteczną metodą jest połączenie przeciwciał sprzężonych z fluoroforem, jak w immunobarwieniu . Przykładami powszechnie stosowanych fluoroforów są fluoresceina lub rodamina .

Przeciwciała mogą być dostosowane do związku chemicznego. Na przykład często stosowaną strategią jest sztuczna produkcja białek w oparciu o kod genetyczny (DNA). Białka te można następnie wykorzystać do immunizacji królików, tworząc przeciwciała, które wiążą się z białkiem. Przeciwciała są następnie sprzęgane chemicznie z fluoroforem i wykorzystywane do śledzenia białek w badanych komórkach.

Wysoce wydajne białka fluorescencyjne , takie jak białko zielonej fluorescencji (GFP), zostały opracowane przy użyciu techniki biologii molekularnej fuzji genów , procesu łączącego ekspresję związku fluorescencyjnego z ekspresją białka docelowego. To połączone białko fluorescencyjne jest na ogół nietoksyczne dla organizmu i rzadko zakłóca funkcję badanego białka. Genetycznie zmodyfikowane komórki lub organizmy bezpośrednio wyrażają znakowane fluorescencyjnie białka, co umożliwia badanie funkcji oryginalnego białka in vivo .

Wzrost kryształów białka powoduje powstawanie zarówno kryształów białka, jak i soli. Oba są bezbarwne i mikroskopijne. Odzyskiwanie kryształów białka wymaga obrazowania, które można wykonać za pomocą wewnętrznej fluorescencji białka lub przy użyciu mikroskopii transmisyjnej. Obie metody wymagają mikroskopu ultrafioletowego, ponieważ białko absorbuje światło przy 280 nm. Białko będzie również fluorescencyjne przy około 353 nm po wzbudzeniu światłem 280 nm.

Ponieważ emisja fluorescencyjna różni się długością fali (kolorem) od światła wzbudzającego, idealny obraz fluorescencyjny pokazuje tylko interesującą strukturę, która została wyznakowana barwnikiem fluorescencyjnym. Ta wysoka swoistość doprowadziła do powszechnego stosowania mikroskopii fluorescencyjnej w badaniach biomedycznych. Do barwienia różnych struktur biologicznych można stosować różne barwniki fluorescencyjne, które można następnie wykrywać jednocześnie, zachowując jednocześnie specyficzność dzięki indywidualnemu kolorowi barwnika.

Aby zablokować światło wzbudzające przed dotarciem do obserwatora lub detektora, potrzebne są zestawy filtrów wysokiej jakości. Zazwyczaj składają się one z filtra wzbudzenia wybierającego zakres długości fal wzbudzenia , zwierciadła dichroicznego i filtru emisyjnego blokującego światło wzbudzenia. Większość mikroskopów fluorescencyjnych działa w trybie Epi-ilumination (oświetlanie i detekcja z jednej strony próbki), aby jeszcze bardziej zmniejszyć ilość światła wzbudzającego wpadającego do detektora.

Zobacz też: mikroskop fluorescencyjny z całkowitym wewnętrznym odbiciem Neuroscience

Konfokalny

Laserowa mikroskopia konfokalna wykorzystuje skupioną wiązkę laserową (np. 488 nm), która jest skanowana w poprzek próbki w celu wzbudzenia fluorescencji punkt po punkcie. Emitowane światło jest kierowane przez otworek, aby zapobiec dotarciu nieostrego światła do detektora, zazwyczaj do fotopowielacza . Obraz jest konstruowany w komputerze, wykreślając zmierzone natężenia fluorescencji w zależności od położenia lasera wzbudzającego. W porównaniu do pełnego oświetlenia próbki, mikroskopia konfokalna daje nieco wyższą rozdzielczość boczną i znacznie poprawia przekrój optyczny (rozdzielczość osiowa). Mikroskopia konfokalna jest zatem powszechnie stosowana tam, gdzie ważna jest struktura 3D.

Podklasa mikroskopów konfokalnych to mikroskopy z wirującym dyskiem, które są w stanie skanować wiele punktów jednocześnie w całej próbce. Odpowiedni dysk z otworkami odrzuca nieostre światło. Detektorem światła w mikroskopie z wirującym dyskiem jest kamera cyfrowa, zwykle EM-CCD lub sCMOS .

Mikroskopia dwufotonowa

Mikroskop dwufotonowy to również laserowy mikroskop skaningowy, ale zamiast UV, niebieskiego lub zielonego światła laserowego do wzbudzenia stosuje się pulsacyjny laser podczerwony . Tylko w niewielkim ognisku lasera intensywność jest wystarczająco wysoka, aby wygenerować fluorescencję przez wzbudzenie dwufotonowe , co oznacza, że ​​nie jest generowana fluorescencja pozaogniskowa, a do oczyszczenia obrazu nie jest potrzebny otwór. Pozwala to na obrazowanie głęboko w rozproszonej tkance, gdzie mikroskop konfokalny nie byłby w stanie skutecznie zbierać fotonów. Mikroskopy dwufotonowe z detekcją szerokiego pola są często używane do obrazowania funkcjonalnego, np. obrazowania wapnia w tkance mózgowej. Są one sprzedawane jako mikroskopy wielofotonowe przez kilka firm, chociaż korzyści z zastosowania wzbudzenia 3-fotonowego zamiast 2-fotonowego są marginalne.

Mikroskopia oświetlenia jednopłaszczyznowego i mikroskopia fluorescencyjna arkusza świetlnego

Stosując płaszczyznę światła utworzoną przez skupienie światła przez cylindryczną soczewkę pod wąskim kątem lub przez skanowanie linii światła w płaszczyźnie prostopadłej do osi obiektywu, można wykonać sekcje optyczne o wysokiej rozdzielczości. Oświetlenie jednopłaszczyznowe lub oświetlenie arkuszem świetlnym jest również realizowane przy użyciu technik kształtowania wiązki, obejmujących wielopryzmatyczne ekspandery wiązki . Obrazy są rejestrowane przez CCD. Warianty te umożliwiają bardzo szybkie przechwytywanie obrazu z wysokim stosunkiem sygnału do szumu.

Szerokokątna mikroskopia wielofotonowa

Szerokokątna mikroskopia wielofotonowa odnosi się do optycznej techniki obrazowania nieliniowego, w której duży obszar obiektu jest oświetlany i obrazowany bez konieczności skanowania. Wysoka intensywność jest wymagana do indukowania nieliniowych procesów optycznych, takich jak fluorescencja dwufotonowa lub generacja drugiej harmonicznej . W skaningowych mikroskopach wielofotonowych wysokie natężenia uzyskuje się poprzez ścisłe skupienie światła, a obraz uzyskuje się poprzez skanowanie wiązką. W szerokokątnej mikroskopii wielofotonowej wysokie natężenia najlepiej osiąga się przy użyciu optycznie wzmocnionego impulsowego źródła laserowego w celu uzyskania dużego pola widzenia (~100 µm). Obraz w tym przypadku jest uzyskiwany jako pojedyncza klatka za pomocą kamery CCD bez konieczności skanowania, dzięki czemu technika ta jest szczególnie przydatna do jednoczesnej wizualizacji dynamicznych procesów na obiekcie zainteresowania. Dzięki szerokokątnej mikroskopii wielofotonowej szybkość klatek można zwiększyć nawet 1000-krotnie w porównaniu z wielofotonową mikroskopią skaningową . Jednak w rozproszonej tkance jakość obrazu gwałtownie spada wraz ze wzrostem głębokości.

Dekonwolucja

Mikroskopia fluorescencyjna to potężna technika do pokazywania specjalnie oznakowanych struktur w złożonym środowisku i dostarczania trójwymiarowych informacji o strukturach biologicznych. Informacja ta jest jednak zamazana przez fakt, że po oświetleniu wszystkie struktury znakowane fluorescencyjnie emitują światło, niezależnie od tego, czy są w ognisku, czy nie. Tak więc obraz pewnej struktury jest zawsze zamazany przez światło ze struktur, które są nieostre. Zjawisko to powoduje utratę kontrastu, zwłaszcza w przypadku stosowania obiektywów o dużej rozdzielczości, zazwyczaj olejowych obiektywów imersyjnych o dużej aperturze numerycznej.

Matematycznie modelowana funkcja rozproszenia punktu impulsowego systemu obrazowania laserowego THz.

Jednak rozmycie nie jest spowodowane przypadkowymi procesami, takimi jak rozpraszanie światła, ale może być dobrze określone przez optyczne właściwości tworzenia obrazu w systemie obrazowania mikroskopowego. Jeśli weźmiemy pod uwagę małe fluorescencyjne źródło światła (zasadniczo jasną plamę), światło pochodzące z tej plamki rozchodzi się dalej z naszej perspektywy, gdy plamka staje się bardziej nieostra. W idealnych warunkach daje to kształt „klepsydry” tego źródła punktowego w trzecim (osiowym) wymiarze. Ten kształt nazywa się funkcją rozproszenia punktu (PSF) systemu obrazowania mikroskopowego. Ponieważ każdy obraz fluorescencyjny składa się z dużej liczby takich małych fluorescencyjnych źródeł światła, mówi się, że obraz jest „splatany przez funkcję rozproszenia punktu”. Po prawej stronie pokazano matematycznie modelowany PSF systemu obrazowania impulsowego laserem terahercowym.

Wyjście systemu obrazowania można opisać za pomocą równania:

Gdzie n jest szumem addytywnym. Znajomość tej funkcji rozproszenia punktów oznacza, że ​​możliwe jest odwrócenie tego procesu w pewnym stopniu metodami komputerowymi powszechnie znanymi jako mikroskopia dekonwolucyjna . Dostępne są różne algorytmy dekonwolucji 2D lub 3D. Można je z grubsza klasyfikuje się nonrestorative i naprawczej metod. Podczas gdy metody nieodtwórcze mogą poprawić kontrast poprzez usunięcie nieostrego światła z płaszczyzn ogniskowych, tylko metody odtwórcze mogą faktycznie zmienić przypisanie światła do jego właściwego miejsca pochodzenia. Przetwarzanie obrazów fluorescencyjnych w ten sposób może mieć przewagę nad bezpośrednim pozyskiwaniem obrazów bez nieostrego światła, takich jak obrazy z mikroskopii konfokalnej , ponieważ sygnały świetlne wyeliminowane w inny sposób stają się użyteczną informacją. W przypadku dekonwolucji 3D zazwyczaj dostarcza się serię obrazów wykonanych z różnych płaszczyzn ogniskowych (zwanych stosem Z) oraz wiedzę o PSF, którą można wyprowadzić eksperymentalnie lub teoretycznie ze znajomości wszystkich parametrów mikroskopu.

Techniki subdyfrakcyjne

Przykład mikroskopii superrozdzielczej. Obraz HER3 i Her2 , docelowej raka piersi narkotyków Trastuzumab , w komórce nowotworowej.

W ostatnich czasach opracowano wiele technik mikroskopii superrozdzielczej, które pozwalają ominąć granicę dyfrakcji .

Osiąga się to głównie poprzez wielokrotne obrazowanie wystarczająco statycznej próbki i albo modyfikację światła wzbudzenia, albo obserwację stochastycznych zmian w obrazie. Stosowane są metody dekonwolucji opisane w poprzedniej sekcji, które usuwają rozmycie wywołane PSF i przypisują matematycznie „poprawne” pochodzenie światła, aczkolwiek z nieco innym rozumieniem znaczenia piksela. Zakładając, że przez większość czasu jeden fluorofor przyczynia się do powstania jednej plamki na pojedynczym wykonanym obrazie, plamki na obrazach można zastąpić ich obliczoną pozycją, znacznie poprawiając rozdzielczość znacznie poniżej granicy dyfrakcji.

Aby zrealizować takie założenie, podstawą tych technik jest wiedza i kontrola chemiczna fotofizyki fluoroforów, dzięki której regularnie uzyskuje się rozdzielczość ~20 nanometrów.

Szeregowa amplifikowana mikroskopia z kodowaniem czasu

Wzmocniona mikroskopia z kodowaniem seryjnym (STEAM) to metoda obrazowania, która zapewnia ultraszybki czas otwarcia migawki i liczbę klatek na sekundę, wykorzystując optyczne wzmocnienie obrazu w celu obejścia fundamentalnego kompromisu między czułością a szybkością, a także fotodetektor pojedynczego piksela w celu wyeliminowania potrzeby matryca detektorów i ograniczenia czasu odczytu Metoda jest co najmniej 1000 razy szybsza niż najnowocześniejsze kamery CCD i CMOS . W związku z tym jest potencjalnie przydatny w szerokim zakresie zastosowań naukowych, przemysłowych i biomedycznych, które wymagają dużej szybkości akwizycji obrazów, w tym diagnostyki i oceny fal uderzeniowych w czasie rzeczywistym, mikroprzepływów , MEMS i chirurgii laserowej .

Rozszerzenia

Większość nowoczesnych przyrządów zapewnia proste rozwiązania do mikrofotografii i elektronicznej rejestracji obrazu. Jednak takie możliwości nie zawsze są obecne i bardziej doświadczony mikroskopista w wielu przypadkach nadal będzie wolał odręcznie rysowany obraz od fotografii. Dzieje się tak, ponieważ mikroskopijny znający temat potrafi dokładnie zamienić trójwymiarowy obraz w precyzyjny dwuwymiarowy rysunek. Jednak w fotografii lub innym systemie przechwytywania obrazu tylko jedna cienka płaszczyzna jest zawsze dobrze ustawiona.

Tworzenie ostrożnych i dokładnych mikrofotografii wymaga techniki mikroskopowej z użyciem okularu jednoocznego. Istotne jest, aby obydwoje oczu były otwarte, a oko, które nie obserwuje przez mikroskop, było skoncentrowane na kartce papieru leżącej na ławce obok mikroskopu. Z praktyką, bez poruszania głową czy oczami, możliwe jest dokładne zarejestrowanie obserwowanych szczegółów poprzez obrysowywanie obserwowanych kształtów i jednoczesne „widzenie” punkcika ołówka na obrazie mikroskopowym.

Praktykowanie tej techniki ustanawia również dobrą ogólną technikę mikroskopową. Zawsze mniej męcząca jest obserwacja przy zogniskowanym mikroskopie, tak aby obraz był widoczny w nieskończoności i z obydwoma oczami przez cały czas otwartymi.

Inne ulepszenia

Mikrospektroskopia:spektroskopia z mikroskopem

RTG

Ponieważ rozdzielczość zależy od długości fali światła. Mikroskopia elektronowa jest rozwijana od lat 30. XX wieku i wykorzystuje wiązki elektronów zamiast światła. Ze względu na znacznie mniejszą długość fali wiązki elektronów rozdzielczość jest znacznie wyższa.

Chociaż mniej powszechna, mikroskopia rentgenowska została również opracowana od końca lat 40. XX wieku. Rozdzielczość mikroskopii rentgenowskiej leży pomiędzy mikroskopią świetlną a mikroskopią elektronową.

Mikroskopia elektronowa

Do czasu wynalezienia mikroskopii subdyfrakcyjnej długość fali światła ograniczała rozdzielczość tradycyjnej mikroskopii do około 0,2 mikrometra. Aby uzyskać wyższą rozdzielczość, w mikroskopach elektronowych stosuje się wiązkę elektronów o znacznie mniejszej długości fali.

  • Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) jest dość podobna do złożonego mikroskopu świetlnego, wysyłając wiązkę elektronów przez bardzo cienki plasterek próbki. Granica rozdzielczości w 2005 r. wynosiła około 0,05 nanometra i od tego czasu nie wzrosła znacząco.
  • Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) wizualizuje szczegóły na powierzchni próbek i daje bardzo ładny widok 3D. Daje wyniki podobne do tych ze stereoskopowego mikroskopu świetlnego. Najlepsza rozdzielczość dla SEM w 2011 roku wyniosła 0,4 nanometra.

Mikroskopy elektronowe wyposażone do spektroskopii rentgenowskiej mogą zapewnić jakościową i ilościową analizę elementarną. Ten typ mikroskopu elektronowego, znany również jako analityczny mikroskop elektronowy, może być bardzo potężnym narzędziem charakteryzacyjnym do badania nanomateriałów.

Mikroskopia sondy skanującej

To jest technika subdyfrakcji. Przykłady skaningowym mikroskopem sondy są mikroskop sił atomowych (AFM), przy czym , ze skaningowego mikroskopu tunelowego , fotonicznego mikroskopu sił i mikroskop śledzenia nawrotu . Wszystkie takie metody wykorzystują fizyczny kontakt solidnej końcówki sondy do skanowania powierzchni obiektu, który ma być prawie płaski.

Siła ultradźwiękowa

Mikroskopia sił ultradźwiękowych (UFM) została opracowana w celu poprawy szczegółów i kontrastu obrazu w „płaskich” obszarach zainteresowania, w których obrazy AFM mają ograniczony kontrast. Połączenie AFM-UFM umożliwia generowanie obrazu z mikroskopu akustycznego bliskiego pola. Końcówka AFM służy do wykrywania fal ultradźwiękowych i pokonuje ograniczenia długości fali występujące w mikroskopii akustycznej. Dzięki zastosowaniu elastycznych zmian pod końcówką AFM można wygenerować obraz o wiele bardziej szczegółowy niż topografia AFM.

Mikroskopia sił ultradźwiękowych umożliwia lokalne odwzorowanie elastyczności w mikroskopii sił atomowych poprzez zastosowanie drgań ultradźwiękowych do wspornika lub próbki. Próbując przeanalizować wyniki ultradźwiękowej mikroskopii sił w sposób ilościowy, dokonuje się pomiaru krzywej siła-odległość z drganiami ultradźwiękowymi przyłożonymi do podstawy wspornika, a wyniki porównuje się z modelem dynamiki wspornika i interakcji końcówka-próbka w oparciu o technikę skończonych różnic.

Mikroskopia ultrafioletowa

Mikroskopy ultrafioletowe mają dwa główne cele. Pierwszym z nich jest wykorzystanie krótszej długości fali ultrafioletowej energii elektromagnetycznej do poprawy rozdzielczości obrazu poza granicę dyfrakcji standardowych mikroskopów optycznych. Technika ta jest wykorzystywana do nieniszczącej kontroli urządzeń o bardzo małych cechach, takich jak te występujące w nowoczesnych półprzewodnikach. Drugim zastosowaniem mikroskopów UV jest wzmocnienie kontrastu, w którym reakcja poszczególnych próbek jest wzmocniona w stosunku do ich otoczenia, ze względu na oddziaływanie światła z cząsteczkami w samej próbce. Jednym z przykładów jest wzrost kryształów białka . Kryształy białka powstają w roztworach soli. Ponieważ kryształy soli i białka powstają w procesie wzrostu i oba są zwykle przezroczyste dla ludzkiego oka, nie można ich odróżnić za pomocą standardowego mikroskopu optycznego. Jak tryptofanu w białku pochłania światło o długości fali 280 nm, obrazowanie przy użyciu mikroskopu UV 280 nm, filtr środkowo-przepustowych ułatwia rozróżnienie dwóch typów kryształów. Kryształy białka wydają się ciemne, podczas gdy kryształy soli są przezroczyste.

Mikroskopia w podczerwieni

Termin mikroskopia w podczerwieni odnosi się do mikroskopii wykonywanej w podczerwieni . W typowej konfiguracji przyrządu spektrometr w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) jest połączony z mikroskopem optycznym i detektorem podczerwieni . Detektor podczerwieni może być detektorem jednopunktowym, matrycą liniową lub matrycą płaszczyzny ogniskowej 2D. FTIR zapewnia możliwość przeprowadzenia analizy chemicznej za pomocą spektroskopii w podczerwieni, a mikroskop i detektor punktowy lub matrycowy umożliwiają przestrzenne rozdzielenie tej analizy chemicznej, tj. wykonanie w różnych obszarach próbki. W związku z tym technika ta jest również nazywana mikrospektroskopią w podczerwieni. Alternatywna architektura zwana laserowym obrazowaniem w bezpośredniej podczerwieni (LDIR) obejmuje połączenie przestrajalnego źródła światła podczerwonego i detektora punktowego na lecącym obiektywie). Technika ta jest często wykorzystywana do obrazowania chemicznego w podczerwieni , gdzie kontrast obrazu jest określany przez reakcję poszczególnych obszarów próbki na poszczególne długości fal IR wybrane przez użytkownika, zwykle określone pasma absorpcji IR i związane z nimi rezonanse molekularne . Kluczowym ograniczeniem konwencjonalnej mikrospektroskopii w podczerwieni jest to, że rozdzielczość przestrzenna jest ograniczona dyfrakcją . W szczególności rozdzielczość przestrzenna jest ograniczona do liczby związanej z długością fali światła. W przypadku praktycznych mikroskopów IR rozdzielczość przestrzenna jest ograniczona do 1-3x długości fali, w zależności od konkretnej techniki i używanego instrumentu. W przypadku fal o średniej podczerwieni wyznacza to praktyczną granicę rozdzielczości przestrzennej na poziomie ~3-30 μm.

Istnieją również wersje IR mikroskopii subdyfrakcyjnej. Obejmują one IR skaningowy mikroskop optyczny bliskiego pola (NSOM) , mikrospektroskopię fototermiczną i spektroskopię w podczerwieni opartą na mikroskopie sił atomowych (AFM-IR) , a także skaningową mikroskopię optyczną bliskiego pola typu rozpraszającego (s-SNOM) i nano-FTIR, które zapewniają rozdzielczość przestrzenną w nanoskali przy długościach fal IR.

Cyfrowa mikroskopia holograficzna

Komórki ludzkie zobrazowane za pomocą przesunięcia fazowego DHM (po lewej) i mikroskopii kontrastu fazowego (po prawej).

W cyfrowej mikroskopii holograficznej (DHM) fronty fal zakłócających ze spójnego (monochromatycznego) źródła światła są rejestrowane na czujniku. Obraz jest cyfrowo rekonstruowany przez komputer z zapisanego hologramu . Oprócz zwykłego obrazu jasnego pola tworzony jest obraz z przesunięciem fazowym .

DHM może działać zarówno w trybie odbicia, jak i transmisji. W trybie odbicia obraz z przesunięciem fazowym zapewnia pomiar odległości względnej, a zatem przedstawia mapę topograficzną powierzchni odbijającej. W trybie transmisji obraz z przesunięciem fazowym zapewnia bezetykietowy ilościowy pomiar grubości optycznej próbki. Obrazy z przesunięciem fazowym komórek biologicznych są bardzo podobne do obrazów barwionych komórek i zostały z powodzeniem przeanalizowane przez oprogramowanie do analizy wysokiej zawartości .

Unikalną cechą DHM jest możliwość regulacji ostrości po zarejestrowaniu obrazu, ponieważ wszystkie płaszczyzny ostrości są rejestrowane jednocześnie przez hologram. Ta funkcja umożliwia obrazowanie poruszających się cząstek w objętości lub szybkie skanowanie powierzchni. Inną atrakcyjną cechą jest zdolność DHM do używania taniej optyki poprzez korygowanie aberracji optycznych przez oprogramowanie.

Patologia cyfrowa (mikroskopia wirtualna)

Patologia cyfrowa to oparte na obrazie środowisko informacyjne, które umożliwia technologia komputerowa, które pozwala na zarządzanie informacjami generowanymi z cyfrowego slajdu. Patologię cyfrową umożliwia po części mikroskopia wirtualna , która polega na przekształcaniu preparatów szklanych w preparaty cyfrowe, które można przeglądać, zarządzać i analizować.

Mikroskopia laserowa

Mikroskopia laserowa to szybko rozwijająca się dziedzina, która wykorzystuje źródła światła laserowego w różnych formach mikroskopii. Na przykład mikroskopia laserowa skoncentrowana na zastosowaniach biologicznych wykorzystuje ultrakrótkie lasery impulsowe w wielu technikach określanych jako mikroskopia nieliniowa, mikroskopia nasycenia i mikroskopia wzbudzenia dwufotonowego .

Laboratoryjne lasery rentgenowskie o dużej intensywności i krótkich impulsach są opracowywane od kilku lat. Gdy ta technologia dojdzie do skutku, możliwe będzie uzyskanie powiększonych trójwymiarowych obrazów elementarnych struktur biologicznych w stanie żywym w ściśle określonym momencie. Aby uzyskać optymalny kontrast między wodą a białkiem oraz najlepszą czułość i rozdzielczość, laser należy dostroić w pobliżu linii azotu na około 0,3 nanometra. Rozdzielczość będzie ograniczana głównie przez ekspansję hydrodynamiczną, która zachodzi podczas rejestracji niezbędnej liczby fotonów. Tak więc, podczas gdy okaz jest zniszczony przez ekspozycję, jego konfigurację można uchwycić, zanim eksploduje.

Naukowcy pracują nad praktycznymi projektami i prototypami rentgenowskich mikroskopów holograficznych, pomimo długotrwałego rozwoju odpowiedniego lasera.

Mikroskopia fotoakustyczna

Technika mikroskopowa polegająca na efekcie fotoakustycznym , czyli generowaniu (ultra)dźwięku w wyniku pochłaniania światła. Skupiona i modulowana intensywność wiązka lasera jest skanowana rastrowo na próbce. Generowany (ultra)dźwięk jest wykrywany za pomocą przetwornika ultradźwiękowego. Powszechnie stosuje się piezoelektryczne przetworniki ultradźwiękowe.

Kontrast obrazu jest powiązany ze współczynnikiem absorpcji próbki . Jest to przeciwieństwo mikroskopii jasnego lub ciemnego pola, gdzie kontrast obrazu wynika z przepuszczalności lub rozpraszania. W zasadzie kontrast mikroskopii fluorescencyjnej jest również proporcjonalny do absorpcji próbki. Jednak w mikroskopii fluorescencyjnej wydajność kwantowa fluorescencji musi być nierówna do zera, aby można było wykryć sygnał. Jednak w mikroskopii fotoakustycznej każda substancja pochłaniająca daje sygnał fotoakustyczny proporcjonalny do

Oto współczynnik Grüneisena, energia fotonu lasera i energia przerwy energetycznej próbki. Dlatego mikroskopia fotoakustyczna wydaje się być dobrze dopasowana jako technika komplementarna do mikroskopii fluorescencyjnej, ponieważ wysoka wydajność kwantowa fluorescencji prowadzi do wysokich sygnałów fluorescencyjnych, a niska wydajność kwantowa fluorescencji prowadzi do wysokich sygnałów fotoakustycznych.

Pomijając efekty nieliniowe, rozdzielczość poprzeczna dx jest ograniczona przez granicę dyfrakcji Abbego :

gdzie jest długością fali lasera wzbudzającego, a NA jest aperturą numeryczną soczewki obiektywu. Granica dyfrakcji Abbego obowiązuje, jeśli czoło fali nadchodzącej jest równoległe. W rzeczywistości jednak profil wiązki laserowej jest gaussowski. Dlatego, aby obliczyć osiągalną rozdzielczość, należy użyć wzorów dla skróconych wiązek gaussowskich.

Mikroskopia amatorska

Mikroskopia amatorska to badanie i obserwacja okazów biologicznych i niebiologicznych w celach rekreacyjnych. Kolekcjonerzy minerałów , owadów , muszelek i roślin mogą używać mikroskopów jako narzędzi do odkrywania cech, które pomagają im klasyfikować zebrane przedmioty. Inni amatorzy mogą być zainteresowani obserwowaniem życia znalezionego w wodzie stawowej i innych próbek. Mikroskopy mogą być również przydatne do oceny jakości wody dla osób prowadzących domowe akwarium . Dokumentacja fotograficzna i rysowanie obrazów mikroskopowych to zadania dodatkowe, które poszerzają spektrum zadań amatora. Organizowane są nawet konkursy na sztukę fotomikrograficzną . Uczestnicy tej rozrywki mogą używać komercyjnie przygotowanych szkiełek mikroskopowych lub angażować się w przygotowanie próbek.

Podczas gdy mikroskopia jest centralnym narzędziem w dokumentacji okazów biologicznych, nie jest ona generalnie niewystarczająca do uzasadnienia opisu nowego gatunku wyłącznie na podstawie badań mikroskopowych. Często testy genetyczne i biochemiczne są niezbędne do potwierdzenia odkrycia nowego gatunku. Laboratorium i dostęp do literatury naukowej jest koniecznością, która specjalizuje się i na ogół nie są dostępne dla amatorów. Jest jednak jedna ogromna przewaga, którą amatorzy mają nad profesjonalistami: czas na eksplorację otoczenia. Często zaawansowani amatorzy współpracują z profesjonalistami, aby potwierdzić swoje odkrycia i (być może) opisać nowe gatunki.

Pod koniec XIX wieku mikroskopia amatorska stała się popularnym hobby w Stanach Zjednoczonych i Europie. Kilku „profesjonalnych amatorów” było opłacanych przez filantropów za swoje wyprawy z próbkami i mikroskopijnymi badaniami, aby ich rozbawić w niedzielne popołudnie (np. specjalista od okrzemek A. Grunow, opłacany przez (m.in.) belgijskiego przemysłowca). Profesor John Phin opublikował „Praktyczne wskazówki dotyczące wyboru i użycia mikroskopu” (wydanie drugie, 1878) i był także redaktorem „American Journal of Microscopy”.

Przykłady obrazów z mikroskopu amatorskiego:

Zastosowanie w kryminalistyce

Mikroskopia ma wiele zastosowań w kryminalistyce; zapewnia precyzję, jakość, dokładność i powtarzalność wyników. Te aplikacje są prawie nieograniczone. Wynika to ze zdolności mikroskopu do wykrywania, rozpoznawania i obrazowania najmniejszych elementów dowodowych, często bez jakichkolwiek zmian lub zniszczenia. Mikroskop służy do identyfikacji i porównywania włókien, włosów, gleby i kurzu...itd.

Celem każdego mikroskopu jest powiększanie obrazów lub zdjęć małego obiektu i dostrzeganie drobnych szczegółów. W kryminalistyce; rodzaj próbki, informacje, które chce się z niej uzyskać, oraz rodzaj wybranego do zadania mikroskopu będą decydować o tym, czy wymagane jest przygotowanie próbki. Na przykład linie atramentu, plamy krwi lub kule, nie jest wymagana żadna obróbka, a dowody pokazują bezpośrednio z odpowiedniego mikroskopu bez jakiejkolwiek formy przygotowania próbki, ale w przypadku śladów określonej materii przygotowanie próbki należy wykonać przed wykonaniem badania mikroskopowego.

W laboratorium medycyny sądowej stosowane są różne mikroskopy. Mikroskopy świetlne są najczęściej używane w kryminalistyce i te mikroskopy wykorzystują fotony do tworzenia obrazów 4 , te mikroskopy, które są najbardziej odpowiednie do badania próbek kryminalistycznych, jak wspomniano wcześniej, są następujące:

1. Mikroskop złożony

2. Mikroskop porównawczy

3. Mikroskop stereoskopowy

4. Mikroskop polaryzacyjny

5. Mikrospektrofotometr

Ta różnorodność typów mikroskopów w zastosowaniach kryminalistycznych wynika głównie z ich zakresów powiększenia, które wynoszą odpowiednio (1-1200X), (50-30000X) i (500-250000X) dla mikroskopii optycznej, SEM i TEM.

Zobacz też

Bibliografia

Dalsza lektura

Zewnętrzne linki

Ogólny
Techniki