Specyficzna dla N-acylofosfatydyloetanoloaminy fosfolipaza D - N-acyl phosphatidylethanolamine-specific phospholipase D

Fosfolipaza D N-acylofosfatydyloetanoloaminy ( NAPE-PLD ) jest enzymem, który katalizuje uwalnianie N-acyloetanoloaminy (NAE) z N-acylo-fosfatydyloetanoloaminy (NAPE). Jest to główna część procesu, który przekształca zwykłe lipidy w sygnały chemiczne, takie jak anandamid i oleoiloetanoloamina . U ludzi białko NAPE-PLD jest kodowane przez gen NAPEPLD .

Odkrycie

NAPE-PLD to enzym o aktywności fosfolipazy , działający na fosfolipidy znajdujące się w błonie komórkowej . To nie jest homologii ale wynik chemiczny swojej działalności, że zajęcia go jako fosfolipazy D . Aktywność enzymatyczną odkryto i scharakteryzowano w serii eksperymentów, których kulminacją była publikacja w 2004 roku schematu oczyszczania biochemicznego, na podstawie którego można było przeprowadzić sekwencjonowanie peptydów . Badacze homogenizowana (zmielony) 150 serca od szczura i poddano otrzymanego surowego lizatu do sedymentacji sacharozy przy 105,000 x g w celu oddzielenia błon komórkowych od pozostałych komórek. Te integralne białka błonowe następnie rozpuszcza się za pomocą oktylo glukozydu i poddaje cztery chromatografii kolumnowej etapów (kolumna HiTrap SP HP kationowymienna, HiTrap Q kolumnie anionowymiennej, HiTrap Niebieski kolumnę powinowactwa, Bio-Gel HTP hydroksyapatyt kolumna). Każdy z nich rozdziela różne typy białek błonowych na różne pojemniki na próbki, gdy białka są eluowane z kolumny w czasie, a mierząc aktywność próbek w każdym pojemniku, można było śledzić, które z nich otrzymały aktywny enzym. Pomiaru aktywności enzymatycznej dokonano metodą chromatografii cienkowarstwowej substratu promieniotwórczego wrażliwego na aktywność enzymatyczną NAPE-PLD: Rozszczepienie substratu wpłynęło na miejsce, w którym pojawiło się na płytce po wykryciu promieniowania w analizatorze bioobrazowania.

Wynikiem tej szeroko zakrojonej procedury wciąż nie było czyste białko, ale w wyniku SDS-PAGE uzyskano ograniczoną liczbę prążków i stwierdzono, że jeden prążek o wielkości 46 kilodaltonów koreluje pod względem intensywności z aktywnością enzymatyczną. Prążek ten wycięto z żelu i strawiono trypsyną , a zawarte w nim peptydy oddzielono od siebie metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami . Otrzymane fragmenty poddano następnie mikrosekwencjonowaniu przez zautomatyzowaną degradację Edmana . Trzy odpowiadały wimentynie , pośredniemu białku filamentu o 56 kDa uważanym za zanieczyszczenie, a pozostałe dwa odpowiadały klonowi cDNA zidentyfikowanemu później jako NAPE-PLD.

Po uzyskaniu tej wskazówki identyfikacja mogła zostać potwierdzona mniej uciążliwą procedurą: Nadekspresja przypuszczalnego cDNA NAPE-PLD w komórkach COS-7 dała silną aktywność enzymatyczną NAPE-PLD, której cechy okazały się podobne do cech oryginalny ekstrakt z serca.

Charakterystyka

NAPEPLD cDNA sekwencji przewiduje 396 aminokwasowe sekwencje w przypadku myszy i szczurów, które stanowią 89% i 90% identyczna z ludzi. Stwierdzono, że NAPE-PLD nie ma homologii ze znanymi genami fosfolipazy D , ale może być sklasyfikowany na podstawie homologii jako należący do rodziny metalohydrolaz cynkowych z fałdu beta-laktamazy . W szczególności zaobserwowano wysoce konserwatywny motyw H X( E / H )X D ( C / R / S / H )X _50–70 H X _15–30 ( C / S / D )X _30–70 H , który jest ogólnie związany z reakcją wiązania i hydrolizy cynku w tej klasie białek, co prowadzi autorów do wniosku, że aktywność powinna być skorelowana z zawartością cynku.

Gdy rekombinowany KPDZ-PLD testowano w komórkach COS in vitro miał podobną aktywność wobec kilku znakowanych podłoży N-palmitoylphosphatidylethanolamine N-arachidonoylphosphatidylethanolamine N-oleoylphosphatidylethanolamine i N-stearoylphosphatidylethanolamine wszystkim reaguje się z K _m pomiędzy 2-4 uM i A V _max pomiędzy 73 i 101 mikromolach na miligram na minutę, obliczone przez Lineweavera-Burka . (Te generować N palmitoylethanolamine , anandamid , N oleoylethanolamine i N-stearoylethanolamine, odpowiednio) Enzym reakcji również N-palmitoilo-lizo-fosfatydyloetanoloaminę i N-arachidonoil-lizo-fosfatydyloetanoloaminę z podobnym K _m , lecz w jednej trzeciej do jednej -czwarte V _max . Aktywności te są zgodne z obserwacją, że wiele tkanek wytwarza szereg N- acyloetanoloamin .

Jednak NAPE-PLD nie miał zdolności do wytwarzania wykrywalnego kwasu fosfatydowego z fosfatydylocholiny lub fosfatydyloetanoloaminy, co jest katalizowane przez inne enzymy fosfolipazy D. Brakuje mu również aktywności transfosfatydylacji fosfolipazy D, która umożliwia tworzenie alkoholi fosfatydylowych zamiast kwasu fosfatydowego w obecności etanolu lub butanolu .

Ścieżka

Enzym ten działa jako drugi etap szlaku biochemicznego zapoczątkowanego tworzeniem N-acylofosfatydyloetanoloaminy , poprzez przeniesienie grupy acylowej z pozycji sn- 1 glicerofosfolipidu na grupę aminową fosfatydyloetanoloaminy . Chociaż NAPE- PLD przyczynia się do biosyntezy kilku NAE w ośrodkowym układzie nerwowym ssaków , nie jest jasne , czy enzym ten nie jest odpowiedzialny za tworzenie endokannabinoidu anandamidu , ponieważ donoszono o u myszy pozbawionych NAPE- PLD typu dzikiego . poziom lub bardzo obniżony poziom anandamidu.

Do N-acylethanolamines uwalniane przez ten enzym się potencjalne substraty dla kwasów tłuszczowych hydrolazy amidu (FAAH), który hydrolizuje się wolne kwasy tłuszczowe z etanoloaminą . Defekty tego enzymu mogą powodować wzrost poziomu produktów NAPE-PLD, takich jak anandamid, do 15-krotnie wyższych niż normalnie obserwowanych.

Struktura

Ten enzym błonowy tworzy homodimery , częściowo oddzielone wewnętrznym kanałem o szerokości ∼9-Å. Fałd białka metalo beta-laktamazy jest przystosowany do asocjacji z fosfolipidami błonowymi . Wnęka hydrofobowa zapewnia wejście NAPE substratu do miejsca aktywnego, gdzie dwujądrowe centrum cynkowe katalizuje jego hydrolizę. Kwasy żółciowe wiążą się z wysokim powinowactwem z selektywnymi kieszonkami w tej wnęce, wzmacniając łączenie dimerów i umożliwiając katalizę. NAPE-PLD ułatwia przesłuch między sygnałami kwasów żółciowych a sygnałami amidów lipidów.

Bibliografia