Pochodzenie replikacji - Origin of replication
Inicjacji replikacji (zwany również pochodzenie replikacji ) jest określona sekwencja w genomie , w której replikacja jest inicjowany. Rozmnażanie materiału genetycznego między pokoleniami wymaga terminowej i dokładnej duplikacji DNA przez replikację semikonserwatywną przed podziałem komórki, aby zapewnić, że każda komórka potomna otrzyma pełny zestaw chromosomów . Może to obejmować replikację DNA w organizmach żywych, takich jak prokariota i eukarionty, lub replikację DNA lub RNA w wirusach, takich jak wirusy z dwuniciowym RNA . Synteza nici potomnych rozpoczyna się w odrębnych miejscach, zwanych miejscami początkowymi replikacji i przebiega w sposób dwukierunkowy, aż do replikacji całego genomowego DNA. Pomimo fundamentalnej natury tych zdarzeń, organizmy wykształciły zaskakująco odmienne strategie, które kontrolują początek replikacji. Chociaż struktura organizacji i rozpoznawanie specyficznego pochodzenia replikacji różni się w zależności od gatunku, pewne wspólne cechy są wspólne.
Historia
W drugiej połowie XIX wieku pionierska praca Gregora Mendla na temat dziedziczenia cech u roślin grochu sugerowała, że za przenoszenie cech organizmu między pokoleniami odpowiadają określone „czynniki” (dziś określane jako geny). Chociaż początkowo zakładano, że białka służą jako materiał dziedziczny, Avery, MacLeod i McCarty ustalili sto lat później DNA, które odkrył Friedrich Miescher , jako nośnik informacji genetycznej. Odkrycia te utorowały drogę do badań odkrywających chemiczną naturę DNA i zasady kodowania informacji genetycznej, a ostatecznie doprowadziły Watsona i Cricka do propozycji podwójnej helisy DNA . Ten trójwymiarowy model DNA wyjaśniał potencjalne mechanizmy, dzięki którym informacja genetyczna mogła być kopiowana w sposób semikonserwatywny przed podziałem komórki, hipoteza ta została później poparta eksperymentalnie przez Meselsona i Stahla przy użyciu inkorporacji izotopów w celu odróżnienia DNA rodzicielskiego od nowo zsyntetyzowanego. Późniejsza izolacja polimeraz DNA, enzymów, które katalizują syntezę nowych nici DNA, przez Kornberga i współpracowników zapoczątkowała identyfikację wielu różnych elementów biologicznej maszynerii replikacji DNA, najpierw w bakteryjnym organizmie modelowym E. coli , ale później także w eukariotyczne formy życia.
Cechy
Kluczowym warunkiem wstępnym replikacji DNA jest to, że musi ona zachodzić z niezwykle wysoką wiernością i wydajnością dokładnie raz na cykl komórkowy, aby zapobiec akumulacji zmian genetycznych o potencjalnie szkodliwych konsekwencjach dla przeżycia komórek i żywotności organizmu. Niekompletne, błędne lub przedwczesne zdarzenia replikacji DNA mogą powodować mutacje, poliploidię lub aneuploidię chromosomów oraz zmiany liczby kopii genów, z których każda z kolei może prowadzić do chorób, w tym raka. Aby zapewnić pełną i dokładną duplikację całego genomu oraz prawidłowy przepływ informacji genetycznej do komórek potomnych, wszystkie zdarzenia replikacji DNA są nie tylko ściśle regulowane przez sygnały cyklu komórkowego, ale są również koordynowane z innymi zdarzeniami komórkowymi, takimi jak transkrypcja i naprawa DNA . Dodatkowo, sekwencje pochodzenia zwykle mają wysoką zawartość AT we wszystkich królestwach, ponieważ powtórzenia adeniny i tyminy są łatwiejsze do oddzielenia, ponieważ ich interakcje w układaniu zasad nie są tak silne, jak te w przypadku guaniny i cytozyny.
Replikacja DNA jest podzielona na różne etapy. Podczas inicjacji maszyny replikacyjne – zwane replikomami – są montowane na DNA w sposób dwukierunkowy. Te loci składania stanowią miejsca startu replikacji DNA lub miejsca startu replikacji. W fazie elongacji replikomy przemieszczają się w przeciwnych kierunkach wraz z widełkami replikacyjnymi, rozwijając helisę DNA i syntetyzując komplementarne potomne nici DNA przy użyciu obu macierzystych nici jako matryc. Po zakończeniu replikacji określone zdarzenia terminacji prowadzą do demontażu replikomów. Dopóki cały genom jest zduplikowany przed podziałem komórki, można założyć, że lokalizacja miejsc rozpoczęcia replikacji nie ma znaczenia; jednak wykazano, że wiele organizmów wykorzystuje jako źródło preferowane regiony genomowe. Konieczność regulowania lokalizacji pochodzenia prawdopodobnie wynika z potrzeby skoordynowania replikacji DNA z innymi procesami, które działają na wspólną matrycę chromatyny, aby uniknąć pęknięć nici DNA i uszkodzeń DNA.
Model repliki
Ponad pięć dekad temu Jacob , Brenner i Cuzin zaproponowali hipotezę replikonu, aby wyjaśnić regulację syntezy chromosomalnego DNA w E. coli . Model zakłada, że dyfuzyjny czynnik działający w układzie trans , tak zwany inicjator, oddziałuje z elementem RNA działającym w układzie cis , replikatorem, promując początek replikacji w pobliskim miejscu początkowym. Po związaniu z replikatorami, inicjatory (często z pomocą białek współładujących ) osadzają replikacyjne helikazy na DNA, co z kolei napędza rekrutację dodatkowych składników replikomów i montaż całej maszynerii replikacyjnej. Replikator określa w ten sposób lokalizację zdarzeń inicjacji replikacji, a region chromosomu, który jest replikowany z pojedynczego zdarzenia początkowego lub inicjacji jest zdefiniowany jako replikon.
Fundamentalną cechą hipotezy replikonu jest to, że opiera się ona na pozytywnej regulacji w celu kontrolowania początku replikacji DNA, co może wyjaśniać wiele obserwacji eksperymentalnych w systemach bakteryjnych i fagowych. Na przykład odpowiada za brak replikacji pozachromosomalnego DNA bez pochodzenia po wprowadzeniu do komórek gospodarza. To dalej racjonalizuje niezgodności plazmidów w E. coli, gdzie pewne plazmidy destabilizują wzajemne dziedziczenie z powodu konkurencji o tę samą maszynerię inicjacji molekularnej. W przeciwieństwie do tego, model regulacji negatywnej (analogiczny do modelu transkrypcji replikon-operator) nie wyjaśnia powyższych ustaleń. Niemniej jednak badania następujące po propozycji Jacoba, Brennera i Cuzina dotyczące modelu replikonu ujawniły wiele dodatkowych warstw kontroli replikacji u bakterii i eukariotów, które zawierają zarówno pozytywne, jak i negatywne elementy regulacyjne, podkreślając zarówno złożoność, jak i znaczenie czasowego i przestrzennego ograniczenia replikacji DNA. .
Koncepcja replikatora jako jednostki genetycznej okazała się bardzo przydatna w dążeniu do identyfikacji replikatorowych sekwencji DNA i białek inicjujących u prokariontów , a do pewnego stopnia także u eukariontów , chociaż organizacja i złożoność replikatorów różnią się znacznie między domenami życia. Podczas gdy genomy bakteryjne zazwyczaj zawierają pojedynczy replikator, który jest określony przez konsensusowe elementy sekwencji DNA i który kontroluje replikację całego chromosomu, większość replikatorów eukariotycznych – z wyjątkiem pączkujących drożdży – nie jest zdefiniowana na poziomie sekwencji DNA; zamiast tego wydaje się, że są one określone kombinatorycznie przez lokalne wskaźniki strukturalne DNA i chromatyny . Chromosomy eukariotyczne są również znacznie większe niż ich bakteryjne odpowiedniki, co zwiększa potrzebę inicjowania syntezy DNA z wielu źródeł jednocześnie, aby zapewnić szybką replikację całego genomu. Dodatkowo, w celu zainicjowania replikacji w danym cyklu komórkowym ładowanych jest znacznie więcej helikaz replikacyjnych niż aktywowanych. Oparta na kontekście definicja replikatorów i wybór pochodzenia sugeruje zrelaksowany model replikonu w systemach eukariotycznych, który pozwala na elastyczność w programie replikacji DNA. Chociaż replikatory i miejsca pochodzenia mogą być fizycznie oddalone od siebie na chromosomach, często znajdują się w jednej lokalizacji lub znajdują się w bliskiej odległości; dla uproszczenia, w niniejszym przeglądzie będziemy zatem odnosić się do obu elementów jako „pochodzenia”. Podsumowując, odkrycie i wyizolowanie sekwencji pochodzenia w różnych organizmach stanowi znaczący kamień milowy w kierunku uzyskania mechanistycznego zrozumienia inicjacji replikacji. Ponadto osiągnięcia te mają głębokie implikacje biotechnologiczne dla opracowania wektorów wahadłowych, które można rozmnażać w komórkach bakterii, drożdży i ssaków.
Bakteryjny
Większość chromosomów bakteryjnych ma kształt kolisty i zawiera pojedynczy początek replikacji chromosomów ( oriC ). Bakteryjne regiony oriC są zaskakująco zróżnicowane pod względem wielkości (od 250 pz do 2 kpz), sekwencji i organizacji; niemniej jednak ich zdolność do kierowania początkiem replikacji zazwyczaj zależy od specyficznego dla sekwencji odczytu konsensusowych elementów DNA przez inicjator bakteryjny, białko zwane DnaA. Pochodzenie w bakteriach jest ciągłe lub dwuczęściowe i zawiera trzy elementy funkcjonalne, które kontrolują aktywność pochodzenia: konserwatywne powtórzenia DNA, które są specyficznie rozpoznawane przez DnaA (zwane DnaA-boxes), element odwijający DNA bogaty w AT (DUE) i miejsca wiązania białek które pomagają regulować inicjację replikacji. Interakcje DnaA zarówno z dwuniciowymi (ds) regionami DnaA-box, jak iz jednoniciowym (ss) DNA w DUE są ważne dla aktywacji początku i są mediowane przez różne domeny w białku inicjatora: helisa-skręt-helisa (HTH) element wiążący DNA i ATP - aza związane odpowiednio z różnymi domenami aktywności komórkowej ( AAA+ ). Chociaż sekwencja, liczba i rozmieszczenie skrzynek DnaA związanych z miejscem pochodzenia różni się w całym królestwie bakterii, ich specyficzne położenie i odstępy w danym gatunku są krytyczne dla funkcji OriC i produktywnego tworzenia kompleksu inicjacyjnego.
Wśród bakterii E. coli jest szczególnie potężnym systemem modelowym do badania mechanizmu organizacji, rozpoznawania i aktywacji źródeł replikacji. E. coli oriC zawiera region około ~260 pz zawierający cztery typy elementów wiążących inicjator, które różnią się powinowactwem do DnaA i zależnościami od kofaktora ATP . Bloki DnaA R1, R2 i R4 stanowią miejsca o wysokim powinowactwie, które są związane przez domenę HTH DnaA niezależnie od stanu wiązania nukleotydów przez inicjator. Dla kontrastu, miejsca I, τ i C, które są przeplatane między miejscami R, są skrzynkami DnaA o niskim powinowactwie i wiążą się preferencyjnie z DnaA związanym z ATP, chociaż ADP-DnaA może zastąpić ATP-DnaA w pewnych warunki. Wiązanie domen HTH z elementami rozpoznającymi DnaA o wysokim i niskim powinowactwie promuje zależną od ATP oligomeryzację wyższego rzędu modułów AAA+ DnaA w prawoskrętne włókno, które owija dupleksowe DNA wokół swojej zewnętrznej powierzchni, tworząc w ten sposób superhelikalny skręt, który ułatwia topienie sąsiedniego DUE bogatego w AT. Separacja nici DNA jest dodatkowo wspomagana przez bezpośrednie oddziaływania domeny AAA+ATPazy DnaA z powtórzeniami trypletowymi, tak zwanymi triami DnaA, w proksymalnym regionie DUE. Zaangażowanie jednoniciowych segmentów trinukleotydowych przez włókno inicjatora rozciąga DNA i stabilizuje pęcherzyk inicjujący, zapobiegając ponownemu przyłączaniu. Element pochodzenia DnaA-trio jest konserwowany w wielu gatunkach bakterii, co wskazuje, że jest kluczowym elementem dla funkcji pochodzenia. Po stopieniu DUE zapewnia miejsce wejścia dla replikacyjnej helikazy DnaB E. coli , która jest osadzana na każdej z pojedynczych nici DNA przez jego białko ładujące DnaC.
Chociaż różne aktywności wiązania DNA przez DnaA zostały szeroko zbadane biochemicznie i określono różne struktury związane z apo , ssDNA lub dsDNA, dokładna architektura układu inicjującego DnaA -oriC wyższego rzędu pozostaje niejasna. Zaproponowano dwa modele w celu wyjaśnienia organizacji podstawowych pierwiastków pochodzenia i topnienia oriC za pośrednictwem DnaA . Model dwustanowy zakłada ciągłe włókno DNAA, które przełącza się z trybu wiązania dsDNA (kompleks organizujący) do trybu wiązania ssDNA w DUE (kompleks topiący). W przeciwieństwie do tego, w modelu pętli zwrotnej DNA jest ostro wygięte w oriC i zwija się z powrotem na włókno inicjatora, tak że protomery DNAA jednocześnie angażują regiony dwu- i jednoniciowego DNA. Wyjaśnienie, jak dokładnie DNA oriC jest zorganizowane przez DNAA, pozostaje zatem ważnym zadaniem dla przyszłych badań. Wgląd w architekturę złożonej inicjacji pomoże wyjaśnić nie tylko, w jaki sposób topi się DNA pochodzenia, ale także w jaki sposób replikująca helikaza jest ładowana kierunkowo na każdą z odsłoniętych pojedynczych nici DNA w rozwiniętym DUE oraz w jaki sposób te zdarzenia są wspomagane przez interakcje helikazy z białka inicjujące i specyficzne białka ładujące.
Archaeal
Początki replikacji archeonów mają niektóre, ale nie wszystkie, cechy organizacyjne bakteryjnego oriC . W przeciwieństwie do bakterii, Archaea często inicjują replikację z wielu źródeł na chromosom (doniesiono o jednym do czterech); jednak źródła archeonów zawierają również wyspecjalizowane regiony sekwencji, które kontrolują funkcję pochodzenia. Elementy te obejmują zarówno kasety rozpoznające początek specyficzne dla sekwencji DNA (ORB lub miniORB), jak i DUE bogate w AT, które jest flankowane przez jeden lub kilka regionów ORB. Elementy ORB wykazują znaczny stopień różnorodności pod względem ich liczby, rozmieszczenia i sekwencji, zarówno wśród różnych gatunków archeonów, jak i różnych pochodzeń w obrębie jednego gatunku. Dodatkowy stopień złożoności wprowadza inicjator Orc1/Cdc6 w archeonach, który wiąże się z regionami ORB. Genomy archeonów zazwyczaj kodują wiele paralogów Orc1/Cdc6, które różnią się zasadniczo pod względem powinowactwa do różnych elementów ORB i które w różny sposób przyczyniają się do aktywności pochodzenia. Na przykład w Sulfolobus solfataricus zmapowano trzy miejsca pochodzenia chromosomów (oriC1, oriC2 i oriC3), a badania biochemiczne ujawniły złożone wzorce wiązania inicjatorów w tych miejscach. Pokrewnym inicjatorem dla oriC1 jest Orc1-1, który łączy się z kilkoma ORB w tym pochodzeniu. OriC2 i oriC3 są związane zarówno przez Orc1-1, jak i Orc1-3. Odwrotnie, trzeci paralog, Orc1-2, odciski stopy we wszystkich trzech miejscach pochodzenia, ale postuluje się, że negatywnie reguluje inicjację replikacji. Dodatkowo wykazano, że białko WhiP, inicjator niespokrewniony z Orc1/Cdc6, również wiąże wszystkie źródła pochodzenia i kieruje aktywnością pochodzenia oriC3 u blisko spokrewnionego Sulfolobus islandicus . Ponieważ źródła archeonów często zawierają kilka sąsiednich elementów ORB, wiele paralogów Orc1/Cdc6 może być jednocześnie rekrutowanych do źródła i w niektórych przypadkach ulegać oligomeryzacji; jednakże, w przeciwieństwie do bakteryjnego DNAA, tworzenie zespołu inicjatora wyższego rzędu nie wydaje się być ogólnym warunkiem wstępnym dla funkcji pochodzenia w domenie archeonów.
Badania strukturalne dostarczyły wglądu w to, jak archaeal Orc1/Cdc6 rozpoznaje elementy ORB i przebudowuje pierwotne DNA. Paralogi Orc1/Cdc6 są białkami dwudomenowymi i składają się z modułu AAA+ ATPazy połączonego z C-końcową fałdą uskrzydloną helisą. Struktury Orc1/Cdc6 skompleksowane z DNA ujawniły, że ORB są wiązane przez monomer Orc1/Cdc6 pomimo obecności odwróconych sekwencji powtórzeń w elementach ORB. Zarówno regiony ATPazy, jak i uskrzydlonej helisy oddziałują z dupleksem DNA, ale stykają się asymetrycznie z palindromową sekwencją powtórzenia ORB, co orientuje Orc1/Cdc6 w określonym kierunku na powtórzeniu. Co ciekawe, elementy ORB lub miniORB flankujące DUE często mają przeciwne bieguny, co przewiduje, że subdomeny wieczka AAA+ i domeny skrzydlatej helisy Orc1/Cdc6 są umieszczone po obu stronach DUE w taki sposób, że są naprzeciw siebie. Ponieważ oba regiony Orc1/Cdc6 wiążą się z replikacyjną helikazą podtrzymującą minichromosom (MCM), ten specyficzny układ elementów ORB i Orc1/Cdc6 jest prawdopodobnie ważny dla załadowania dwóch kompleksów MCM symetrycznie na DUE. Co zaskakujące, podczas gdy sekwencja ORB DNA określa kierunek wiązania Orc1/Cdc6, inicjator nawiązuje stosunkowo niewiele specyficznych dla sekwencji kontaktów z DNA. Jednak Orc1/Cdc6 poważnie osłabia i wygina DNA, co sugeruje, że opiera się na kombinacji zarówno sekwencji DNA, jak i zależnych od kontekstu cech strukturalnych DNA, aby rozpoznać pochodzenie. Warto zauważyć, że parowanie zasad jest utrzymywane w zniekształconym dupleksie DNA po związaniu Orc1/Cdc6 w strukturach krystalicznych, podczas gdy badania biochemiczne przyniosły sprzeczne odkrycia, czy inicjatory archeonów mogą topić DNA podobnie do bakteryjnego DnaA. Chociaż ewolucyjne pokrewieństwo inicjatorów archeonowych i eukariotycznych oraz helikazy replikacyjne wskazuje, że archeiczne MCM jest prawdopodobnie ładowane na dupleksowe DNA (patrz następna sekcja), kolejność czasowa topnienia pochodzenia i obciążenia helikazy, a także mechanizm topnienia DNA pochodzenia u archeonów systemy pozostają zatem do jasnego ustalenia. Podobnie, w jaki sposób helikaza MCM jest ładowana do DNA, należy się zająć w przyszłych badaniach.
Eukariotyczny
Organizacja pochodzenia, specyfikacja i aktywacja u eukariontów są bardziej złożone niż w domenach bakteryjnych lub archeonów i znacznie odbiegają od paradygmatu ustalonego dla inicjacji replikacji prokariotycznej. Duże rozmiary genomu komórek eukariotycznych, które wahają się od 12 Mbp w S. cerevisiae do 3 Gbp u ludzi, wymagają, aby replikacja DNA rozpoczynała się od kilkuset (u pączkujących drożdży) do dziesiątek tysięcy (u ludzi) początków do pełnej replikacji DNA wszystkie chromosomy podczas każdego cyklu komórkowego. Z wyjątkiem S. cerevisiae i pokrewnych gatunków Saccharomycotina , pochodzenie eukariotyczne nie zawiera konsensusowych elementów sekwencji DNA, ale na ich lokalizację wpływają sygnały kontekstowe, takie jak lokalna topologia DNA, cechy strukturalne DNA i środowisko chromatyny. Niemniej jednak, funkcja pochodzenia eukariotycznego nadal opiera się na konserwatywnym kompleksie białka inicjującego, który ładuje replikacyjne helikazy na DNA podczas późnych faz M i G1 cyklu komórkowego, etap znany jako licencjonowanie pochodzenia. W przeciwieństwie do ich bakteryjnych odpowiedników, helikazy replikacyjne u eukariontów są ładowane do pierwotnego dupleksu DNA w nieaktywnej, dwuheksamerycznej postaci i tylko ich podzbiór (10-20% w komórkach ssaków) jest aktywowany podczas dowolnej fazy S , zdarzenia, które są określane jako wypalanie pochodzenia. Lokalizacja aktywnych miejsc pochodzenia eukariotycznego jest zatem określana na co najmniej dwóch różnych poziomach, licencjonowanie miejsca pochodzenia w celu oznaczenia wszystkich potencjalnych miejsc pochodzenia i wyzwalanie miejsca pochodzenia w celu wybrania podzbioru, który umożliwia złożenie maszynerii replikacji i inicjację syntezy DNA. Dodatkowe licencjonowane źródła służą jako kopia zapasowa i są aktywowane tylko po spowolnieniu lub zatrzymaniu pobliskich widełek replikacyjnych, zapewniając, że replikacja DNA może zostać zakończona, gdy komórki napotkają stres replikacyjny. Nadmiar licencjonowanych źródeł pochodzenia oraz ścisła kontrola cyklu komórkowego w zakresie licencjonowania i wyzwalania pochodzenia ucieleśniają dwie ważne strategie zapobiegania niedostatecznej i nadmiernej replikacji oraz zachowania integralności genomów eukariotycznych.
Wczesne badania na S. cerevisiae wykazały, że początki replikacji u eukariontów mogą być rozpoznawane w sposób specyficzny dla sekwencji DNA, analogicznie jak u prokariotów. W drożdżach pączkujących poszukiwanie replikatorów genetycznych doprowadziło do identyfikacji autonomicznie replikujących się sekwencji (ARS), które wspierają wydajną inicjację replikacji DNA pozachromosomalnego DNA. Te regiony ARS mają długość około 100-200 pz i wykazują wieloczęściową organizację, zawierającą elementy A, B1, B2, a czasem B3, które razem są niezbędne dla funkcji pochodzenia. Element A obejmuje konserwatywną sekwencję konsensusową ARS o długości 11 bp (ACS), która w połączeniu z elementem B1 stanowi główne miejsce wiązania heteroheksamerycznego kompleksu rozpoznającego początek (ORC), eukariotycznego inicjatora replikacji. W ORC pięć podjednostek opiera się na konserwatywnej ATP-azie AAA+ i fałdach ze skrzydlatą helisą i łączy się w pierścień pentameryczny, który otacza DNA. W pączkujących drożdżach ORC elementy wiążące DNA w domenach ATPazy i uskrzydlonej helisy, jak również przyległe regiony podstawowych łat w niektórych podjednostkach ORC, są umieszczone w centralnym porach pierścienia ORC, tak że wspomagają sekwencję DNA- specyficzne rozpoznanie ACS w sposób zależny od ATP. Natomiast role elementów B2 i B3 są mniej jasne. Region B2 jest podobny w sekwencji do ACS i sugerowano, że działa jako drugie miejsce wiązania ORC w pewnych warunkach lub jako miejsce wiązania dla replikacyjnego rdzenia helikazy. Odwrotnie, element B3 rekrutuje czynnik transkrypcyjny Abf1, aczkolwiek B3 nie występuje we wszystkich miejscach pochodzenia drożdży pączkujących, a wiązanie Abf1 nie wydaje się być ściśle istotne dla funkcji miejsca pochodzenia.
Rozpoznawanie pochodzenia u eukariontów innych niż S. cerevisiae lub u ich bliskich krewnych nie jest zgodne ze specyficznym dla sekwencji odczytem elementów konserwowanego pochodzenia DNA. Dążenia do wyizolowania specyficznych sekwencji replikatorów chromosomów bardziej ogólnie w gatunkach eukariotycznych, czy to genetycznie, czy przez mapowanie w całym genomie wiązania inicjatora lub miejsc startu replikacji, nie doprowadziły do zidentyfikowania wyraźnych sekwencji konsensusowych w miejscu pochodzenia. Tak więc, specyficzne dla sekwencji interakcje DNA-inicjator w pączkujących drożdżach oznaczają wyspecjalizowany tryb rozpoznawania pochodzenia w tym systemie, a nie archetypowy tryb określania pochodzenia w całej domenie eukariotycznej. Niemniej jednak replikacja DNA inicjuje się w odrębnych miejscach, które nie są losowo rozmieszczone w genomach eukariotycznych, argumentując, że alternatywne sposoby określają lokalizację chromosomów w tych systemach. Mechanizmy te obejmują złożone współzależności między dostępnością DNA, pochyleniem sekwencji nukleotydów (zarówno bogactwo AT, jak i wyspy CpG zostały powiązane z pochodzeniem), pozycjonowaniem nukleosomu , cechami epigenetycznymi , topologią DNA i pewnymi cechami strukturalnymi DNA (np. motywy G4), a także jako białka regulatorowe i zakłócenia transkrypcyjne. Co ważne, właściwości pochodzenia różnią się nie tylko w zależności od pochodzenia organizmu i gatunku, ale niektóre mogą się również zmieniać podczas rozwoju i różnicowania komórek. Locus kosmówki w komórkach pęcherzyka Drosophila stanowi dobrze ugruntowany przykład kontroli przestrzennej i rozwojowej zdarzeń inicjacyjnych. Region ten podlega zależnej od replikacji DNA amplifikacji genu na określonym etapie podczas oogenezy i opiera się na terminowej i specyficznej aktywacji pochodzenia kosmówki, która z kolei jest regulowana przez elementy cis specyficzne dla pochodzenia i kilka czynników białkowych, w tym kompleks Myb, E2F1 i E2F2. Ta kombinatoryczna specyfikacja i wieloczynnikowa regulacja pochodzenia metazoan skomplikowała identyfikację cech ujednolicających, które determinują lokalizację miejsc rozpoczęcia replikacji u eukariontów, bardziej ogólnie.
Aby ułatwić inicjację replikacji i rozpoznawanie miejsca pochodzenia, zespoły ORC z różnych gatunków wyewoluowały wyspecjalizowane domeny pomocnicze, które, jak się uważa, pomagają inicjatorowi w ukierunkowaniu na miejsca pochodzenia chromosomów lub ogólnie do chromosomów. Na przykład podjednostka Orc4 w ORC S. pombe zawiera kilka haków AT, które preferencyjnie wiążą DNA bogaty w AT, podczas gdy w ORC metazoan uważa się, że domena Orc6 podobna do TFIIB pełni podobną funkcję. Białka Metazoan Orc1 zawierają również domenę homologii bromo-sąsiadującej (BAH), która oddziałuje z nukleosomami H4K20me2. Doniesiono, że szczególnie w komórkach ssaków metylacja H4K20 jest wymagana do wydajnej inicjacji replikacji, a domena Orc1-BAH ułatwia asocjację ORC z chromosomami i replikację zależną od pochodzenia wirusa Epsteina-Barra. Dlatego intrygujące jest spekulowanie, że obie obserwacje są mechanicznie powiązane przynajmniej w podzbiorze metazoa, ale ta możliwość musi być dalej zbadana w przyszłych badaniach. Oprócz rozpoznawania pewnych cech DNA lub epigenetycznych, ORC wiąże się również bezpośrednio lub pośrednio z kilkoma białkami partnerskimi, które mogą wspomagać rekrutację inicjatorów, w tym między innymi LRWD1, PHIP (lub DCAF14), HMGA1a. Co ciekawe, donoszono , że Drosophila ORC, podobnie jak jej pączkujący odpowiednik drożdży, wygina DNA i ujemną superzwijanie poprawia wiązanie DNA tego kompleksu, co sugeruje, że kształt DNA i plastyczność mogą wpływać na lokalizację miejsc wiązania ORC w genomach metazoan. Molekularne zrozumienie, w jaki sposób regiony wiążące DNA ORC mogą wspierać odczytywanie właściwości strukturalnych dupleksu DNA w śródstopiakach, a nie specyficznych sekwencji DNA, jak w S. cerevisiae, czeka na informacje strukturalne o wysokiej rozdzielczości dotyczące zespołów inicjatorów śródstopia związanych z DNA. Podobnie, czy i w jaki sposób różne czynniki epigenetyczne przyczyniają się do rekrutacji inicjatorów w układach metazoan, jest słabo zdefiniowane i jest ważnym pytaniem, które należy rozwiązać bardziej szczegółowo.
Po zrekrutowaniu do źródeł ORC i jego kofaktory Cdc6 i Cdt1 kierują odkładaniem się kompleksu utrzymywania minichromosomów 2-7 (Mcm2-7) na DNA. Podobnie jak rdzeń replikacyjnej helikazy archeonów, Mcm2-7 jest ładowany jako podwójny heksamer typu head-to-head na DNA w celu uzyskania licencji pochodzenia. W fazie S kinaza zależna od Dbf4 (DDK) i kinaza zależna od cykliny (CDK) fosforylują kilka podjednostek Mcm2-7 i dodatkowe czynniki inicjacji, aby promować rekrutację koaktywatorów helikazy Cdc45 i GINS, topienie DNA i ostatecznie dwukierunkowe zestaw replikomów w podzbiorze licencjonowanych źródeł. Zarówno w drożdżach, jak i śródstopiakach, miejsca pochodzenia są wolne lub pozbawione nukleosomów, co jest kluczowe dla obciążenia Mcm2-7, co wskazuje, że stan chromatyny w miejscu pochodzenia reguluje nie tylko rekrutację inicjatora, ale także obciążenie helikazy. Permisywne środowisko chromatyny jest ponadto ważne dla aktywacji źródła i jest zaangażowane w regulowanie zarówno wydajności źródła, jak i czasu wypalania początku. Euchromatyczne pochodzenie zazwyczaj zawiera aktywne znaczniki chromatyny, wcześnie się replikuje i jest bardziej wydajne niż późnoreplikujące, heterochromatyczne pochodzenie, które odwrotnie, charakteryzują się represyjnymi znakami. Nic dziwnego, że kilka Remodelers chromatyny i enzymy modyfikujące chromatyny stwierdzono skojarzyć z początków oraz niektórych czynników inicjacji, ale w jaki sposób ich działania wpływają różne imprezy inicjacji replikacji pozostaje w dużej mierze niejasne. Co ciekawe, ostatnio zidentyfikowano również „elementy kontroli wczesnej replikacji” (ECRE) działające w układzie cis, które pomagają regulować czas replikacji i wpływają na architekturę 3D genomu w komórkach ssaków. Zrozumienie mechanizmów molekularnych i biochemicznych, które koordynują tę złożoną wzajemną zależność między organizacją genomu 3D, lokalną i wyższą strukturą chromatyny oraz inicjacją replikacji, jest ekscytującym tematem do dalszych badań.
Dlaczego początki replikacji metazoan odbiegają od paradygmatu rozpoznawania specyficznego dla sekwencji DNA, który określa miejsca rozpoczęcia replikacji u prokariontów i pączkujących drożdży? Obserwacje, że pochodzenie metazoan często znajduje się w tej samej lokalizacji co regiony promotorowe w komórkach Drosophila i ssaków oraz że konflikty replikacja-transkrypcja z powodu kolizji podstawowych mechanizmów molekularnych mogą prowadzić do uszkodzenia DNA sugerują, że właściwa koordynacja transkrypcji i replikacji jest ważna dla utrzymania stabilności genomu. Ostatnie odkrycia wskazują również na bardziej bezpośrednią rolę transkrypcji w wpływaniu na lokalizację pochodzenia, albo poprzez hamowanie ładowania Mcm2-7, albo przez repozycjonowanie załadowanego Mcm2-7 na chromosomach. Niezależne od sekwencji (ale niekoniecznie losowe) wiązanie inicjatora z DNA dodatkowo pozwala na elastyczność w określaniu miejsc ładowania helikazy i, wraz z interferencją transkrypcyjną i zmiennością wydajności aktywacji licencjonowanego pochodzenia, prawdopodobnie determinuje lokalizację pochodzenia i przyczynia się do współregulacji Replikacja DNA i programy transkrypcyjne podczas rozwoju i zmian losu komórki. Modelowanie obliczeniowe zdarzeń inicjacji u S. pombe , a także identyfikacja specyficznego dla typu komórki i regulowanego rozwojowo pochodzenia u metazoan są zgodne z tym poglądem. Jednak duży stopień elastyczności w wyborze miejsca pochodzenia istnieje również wśród różnych komórek w obrębie jednej populacji, aczkolwiek mechanizmy molekularne, które prowadzą do heterogeniczności w wykorzystaniu pochodzenia, pozostają słabo zdefiniowane. Mapowanie pochodzenia w pojedynczych komórkach w systemach metazoan i korelacja tych zdarzeń inicjacji z ekspresją genów w pojedynczej komórce i statusem chromatyny będzie ważne dla wyjaśnienia, czy wybór pochodzenia jest czysto stochastyczny, czy kontrolowany w określony sposób.
Wirusowy
Wirusy często posiadają jedno źródło replikacji.
Różne białka zostały opisane jako zaangażowane w replikację wirusa. Na przykład, wirusy Polyoma wykorzystują polimerazy DNA komórki gospodarza , które przyłączają się do wirusowego początku replikacji, jeśli obecny jest antygen T.
Wariacje
Chociaż replikacja DNA jest niezbędna dla dziedziczenia genetycznego, określone, specyficzne dla miejsca miejsca pochodzenia replikacji nie są technicznie wymagane do powielania genomu, o ile wszystkie chromosomy są kopiowane w całości w celu utrzymania liczby kopii genów. Na przykład, niektóre bakteriofagi i wirusy mogą inicjować replikację DNA przez rekombinację homologiczną niezależnie od dedykowanego pochodzenia. Podobnie archeon Haloferax volcanii wykorzystuje inicjację zależną od rekombinacji, aby zduplikować swój genom, gdy jego endogenne pochodzenie zostanie usunięte. Podobne niekanoniczne zdarzenia inicjacji poprzez replikację indukowaną przerwaniem lub inicjowaną transkrypcją odnotowano w E . coli i S . cerevisiae . Niemniej jednak, pomimo zdolności komórek do utrzymania żywotności w tych wyjątkowych okolicznościach, inicjacja zależna od pochodzenia jest powszechną strategią powszechnie przyjętą w różnych domenach życia.
Ponadto szczegółowe badania inicjacji replikacji koncentrowały się na ograniczonej liczbie systemów modelowych. Szeroko zbadane grzyby i metazoa są członkami supergrupy opisthkont i stanowią jedynie niewielki ułamek krajobrazu ewolucyjnego w domenie eukariotycznej. Stosunkowo niewiele wysiłków skierowano na inne eukariotyczne układy modelowe, takie jak kinetoplastydy czy tetrahymena. Co zaskakujące, badania te ujawniły interesujące różnice zarówno we właściwościach pochodzenia, jak i składzie inicjatora w porównaniu z drożdżami i metazoanami.
Zobacz też
Bibliografia
Ten artykuł został zaadaptowany z następującego źródła na licencji CC BY 4.0 ( 2019 ) ( raporty recenzentów ):
Babatunde Ekundayo; Franziska Bleichert (12 września 2019). „Początki replikacji DNA” . PLOS Genetyka . 15 (9): e1008320. doi : 10.1371/JOURNAL.PGEN.1008320 . ISSN 1553-7390 . PMC 6742236 . PMID 31513569 . Wikidane Q86320168 .
Dalsza lektura
- Lewin B (2004). Geny VIII . Sala Prezydencka. Numer ISBN 978-0-13-144945-9.
Zewnętrzne linki
- Ori-Finder, internetowe oprogramowanie do przewidywania występowania bakterii i archeonów oriC s
- Replikacja + pochodzenie w Narodowej Bibliotece Medycznej USA Medical Subject Headings (MeSH)