Diagnostyka preimplantacyjna - Preimplantation genetic diagnosis

1♂︎ — Plemniki są pobierane od mężczyzny.
1♀︎ — Jaja są pobierane od samicy przez zapłodnienie in vitro.
2a — Plemniki i komórki jajowe zostają zapłodnione.
2b — Powstałe embriony są bezpieczne i obserwowane, aby zobaczyć, które będą się rozwijać.
3a — Zarodki mogą się rozwijać; te, które prosperują, otrzymują identyfikatory.
3b — Na każdym zarodku przeprowadzany jest test genetyczny na daną cechę, a wyniki są dopasowywane do zarodków.
4 — Zarodki bez pożądanej cechy są identyfikowane i odrzucane.
5 —Pozostałym zarodkom pozwala się urosnąć do punktu, w którym można je zaimplantować.
6a — Implantuje się zarodki z pożądaną cechą.
6b — Zarodki prowadzą do zdrowej ciąży.
6c – Rodzą się bliźnięta dwujajowe z pożądaną cechą, nie wyrażoną w ich matce.

Preimplantacyjna diagnostyka genetyczna ( PGD lub PIGD ) to profilowanie genetyczne zarodków przed implantacją (jako forma profilowania zarodków ), a czasem nawet oocytów przed zapłodnieniem . PGD ​​jest traktowane podobnie jak diagnostyka prenatalna . W przypadku stosowania do badań przesiewowych w kierunku określonej choroby genetycznej , jego główną zaletą jest to, że pozwala uniknąć selektywnej aborcji , ponieważ metoda ta z dużym prawdopodobieństwem pozwala na uwolnienie dziecka od rozważanej choroby. PGD ​​jest zatem uzupełnieniem technologii wspomaganego rozrodu i wymaga zapłodnienia in vitro (IVF) w celu uzyskania oocytów lub zarodków do oceny. Zarodki na ogół uzyskuje się poprzez biopsję blastomerów lub blastocyst. Ta ostatnia technika okazała się mniej szkodliwa dla zarodka, dlatego zaleca się wykonanie biopsji około 5 lub 6 dnia rozwoju.

Pierwsza na świecie PGD została przeprowadzona przez Handyside, Kontogianni i Winstona w Hammersmith Hospital w Londynie. Zarodki żeńskie zostały selektywnie przeniesione w pięciu parach zagrożonych chorobą sprzężoną z chromosomem X , co dało dwoje bliźniąt i jedną ciążę pojedynczą.

Termin preimplantacyjne badanie genetyczne ( PGS ) odnosi się do zestawu technik badania, czy zarodki (uzyskane poprzez IVF/ICSI) mają nieprawidłową liczbę chromosomów. Innymi słowy, sprawdza, czy zarodek jest aneuploidalny, czy nie. PGS jest również nazywany skriningiem aneuploidii. PGS zostało przemianowane na preimplantacyjną diagnostykę genetyczną dla aneuploidii (PGD-A) przez Preimplantation Genetic Diagnosis International Society (PGDIS) w 2016 roku.

PGD ​​pozwala na badanie DNA jaj lub zarodków w celu wyselekcjonowania tych, które niosą określone mutacje chorób genetycznych. Jest przydatny w przypadku wcześniejszych zaburzeń chromosomalnych lub genetycznych w rodzinie oraz w kontekście programów zapłodnienia in vitro.

Procedury te można również nazwać preimplantacyjnym profilowaniem genetycznym, aby dostosować się do faktu, że są czasami stosowane na oocytach lub zarodkach przed implantacją z innych powodów niż diagnostyka lub badania przesiewowe.

Procedury wykonywane na komórkach płciowych przed zapłodnieniem można nazwać metodami selekcji oocytów lub selekcji plemników , chociaż metody i cele częściowo pokrywają się z PGD.

Historia

W 1968 r. Robert Edwards i Richard Gardner donieśli o pomyślnej identyfikacji płci blastocyst królików . Dopiero w latach 80. w pełni rozwinął się ludzki IVF, co zbiegło się w czasie z przełomem w technologii bardzo czułej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Handyside, Kontogianni i Winston przeprowadzili pierwsze udane testy w październiku 1989 roku, a pierwsze narodziny w 1990 roku, chociaż wstępne eksperymenty zostały opublikowane kilka lat wcześniej. W tych pierwszych przypadkach do określenia płci pacjentów z chorobami sprzężonymi z chromosomem X zastosowano metodę PCR .

Pierwsze przypadki kliniczne

Elena Kontogianni przygotowywała się do doktoratu w Hammersmith Hospital nad jednokomórkową PCR do określania płci, którą wykonała poprzez amplifikację powtarzającego się regionu chromosomu Y. Właśnie takie podejście zastosowała w przypadku pierwszych na świecie przypadków PGD.

Zarodki żeńskie zostały selektywnie przeniesione w pięciu parach zagrożonych chorobą sprzężoną z chromosomem X, co dało dwa bliźnięta i jedną ciążę pojedynczą. Ponieważ region chromosomu Y amplifikowany przez Kontogianni zawierał wiele powtórzeń, było to bardziej wydajne niż próba amplifikacji unikalnego regionu. Prążek na żelu PCR wskazywał, że zarodek był męski, a brak prążka wskazywał, że zarodek był żeński. Jednak niepowodzenie amplifikacji lub blastomer bezjądrowy również skutkowały brakiem prążka na żelu PCR. Aby zmniejszyć ryzyko błędnej diagnozy, Kontogianni kontynuował wspólną amplifikację sekwencji na X i Y (Kontogianni i wsp., 1991). W tamtym czasie nic nie było wiadomo o wypadaniu alleli, zanieczyszczeniu komórek wzgórka lub niepowodzeniu amplifikacji z pojedynczych komórek. W latach 80. ludzkie zarodki IVF były przenoszone wyłącznie w drugim dniu rozwoju, ponieważ zastosowana pożywka hodowlana nie była w stanie niezawodnie rosnąć zarodków poza tym stadium. Ponieważ biopsja miała być wykonana w trzecim dniu, wszystkie pierwsze diagnozy postawiono w jeden dzień, z przeniesieniem zarodków późnym trzecim dniem. Porównanie transferów w drugim i trzecim dniu wykazało, że nie wpłynie to negatywnie na wskaźniki ciąż. Obawa o zatrzymanie embrionów była tak duża, że ​​niektóre transfery miały miejsce we wczesnych godzinach czwartego dnia, aby embriony zostały usunięte z hodowli tak szybko, jak to możliwe. W Hammersmith było wiele wieczorów, kiedy przeniesienie odbywało się o 1 w nocy czwartego dnia, a naukowcy wracali do laboratorium o 7 rano, aby rozpocząć kolejny przypadek. Winston pomógł przy porodzie większości pierwszych dzieci z PGD.

PGD ​​stała się coraz bardziej popularna w latach 90., kiedy była wykorzystywana do określenia kilku poważnych zaburzeń genetycznych, takich jak anemia sierpowata , choroba Taya-Sachsa , dystrofia mięśniowa Duchenne'a i talasemia beta .

Społeczeństwo

Podobnie jak w przypadku wszystkich interwencji medycznych związanych z reprodukcją człowieka, PGD budzi silne, często sprzeczne opinie na temat akceptacji społecznej, szczególnie ze względu na jej implikacje eugeniczne . W niektórych krajach, takich jak Niemcy, PGD jest dozwolone tylko w celu zapobiegania martwym urodzeniom i chorobom genetycznym, w innych PGD jest dozwolone przez prawo, ale jego działanie jest kontrolowane przez państwo.

Wskazania i zastosowania

PGD ​​służy przede wszystkim do zapobiegania chorobom genetycznym, poprzez selekcję tylko tych zarodków, które nie mają znanego zaburzenia genetycznego. PGD ​​może być również stosowana w celu zwiększenia szans na pomyślną ciążę, dopasowania rodzeństwa w typie HLA w celu bycia dawcą, zmniejszenia predyspozycji do raka oraz do selekcji płci .

Zaburzenia monogeniczne

PGD ​​jest dostępna w przypadku dużej liczby zaburzeń monogenowych – to znaczy zaburzeń spowodowanych tylko jednym genem ( autosomalny recesywny , autosomalny dominujący lub sprzężony z chromosomem X ) – lub chromosomalnych aberracji strukturalnych (takich jak translokacja zrównoważona ). PGD ​​pomaga tym parom identyfikować zarodki z chorobą genetyczną lub anomalią chromosomową, co pozwala uniknąć chorego potomstwa. Najczęściej rozpoznano choroby autosomalne recesywne to mukowiscydoza , beta- talasemii , anemii sierpowatej i rdzeniowy zanik mięśni typu 1. Do najczęstszych chorób dominują dystrofię miotoniczną , choroba Huntingtona i choroba Charcot-Marie-Tooth ; aw przypadku chorób sprzężonych z chromosomem X większość cykli przeprowadza się dla zespołu łamliwego chromosomu X , hemofilii A i dystrofii mięśni Duchenne'a . Chociaż jest to dość rzadkie, niektóre ośrodki zgłaszają PGD dla zaburzeń mitochondrialnych lub dwóch wskazań jednocześnie.

PGD ​​jest obecnie również wykonywana w chorobie zwanej dziedzicznymi mnogimi egzostozami (MHE/MO/HME).

Ponadto istnieją niepłodne pary, które są nosicielami choroby dziedzicznej i wybierają PGD, ponieważ można je łatwo połączyć z leczeniem IVF.

Szanse na ciążę

Zaproponowano preimplantacyjne profilowanie genetyczne (PGP) jako metodę określania jakości zarodka w zapłodnieniu in vitro , w celu wyselekcjonowania zarodka, który wydaje się mieć największe szanse na pomyślną ciążę. Ponieważ jednak wyniki PGP opierają się na ocenie pojedynczej komórki, PGP ma nieodłączne ograniczenia, ponieważ badana komórka może nie być reprezentatywna dla zarodka z powodu mozaikowatości . Co więcej, badanie wykazało, że diagnozy biopsji z tych samych zarodków w dwóch oddzielnych laboratoriach pokrywały się tylko w 50% przypadków.

Przegląd systematyczny i metaanaliza istniejących randomizowanych badań kontrolowanych wykazały, że nie ma dowodów na korzystny wpływ PGP mierzony wskaźnikiem żywych urodzeń . Wręcz przeciwnie, u kobiet w zaawansowanym wieku matki PGP znacznie obniża wskaźnik żywych urodzeń. Wady techniczne, takie jak inwazyjność biopsji i mozaikowość chromosomów, są głównymi czynnikami leżącymi u podstaw nieskuteczności PGP. Na całym świecie donoszono o normalnych, żywych urodzeniu zdrowego potomstwa po transferach zarodków uznanych przez PGP za aneuploidalne.

Alternatywne metody określania jakości zarodków do przewidywania częstości ciąż obejmują mikroskopię oraz profilowanie ekspresji RNA i białek .

Dopasowanie HLA

Typowanie ludzkiego antygenu leukocytowego (HLA) embrionów, aby HLA dziecka pasowało do chorego rodzeństwa, co umożliwia dawstwo komórek macierzystych z krwi pępowinowej . Dziecko jest w tym sensie „ rodzeństwem zbawicielem ” dla dziecka-odbiorcy. W międzyczasie typowanie HLA stało się ważnym wskazaniem PGD w tych krajach, w których zezwala na to prawo. Dopasowanie HLA może być połączone z diagnozą chorób monogenowych, takich jak anemia Fanconiego lub talasemia beta w przypadkach, gdy chore rodzeństwo jest dotknięte tą chorobą, lub wyjątkowo może być przeprowadzone samodzielnie w przypadkach takich jak białaczka u dzieci . Głównym argumentem etycznym przeciwko temu jest możliwe wykorzystywanie dziecka, chociaż niektórzy autorzy utrzymują, że imperatyw Kantowski nie jest naruszony, ponieważ przyszłe dziecko dawcy będzie nie tylko dawcą, ale także ukochaną osobą w rodzinie.

Predyspozycje do raka

Nowszym zastosowaniem PGD jest diagnozowanie chorób o późnym początku i zespołów predyspozycji (rakowych). Ponieważ osoby dotknięte chorobą pozostają zdrowe aż do wystąpienia choroby, często w czwartej dekadzie życia, toczy się debata, czy PGD jest odpowiednia w tych przypadkach. Rozważania obejmują wysokie prawdopodobieństwo rozwoju zaburzeń i możliwość wyleczenia. Na przykład w przypadku zespołów predyspozycji, takich jak mutacje BRCA, które predysponują daną osobę do raka piersi, wyniki są niejasne. Chociaż PGD jest często uważana za wczesną formę diagnostyki prenatalnej, charakter próśb o PGD często różni się od próśb o diagnostykę prenatalną składanych, gdy matka jest już w ciąży. Niektóre z powszechnie akceptowanych wskazań do PGD byłyby nie do zaakceptowania w diagnostyce prenatalnej.

Rozeznanie płci

Preimplantacyjna diagnostyka genetyczna dostarcza metody prenatalnego rozeznania płci jeszcze przed implantacją i dlatego może być określana mianem preimplantacyjnego rozeznania płci . Potencjalne zastosowania preimplantacyjnego rozpoznawania płci obejmują:

  • Uzupełnienie specyficznych testów genów pod kątem zaburzeń monogenowych, które mogą być bardzo przydatne w przypadku chorób genetycznych, których prezentacja jest związana z płcią , takich jak na przykład choroby sprzężone z chromosomem X .
  • Umiejętność przygotowania się na wszelkie zależne od płci aspekty rodzicielstwa.
  • Wybór płci . Ankieta z 2006 roku wykazała, że ​​42 procent klinik oferujących PGD oferuje ją do wyboru płci z powodów niemedycznych. Prawie połowa tych klinik wykonuje to tylko w celu „równoważenia rodziny”, czyli sytuacji, w której para z dwójką lub więcej dzieci jednej płci pragnie dziecka drugiej płci, ale połowa nie ogranicza wyboru płci do równoważenia rodziny. W Indiach praktyka ta jest stosowana do selekcji tylko męskich embrionów, chociaż jest to praktyka nielegalna. Opinie na temat tego, czy dobór płci z powodów pozamedycznych jest akceptowalny z etycznego punktu widzenia, znacznie się różnią, czego przykładem jest fakt, że Zespół Zadaniowy ESHRE nie mógł sformułować jednolitej rekomendacji.

W przypadku rodzin zagrożonych chorobami sprzężonymi z chromosomem X pacjentom zapewnia się pojedynczy test PGD służący do identyfikacji płci. Wybór płci oferuje rozwiązanie dla osób z chorobami sprzężonymi z chromosomem X, które są w trakcie zachodzenia w ciążę. Selekcja potomstwa zarodków żeńskich ma na celu zapobieganie przenoszeniu chorób recesywnych związanych z chromosomem X. Do takich chorób Mendla sprzężonych z chromosomem X należą dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) oraz hemofilia A i B, które rzadko występują u samic, ponieważ potomstwo prawdopodobnie nie odziedziczy dwóch kopii allelu recesywnego. Ponieważ do przeniesienia choroby na potomstwo płci żeńskiej wymagane są dwie kopie zmutowanego allelu X, samice w najgorszym przypadku będą nosicielami choroby, ale niekoniecznie będą miały dominujący gen odpowiedzialny za chorobę. Z drugiej strony, samce wymagają tylko jednej kopii zmutowanego allelu X, aby choroba wystąpiła w ich fenotypie, a zatem męskie potomstwo matki nosicielki ma 50% szans na zachorowanie. Przyczyny mogą obejmować rzadkość występowania choroby lub fakt, że dotknięte nią mężczyźni są upośledzeni reprodukcyjnie. Dlatego też często stosuje się medyczne zastosowania PGD do selekcji potomstwa płci żeńskiej w celu zapobiegania przenoszeniu zaburzeń recesywnych mendlowskich sprzężonych z chromosomem X. Preimplantacyjna diagnostyka genetyczna stosowana do selekcji płci może być stosowana w przypadku zaburzeń niemendlowskich, które występują znacznie częściej u jednej płci. Przed rozpoczęciem procesu PGD w celu zapobiegania tym dziedzicznym zaburzeniom przeprowadza się trzy oceny. W celu walidacji stosowania PGD wybór płci opiera się na powadze dziedzicznej choroby, współczynniku ryzyka u obu płci lub możliwościach leczenia choroby.

Drobne niepełnosprawności

Sondaż z 2006 r. ujawnia, że ​​PGD było czasami wykorzystywane do selekcji embrionów pod kątem obecności określonej choroby lub niepełnosprawności, takiej jak głuchota, aby dziecko dzieliło tę cechę z rodzicami.

Klasyfikacja

W zależności od ocenianych wad wyróżniamy trzy rodzaje PGT:

  • PGT-A : zwany także preimplantacyjnym badaniem genetycznym (PGS). Poprawia wskaźniki ciąż poprzez umożliwienie odrzucania aneuploidów i selekcję zarodków euploidalnych do transferu. Zarodki euploidalne z większym prawdopodobieństwem zagnieżdżą się i rozwiną w zdrową ciążę. NGS i FISH to najczęściej stosowane techniki diagnostyczne monosomii, trisomii i poliploidii.
  • PGT-M : w tym przypadku w zarodku ocenia się choroby monogenowe . Zaburzenia monogeniczne są spowodowane mutacjami jednogenowymi (autosomalne recesywne, autosomalne dominujące, sprzężone z chromosomem X ). Wcześniej do PGT-M stosowano PCR . Jednak ostatnio PGT-M wykorzystuje technologię macierzy i NGS.
  • PGT-SR : uwzględniane są wszystkie nieprawidłowości strukturalne w chromosomie ( translokacje , inwersje , duplikacje , insercje , delecje ). Zastosowano różne techniki: PCR, FISH i NGS.

Aspekty techniczne

PGD ​​jest formą diagnostyki genetycznej wykonywanej przed implantacją. Oznacza to, że oocyty pacjenta powinny być zapłodnione in vitro, a zarodki utrzymywane w hodowli do czasu ustalenia diagnozy. Konieczne jest również wykonanie biopsji tych zarodków w celu uzyskania materiału do postawienia diagnozy. Sama diagnoza może być przeprowadzona za pomocą kilku technik, w zależności od charakteru badanego stanu. Ogólnie rzecz biorąc, metody oparte na PCR są stosowane w przypadku zaburzeń jednogenowych, a FISH w przypadku nieprawidłowości chromosomalnych i określania płci tych przypadków, w których nie jest dostępny protokół PCR dla choroby sprzężonej z chromosomem X. Techniki te należy dostosować do wykonywania na blastomerach i dokładnie przetestować na modelach jednokomórkowych przed zastosowaniem klinicznym. Wreszcie, po wymianie zarodków, nadwyżki zarodków niezmienionych dobrej jakości można poddać kriokonserwacji, rozmrozić i przenieść z powrotem w następnym cyklu.

Pozyskiwanie embrionów

Obecnie wszystkie zarodki PGD są uzyskiwane za pomocą technologii wspomaganego rozrodu , chociaż w przeszłości podejmowano próby stosowania naturalnych cykli i zapłodnienia in vivo, po którym następuje płukanie macicy, a obecnie jest ono w dużej mierze porzucone. W celu uzyskania dużej grupy oocytów pacjentki poddawane są kontrolowanej stymulacji jajników (COH). COH przeprowadza się albo w protokole agonistycznym, z zastosowaniem analogów hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH) do odczulania przysadki, w połączeniu z ludzkimi gonadotropinami menopauzalnymi (hMG) lub rekombinowanym hormonem folikulotropowym (FSH), albo w protokole antagonistycznym z zastosowaniem rekombinowanego FSH w połączeniu z antagonista GnRH zgodnie z kliniczną oceną profilu pacjenta (wiek, wskaźnik masy ciała (BMI), parametry endokrynologiczne). hCG podaje się, gdy w badaniu ultrasonograficznym przezpochwowym widoczne są co najmniej trzy pęcherzyki o średniej średnicy powyżej 17 mm. Pobranie oocytów pod kontrolą USG przezpochwowe zaplanowano na 36 godzin po podaniu hCG. Suplementacja fazy lutealnej polega na codziennym dopochwowym podawaniu 600 µg naturalnego mikronizowanego progesteronu.

Oocyty są starannie usuwane z komórek wzgórka, ponieważ komórki te mogą być źródłem zanieczyszczenia podczas PGD, jeśli zastosuje się technologię opartą na PCR. W większości zgłoszonych cykli zamiast IVF stosuje się docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika (ICSI). Głównymi przyczynami są zapobieganie skażeniu pozostałymi plemnikami przylegającymi do osłonki przejrzystej oraz uniknięcie nieoczekiwanego niepowodzenia zapłodnienia. Zabieg ICSI przeprowadza się na dojrzałych oocytach metafazy II, a zapłodnienie ocenia się po 16–18 godzinach. Rozwój zarodka jest dalej oceniany codziennie przed biopsją i do momentu przeniesienia do macicy kobiety. W fazie rozszczepienia codziennie przeprowadza się ocenę zarodków na podstawie liczby, wielkości, kształtu komórek i szybkości fragmentacji blastomerów. W dniu 4 zarodki oceniano w zależności od stopnia ich zagęszczenia, a blastocysty oceniano pod kątem jakości trofektodermy i masy komórek wewnętrznych oraz stopnia ich ekspansji.

Procedury biopsji

Ponieważ PGD można wykonać na komórkach z różnych stadiów rozwojowych, procedury biopsji różnią się odpowiednio. Teoretycznie biopsję można wykonać na wszystkich etapach przedimplantacyjnych, ale sugerowano tylko trzy: na niezapłodnionych i zapłodnionych oocytach (dla ciał polarnych, PB), trzeciego dnia zarodków w stadium bruzdkowania (dla blastomerów) i na blastocystach (dla komórek trofektodermy). ).

Procedura biopsji zawsze obejmuje dwa etapy: otwarcie osłonki przejrzystej i usunięcie komórek. Istnieją różne podejścia do obu etapów, w tym mechaniczne, chemiczne i fizyczne (kwaśny roztwór Tyrode'a) oraz technologia laserowa do naruszania osłonki przejrzystej, wytłaczania lub aspiracji w celu usunięcia PB i blastomerów oraz przepukliny komórek trofektodermy.

Biopsja ciała polarnego

Polarny biopsji korpus jest pobieranie próbek z korpusu polarny , który jest mały haploidalnej komórki, który jest ukształtowany jednocześnie jako komórki jajowej podczas oogenezy , a które na ogół nie mają zdolności do zapłodnionej komórki . W porównaniu z biopsją blastocysty, biopsja ciała polarnego może potencjalnie być tańsza, mniej szkodliwych skutków ubocznych i bardziej czuła w wykrywaniu nieprawidłowości. Główną zaletą stosowania ciał polarnych w PGD jest to, że nie są one niezbędne do pomyślnego zapłodnienia lub prawidłowego rozwoju embrionalnego, co zapewnia brak szkodliwego wpływu na embrion. Jedną z wad biopsji PB jest to, że dostarcza ona jedynie informacji o udziale matki w zarodku, dlatego można zdiagnozować przypadki zaburzeń dziedziczonych autosomalnie dominująco i sprzężonych z chromosomem X, które są przenoszone wyłącznie przez matkę, a zaburzenia autosomalne recesywne mogą być rozpoznawane tylko częściowo zdiagnozowane. Inną wadą jest zwiększone ryzyko błędu diagnostycznego, na przykład z powodu degradacji materiału genetycznego lub zdarzeń rekombinacji, które prowadzą do heterozygotycznych pierwszych ciał polarnych.

Biopsja ciężka (biopsja blastomerowa)

Biopsję bruzdkową wykonuje się zazwyczaj rano trzeciego dnia po zapłodnieniu, kiedy prawidłowo rozwijające się zarodki osiągają stadium ośmiokomórkowe. Biopsję wykonuje się zwykle na zarodkach z mniej niż 50% fragmentów bezjądrowych i w 8-komórkowym lub późniejszym stadium rozwoju. W osłonie przejrzystej robi się otwór i jeden lub dwa blastomery zawierające jądro są delikatnie aspirowane lub wytłaczane przez otwór. Główną przewagą biopsji na etapie cięcia nad analizą PB jest możliwość badania wkładu genetycznego obojga rodziców. Z drugiej strony stwierdzono, że zarodki w stadium rozszczepienia wykazują wysoki wskaźnik mozaikowatości chromosomów , co stawia pod znakiem zapytania, czy wyniki uzyskane na jednym czy dwóch blastomerach będą reprezentatywne dla reszty zarodka. Z tego powodu niektóre programy wykorzystują połączenie biopsji PB i biopsji blastomerowej. Co więcej, biopsja rozszczepienia, podobnie jak w przypadku biopsji PB, daje bardzo ograniczoną ilość tkanki do diagnozy, co wymaga opracowania technik jednokomórkowego PCR i FISH . Chociaż teoretycznie biopsja PB i biopsja blastocysty są mniej szkodliwe niż biopsja na etapie cięcia, nadal jest to powszechna metoda. Jest stosowany w około 94% cykli PGD zgłoszonych do konsorcjum ESHRE PGD. Głównym powodem jest to, że pozwala na bezpieczniejszą i pełniejszą diagnozę niż biopsja PB i nadal pozostawia wystarczająco dużo czasu na zakończenie diagnozy przed koniecznością wymiany zarodków w macicy pacjentki, w przeciwieństwie do biopsji blastocysty. Spośród wszystkich etapów bruzdkowania, powszechnie uważa się, że optymalnym momentem do biopsji jest stadium ośmiokomórkowe. Jest bezpieczniejsza diagnostycznie niż biopsja PB i, w przeciwieństwie do biopsji blastocysty, pozwala na diagnozę zarodków przed 5 dniem. Na tym etapie komórki są nadal totipotencjalne, a zarodki nie są jeszcze zagęszczane. Chociaż wykazano, że nawet jedną czwartą ludzkiego zarodka można usunąć bez zakłócania jego rozwoju, nadal należy zbadać, czy biopsja jednej lub dwóch komórek koreluje ze zdolnością zarodka do dalszego rozwoju, implantacji i wyrosnąć na ciążę w terminie.

Nie wszystkie metody otwierania osłonki przejrzystej mają taki sam wskaźnik powodzenia, ponieważ procedura stosowana do biopsji może wpływać na dobrostan zarodka i/lub blastomerów. Wiercenie strefowe za pomocą roztworu kwasu Tyrode'a (ZD) porównano z częściowym rozwarstwieniem strefowym (PZD) w celu określenia, która technika doprowadziłaby do bardziej udanych ciąż i miałaby mniejszy wpływ na zarodek i/lub blastomer. ZD wykorzystuje enzym trawienny, taki jak pronaza, co czyni ją metodą wiercenia chemicznego. Chemikalia stosowane w ZD mogą mieć szkodliwy wpływ na zarodek. PZD wykorzystuje szklaną mikroigłę do przecięcia osłonki przejrzystej, co sprawia, że ​​jest to metoda mechaniczna, która zazwyczaj wymaga wprawnych rąk do wykonania zabiegu. W badaniu obejmującym 71 par ZD wykonano w 26 cyklach od 19 par, a PZD w 59 cyklach od 52 par. W analizie jednokomórkowej odsetek powodzeń wyniósł 87,5% w grupie PZD i 85,4% w grupie ZD. Wiek matki, liczba pobranych oocytów, współczynnik zapłodnienia i inne zmienne nie różniły się między grupami ZD i PZD. Stwierdzono, że PZD prowadzi do istotnie wyższego odsetka ciąż (40,7% vs 15,4%), ciąży trwającej (35,6% vs 11,5%) oraz implantacji (18,1% vs 5,7%) niż ZD. Sugeruje to, że zastosowanie mechanicznej metody PZD w biopsjach blastomerowych do preimplantacyjnej diagnostyki genetycznej może być skuteczniejsze niż zastosowanie chemicznej metody ZD. Sukces PZD nad ZD można przypisać temu, że czynnik chemiczny w ZD ma szkodliwy wpływ na zarodek i/lub blastomer. Obecnie dominującą metodą otwierania osłonki przejrzystej jest wiercenie strefowe za pomocą lasera. Korzystanie z lasera jest łatwiejszą techniką niż użycie środków mechanicznych lub chemicznych. Jednak wiercenie laserowe może być szkodliwe dla zarodka i jest bardzo kosztowne dla laboratoriów zapłodnienia in vitro, zwłaszcza gdy PGD nie jest powszechnym procesem w dzisiejszych czasach. PZD może być realną alternatywą dla tych kwestii.

Biopsja blastocysty

Próbując przezwyciężyć trudności związane z technikami jednokomórkowymi, sugerowano biopsję zarodków w stadium blastocysty, zapewniając większą ilość materiału wyjściowego do diagnozy. Wykazano, że jeśli więcej niż dwie komórki są obecne w tej samej probówce, główne problemy techniczne jednokomórkowego PCR lub FISH praktycznie znikną. Z drugiej strony, podobnie jak w przypadku biopsji na etapie cięcia, różnice chromosomalne między wewnętrzną masą komórkową a trofektodermą (TE) mogą zmniejszać dokładność diagnozy, chociaż ta mozaikowość jest mniejsza niż w przypadku zarodki.

Wykazano, że biopsja TE jest skuteczna w modelach zwierzęcych, takich jak króliki, myszy i naczelne. Badania te pokazują, że usunięcie niektórych komórek TE nie jest szkodliwe dla dalszego rozwoju zarodka in vivo .

Biopsję ludzkiego stadium blastocysty pod kątem PGD wykonuje się, wykonując otwór w ZP w trzecim dniu hodowli in vitro . Dzięki temu rozwijający się TE może wystawać po blastulacji, ułatwiając biopsję. W piątym dniu po zapłodnieniu z TE wycina się około pięciu komórek za pomocą szklanej igły lub energii lasera, pozostawiając zarodek w dużej mierze nienaruszony i bez utraty wewnętrznej masy komórkowej. Po postawieniu diagnozy zarodki można wymienić podczas tego samego cyklu lub poddać kriokonserwacji i przenieść w kolejnym cyklu.

Takie podejście ma dwie wady ze względu na etap, na którym jest ono wykonywane. Po pierwsze, tylko około połowa zarodków przedimplantacyjnych osiąga stadium blastocysty. Może to ograniczyć liczbę blastocyst dostępnych do biopsji, ograniczając w niektórych przypadkach powodzenie PGD. Mc Arthur i współpracownicy podają, że 21% rozpoczętych cykli PGD nie miało zarodka nadającego się do biopsji TE. Liczba ta jest około czterokrotnie wyższa niż średnia prezentowana przez dane konsorcjum ESHRE PGD, gdzie dominującymi metodami są PB i biopsja na etapie cięcia. Z drugiej strony opóźnienie biopsji do tego późnego etapu rozwoju ogranicza czas na wykonanie diagnozy genetycznej, co utrudnia powtórne wykonanie drugiej rundy PCR lub rehybrydyzację sond FISH przed przeniesieniem zarodków z powrotem do pacjenta.

Próbkowanie komórek wzgórka

Pobieranie próbek komórek wzgórka może być wykonywane oprócz pobierania próbek ciał polarnych lub komórek z zarodka. Ze względu na interakcje molekularne między komórkami wzgórka a oocytem, można przeprowadzić profilowanie ekspresji genów komórek wzgórka w celu oszacowania jakości oocytu i wydajności protokołu hiperstymulacji jajników i może pośrednio przewidywać aneuploidię , rozwój zarodka i wyniki ciąży.

Nieinwazyjne preimplantacyjne genetyczne metody przesiewowe (NIPGS)

Tradycyjna biopsja zarodka może być inwazyjna i kosztowna. Dlatego naukowcy prowadzą nieustanne poszukiwania mniej inwazyjnych metod preimplantacyjnych testów genetycznych. Badania nad nowymi genetyki nieinwazyjne przedimplantacyjnej metod (NIPGS), takie jak przesiewowych blastocel mediów płynnych i zarodka spędzonych zostały niedawno opublikowane jako alternatywa dla tradycyjnych metod

Genetyczne badania przesiewowe przed implantacją z użyciem płynu Blastocoel (BF) Podczas normalnego procesu zapłodnienia in vitro, dobra praktyka witryfikacji zarodków zwiększa szansę na zdrową ciążę. Podczas procesu witryfikacji rozwinięty podmuch jest odwadniany i wraz z jego wnęką blastocoel zapada się do procesu zamrażania. Istnieje wiele metod, które zostały użyte w celu ułatwienia zapadania się, w tym impuls laserowy, wielokrotne mikropipetowanie, nakłucie mikroigłowe lub mikroodsysanie. Zwykle ten płyn zostałby wtedy wyrzucony, jednak w przypadku preimplantacyjnych testów genetycznych BL, płyn ten jest zapisywany, a następnie testowany pod kątem DNA. Uważa się, że to DNA pochodzi z komórek, które przeszły apoptozę znalezioną w rozwijającym się zarodku

Preimplantacyjne testy genetyczne przy użyciu kondycjonowanego podłoża hodowlanego Blastocyst (BCCM) Inna metoda mniej inwazyjnych preimplantacyjnych testów genetycznych obejmuje testowanie podłoża hodowlanego, w którym rozwinął się zarodek. Zauważono, że zarodek uwalnia fragmenty DNA z komórek, które zmarły w okresie inkubacji . Dzięki tej wiedzy naukowcy doszli do wniosku, że mogą wyizolować to DNA i wykorzystać je do preimplantacyjnych testów genetycznych

Korzyści i konsekwencje mniej inwazyjnych badań genetycznych przed implantacją Chociaż istnieją sprzeczne dowody na to, czy bardziej tradycyjne metody badań genetycznych przed implantacją są szkodliwe dla zarodka, istnieją nowsze, mniej inwazyjne i równie skuteczne metody badań. W tym celu zwróciliśmy się do preimplantacyjnych testów genetycznych z użyciem płynu blastocoel i zużytego podłoża zarodkowego. Jednym z problemów tych alternatyw jest minimalna ilość DNA, z którą trzeba pracować. Innym bardzo ważnym pytaniem jest to, czy ta technologia jest dokładna. Oba te obawy zostały niedawno odniesione przez Kuzniecow. Kuznyetsov zdecydował się zastosować obie metody, łącząc ilość DNA pobranego z obu technik. Następnie po wyizolowaniu DNA użyto go do preimplantacyjnych testów genetycznych. Wyniki pokazały, że gdy obie metody Blastocyst Fluid i Embryo Spent Media zostały użyte w połączeniu, wykazały one współczynnik zgodności dla całej kopii chromosomu na poziomie 87,5% w porównaniu z trofektodermą, 96,4% w porównaniu do całej Blastocysty (złoty standard). Dodatkowo po amplifikacji tą nową metodą byli w stanie wytworzyć 25,0-54,0 ng/ul DNA na próbkę. Tradycyjnymi metodami, takimi jak trofektoderma, zebrali od 10 do 44 ng/ul

Techniki analizy genetycznej

Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH) i reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to dwie powszechnie stosowane technologie pierwszej generacji w PGD. PCR jest na ogół stosowany do diagnozowania zaburzeń monogenowych, a FISH do wykrywania nieprawidłowości chromosomalnych (na przykład przesiewowych badań aneuploidii lub translokacji chromosomowych). W ciągu ostatnich kilku lat różne postępy w badaniach PGD pozwoliły na poprawę kompleksowości i dokładności dostępnych wyników w zależności od zastosowanej technologii. Ostatnio opracowano metodę pozwalającą na utrwalanie płytek metafazowych z pojedynczych blastomerów. Ta technika w połączeniu z FISH, m-FISH może dawać bardziej wiarygodne wyniki, ponieważ analiza jest wykonywana na całych płytkach metafazowych

Oprócz FISH i PCR, sekwencjonowanie genomu pojedynczej komórki jest testowane jako metoda preimplantacyjnej diagnostyki genetycznej. Charakteryzuje to pełną sekwencję DNA genomu zarodka.

RYBA

FISH jest najczęściej stosowaną metodą określania budowy chromosomów zarodka. W przeciwieństwie do kariotypowania może być stosowany na chromosomach międzyfazowych, dzięki czemu może być stosowany na próbkach PB, blastomerów i TE. Komórki są utrwalane na szkiełkach mikroskopowych i hybrydyzowane z sondami DNA. Każda z tych sond jest specyficzna dla części chromosomu i jest oznaczona fluorochromem.

Dual FISH uznano za skuteczną technikę określania płci ludzkich zarodków przedimplantacyjnych oraz dodatkową zdolność do wykrywania nieprawidłowej liczby kopii chromosomów, co nie jest możliwe poprzez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR).

Obecnie dostępny jest duży panel sond dla różnych segmentów wszystkich chromosomów, ale ograniczona liczba różnych fluorochromów ogranicza liczbę sygnałów, które można analizować jednocześnie.

Rodzaj i liczba sond stosowanych w próbce zależy od wskazania. W celu określenia płci (stosowanego na przykład, gdy protokół PCR dla danego zaburzenia związanego z chromosomem X nie jest dostępny), stosuje się sondy dla chromosomów X i Y wraz z sondami dla jednego lub więcej autosomów jako wewnętrzną kontrolę FISH. Można dodać więcej sond w celu wykrycia aneuploidii, szczególnie takich, które mogą prowadzić do żywotnej ciąży (takiej jak trisomia 21). Zastosowanie sond dla chromosomów X, Y, 13, 14, 15, 16, 18, 21 i 22 ma potencjał wykrycia 70% aneuploidii występujących w spontanicznych aborcjach.

Aby móc analizować więcej chromosomów na tej samej próbce, można przeprowadzić do trzech kolejnych rund FISH. W przypadku rearanżacji chromosomów należy wybrać specyficzne kombinacje sond, które flankują interesujący region. Uważa się, że technika FISH ma poziom błędu między 5 a 10%.

Głównym problemem stosowania FISH do badania budowy chromosomów embrionów jest podwyższony wskaźnik mozaikowatości obserwowany na etapie preimplantacji człowieka. Metaanaliza ponad 800 zarodków wykazała, że ​​około 75% zarodków przedimplantacyjnych to mozaiki mozaikowe, z czego około 60% to mozaika diploidalno-aneuploidalna, a około 15% mozaika aneuploidalna. Li i współpracownicy stwierdzili, że 40% embrionów zdiagnozowanych jako aneuploidalne w dniu 3 okazało się mieć euploidalną masę komórek wewnętrznych w dniu 6. Staessen i współpracownicy stwierdzili, że 17,5% embrionów zdiagnozowanych jako nieprawidłowe podczas PGS i poddanych po ponownej analizie PGD, stwierdzono również, że zawierają normalne komórki, a 8,4% stwierdzono rażąco prawidłowe. W związku z tym kwestionowano, czy jedna lub dwie komórki badane z zarodka są rzeczywiście reprezentatywne dla całego zarodka i czy żywotne zarodki nie są odrzucane ze względu na ograniczenia techniki.

PCR

Kary Mullis pomyślany PCR w 1985 jako in vitro uproszczone odwzorowanie in vivo procesu replikacji DNA . Wykorzystując chemiczne właściwości DNA oraz dostępność termostabilnych polimeraz DNA , PCR pozwala na wzbogacenie próbki DNA o określoną sekwencję. PCR daje możliwość uzyskania dużej ilości kopii danego odcinka genomu, umożliwiając dalszą analizę. Jest to bardzo czuła i specyficzna technologia, dzięki czemu nadaje się do wszelkiego rodzaju diagnostyki genetycznej, w tym PGD. Obecnie istnieje wiele różnych odmian samego PCR, jak również różnych metod analizy a posteriori produktów PCR.

Stosując PCR w PGD, stajemy przed problemem, który nie istnieje w rutynowej analizie genetycznej: znikome ilości dostępnego genomowego DNA. Ponieważ PGD jest przeprowadzana na pojedynczych komórkach, PCR musi zostać zaadaptowany i doprowadzony do jego fizycznych granic i użyć minimalnej możliwej ilości matrycy: która jest jedną nicią. Wiąże się to z długim procesem dostrajania warunków PCR i podatnością na wszystkie problemy konwencjonalnego PCR, ale o kilka stopni nasilone. Duża liczba potrzebnych cykli PCR i ograniczona ilość matrycy sprawiają, że jednokomórkowy PCR jest bardzo wrażliwy na zanieczyszczenia. Innym problemem specyficznym dla jednokomórkowej PCR jest zjawisko wypadania alleli (ADO). Polega na losowym braku amplifikacji jednego z alleli obecnych w próbce heterozygotycznej. ADO poważnie podważa wiarygodność PGD, ponieważ heterozygotyczny embrion może być zdiagnozowany jako dotknięty lub niezmieniony, w zależności od tego, który allel nie uległby amplifikacji. Jest to szczególnie niepokojące w PGD w przypadku zaburzeń autosomalnych dominujących, gdzie ADO dotkniętego allelu może prowadzić do przeniesienia dotkniętego zarodka.

Opracowano kilka testów opartych na PCR dla różnych chorób, takich jak geny powtórzeń tripletowych związane z dystrofią miotoniczną i łamliwy chromosom X w pojedynczych ludzkich komórkach somatycznych, gametach i zarodkach.

NGS

Od 2014 roku w PGT prowadzone jest sekwencjonowanie nowej generacji (NGS). NGS, znany również jako masowe sekwencjonowanie równoległe, to grupa technik zdolnych do sekwencjonowania dużych ilości DNA przy rozsądnych kosztach i czasie. Może dać nam ogólną perspektywę całego genomu embrionalnego, w tym mitochondrialnego . Techniki te opierają się na sekwencjonowaniu krótkich odczytów po około 400 zasad każdy i nakładaniu tych odczytów z potężnym oprogramowaniem do wyrównywania.

Podobnie NGS pozwala nam również wykryć aneuploidie w 24 chromosomach i defekty pojedynczego genu, gdy istnieje wskazanie od rodziców nosicieli. Główną zaletą jest to, że NGS może połączyć wykrywanie zarówno aneuploidii, jak i chorób monogenowych z pojedynczą biopsją, a także obniżyła przystępne koszty, czyniąc ją bardziej dostępną.

Dwa przykłady NGS to pirosekwencjonowanie i odwracalny terminator barwnika .

Ustalenie diagnozy

Postawienie diagnozy w PGD nie zawsze jest proste. Kryteria stosowane przy wyborze zarodków do zastąpienia po wynikach FISH lub PCR nie są jednakowe we wszystkich ośrodkach. W przypadku FISH, w niektórych ośrodkach zastępowane są tylko zarodki, które okazały się chromosomalnie prawidłowe (tj. wykazujące dwa sygnały dla gonosomów i analizowanych autosomów) po analizie jednego lub dwóch blastomerów oraz po analizie dwóch blastomerów wyniki powinny być zgodne. Inne ośrodki argumentują, że zarodki zdiagnozowane jako monosomiczne mogą zostać przeniesione, ponieważ fałszywa monosomia (tj. utrata jednego sygnału FISH w normalnej diploidalnej komórce) jest najczęściej występującą błędną diagnozą. W takich przypadkach nie ma ryzyka ciąży aneuploidalnej, a normalne zarodki diploidalne nie są tracone do transferu z powodu błędu FISH. Ponadto wykazano, że zarodki zdiagnozowane jako monosomiczne w 3 dniu (z wyjątkiem chromosomów X i 21) nigdy nie rozwijają się do blastocysty, co koreluje z faktem, że monosomie te nigdy nie są obserwowane w trwających ciążach.

Diagnoza i błędna diagnoza w PGD przy użyciu PCR zostały matematycznie modelowane w pracach Navidi i Arnheim oraz Lewisa i współpracowników. Najważniejszym wnioskiem płynącym z tych publikacji jest to, że do skutecznej i dokładnej diagnozy zarodka potrzebne są dwa genotypy. Może to być oparte na sprzężonych genotypach markera i choroby z jednej komórki lub na genotypach markera/choroby dwóch komórek. Ciekawym aspektem badanym w tych pracach jest szczegółowe badanie wszystkich możliwych kombinacji alleli, które mogą pojawić się w wynikach PCR dla konkretnego zarodka. Autorzy wskazują, że niektóre z genotypów, które można uzyskać podczas diagnozy, mogą nie być zgodne z oczekiwanym wzorcem genotypów powiązanych markerów, ale nadal zapewniają wystarczającą pewność co do niezmienionego genotypu zarodka. Chociaż te modele są uspokajające, opierają się na modelu teoretycznym i generalnie diagnoza jest ustalana na bardziej konserwatywnych podstawach, aby uniknąć możliwości błędnej diagnozy. Gdy podczas analizy komórki pojawiają się nieoczekiwane allele, w zależności od obserwowanego genotypu, uważa się, że albo przeanalizowano nieprawidłową komórkę, albo nastąpiło zanieczyszczenie i nie można ustalić diagnozy. Przypadek, w którym nieprawidłowość analizowanej komórki może być jednoznacznie zidentyfikowana, to sytuacja, w której przy użyciu multipleksowej reakcji PCR dla sprzężonych markerów w próbce znajdują się tylko allele jednego z rodziców. W takim przypadku komórkę można uznać za niosącą monosomię dla chromosomu, na którym znajdują się markery, lub ewentualnie za haploidalną. Pojawienie się pojedynczego allelu wskazującego na zaatakowany genotyp jest uważane za wystarczające do zdiagnozowania zarodka jako zaatakowanego, a do wymiany preferowane są zarodki, u których zdiagnozowano całkowicie niezmieniony genotyp. Chociaż ta polityka może prowadzić do mniejszej liczby zdrowych zarodków nadających się do transferu, uważa się ją za lepszą niż możliwość błędnej diagnozy.

Preimplantacyjne haplotypowanie genetyczne

Preimplantacyjna haplotypu genetyczny (PGH) jest techniką PGD czym haplotyp od markerów genetycznych , które związki statystycznego choroby docelowe identyfikuje zamiast mutacji powodujących chorobę.

Po ustaleniu panelu powiązanych markerów genetycznych dla konkretnej choroby, można go wykorzystać dla wszystkich nosicieli tej choroby. W przeciwieństwie do tego, ponieważ nawet choroba monogenowa może być spowodowana wieloma różnymi mutacjami w obrębie zaatakowanego genu, konwencjonalne metody PGD oparte na znalezieniu określonej mutacji wymagają testów specyficznych dla mutacji. W ten sposób PGH rozszerza dostępność PGD do przypadków, w których testy specyficzne dla mutacji są niedostępne.

PGH ma również przewagę nad FISH, ponieważ FISH zwykle nie jest w stanie odróżnić zarodków posiadających zrównoważoną formę translokacji chromosomowej od tych, które posiadają homologiczne normalne chromosomy. Ta niezdolność może być poważnie szkodliwa dla postawionej diagnozy. PGH może dokonać rozróżnienia, którego FISH często nie potrafi. PGH robi to za pomocą markerów polimorficznych, które są lepiej przystosowane do rozpoznawania translokacji. Te polimorficzne markery są w stanie odróżnić zarodki, które przenoszą normalne, zrównoważone i niezrównoważone translokacje. FISH wymaga również większego utrwalania komórek do analizy, podczas gdy PGH wymaga jedynie przeniesienia komórek do probówek do reakcji łańcuchowej polimerazy. Transfer komórek jest prostszą metodą i pozostawia mniej miejsca na niepowodzenie analizy.

Transfer zarodków i kriokonserwacja nadwyżek zarodków

Transfer zarodków jest zwykle wykonywany w trzecim lub piątym dniu po zapłodnieniu, czas zależy od technik stosowanych do PGD i standardowych procedur ośrodka IVF, w którym jest wykonywany.

Wraz z wprowadzeniem w Europie polityki transferu pojedynczego zarodka, której celem jest zmniejszenie częstości występowania ciąż mnogich po ART, w macicy wymieniany jest zwykle jeden zarodek lub wczesna blastocysta. HCG w surowicy oznacza się w 12. dobie. W przypadku stwierdzenia ciąży wykonuje się badanie USG po 7 tygodniach w celu potwierdzenia obecności bicia serca płodu. Parom generalnie zaleca się poddanie się PND ze względu na, choć niskie, ryzyko błędnej diagnozy.

Nie jest niczym niezwykłym, że po PGD jest więcej zarodków nadających się do przeniesienia z powrotem do kobiety, niż jest to konieczne. Dla par poddawanych PGD zarodki te są bardzo cenne, ponieważ obecny cykl pary może nie prowadzić do zajścia w ciążę. Kriokonserwacja zarodków, a następnie rozmrażanie i zastępowanie zarodków może dać im drugą szansę na zajście w ciążę bez konieczności ponownego wykonywania uciążliwych i kosztownych procedur ART i PGD.

Skutki uboczne dla zarodka

Według dr Michaela Tuckera, dyrektora naukowego i głównego embriologa w Georgia Reproductive Specialists w Atlancie, PGD/PGS to inwazyjna procedura, która wymaga poważnego rozważenia. Według Sereny H. Chen, MD, endokrynologa reprodukcyjnego z New Jersey z IRMS Reproductive Medicine w Saint Barnabas, jedno z zagrożeń związanych z PGD obejmuje uszkodzenie zarodka podczas procedury biopsji (która z kolei niszczy zarodek jako całość). Innym zagrożeniem jest kriokonserwacja, w której zarodek jest przechowywany w stanie zamrożonym, a następnie rozmrażany do zabiegu. Około 20% rozmrożonych zarodków nie przeżywa. Przeprowadzono badania wskazujące, że biopsja embrionów ma mniejszy wskaźnik przeżywalności po kriokonserwacji. Inne badanie sugeruje, że PGS z biopsją stopnia rozszczepienia skutkuje znacznie niższym wskaźnikiem żywych urodzeń u kobiet w zaawansowanym wieku matki. Również inne badanie zaleca ostrożność i długoterminową obserwację, ponieważ PGD/PGS zwiększa śmiertelność okołoporodową w ciążach mnogich.

W badaniu na modelu myszy, PGD przypisano różnym długoterminowym zagrożeniom, w tym przyrostowi masy ciała i spadkowi pamięci; analiza proteomiczna mózgów dorosłych myszy wykazała znaczące różnice między grupami poddanymi biopsji i grupami kontrolnymi, z których wiele jest ściśle związanych z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Alzheimera i zespół Downa.

Zagadnienia etyczne

PGD ​​podniosła kwestie etyczne, chociaż takie podejście może zmniejszyć zależność od deselekcji płodu w czasie ciąży. Technika ta może być wykorzystana do prenatalnego rozeznania płci zarodka, a zatem potencjalnie może być wykorzystana do selekcji zarodków jednej płci zamiast drugiej w kontekście „ równoważenia rodziny ”. W przyszłości może być możliwe dokonanie innych wyborów „selekcji społecznej”, które wprowadzają problemy społeczno-ekonomiczne. Do macicy kobiety wszczepiane są tylko nienaruszone zarodki; te dotknięte chorobą są albo odrzucane, albo przekazywane na cele naukowe.

PGD ​​ma potencjał do badania przesiewowych problemów genetycznych niezwiązanych z koniecznością medyczną , takich jak inteligencja i uroda, oraz pod kątem negatywnych cech, takich jak niepełnosprawność. Społeczność medyczna uznała to za sprzeczną z intuicją i kontrowersyjną sugestię. Perspektywa „ dziecka projektanta ” jest ściśle powiązana z techniką PGD, wywołując obawę, że wzrastająca częstotliwość badań genetycznych przesunie się w kierunku nowoczesnego ruchu eugenicznego . Z drugiej strony, zasada prokreacyjnego dobroczynności proponuje, który jest domniemany obowiązek moralny z rodzicami w stanie wybrać, aby ich dzieci faworyzować tych, oczekuje się, że mają najlepsze życie. Argumentem przemawiającym za tą zasadą jest to, że cechy (takie jak empatia, pamięć itp.) są „środkami uniwersalnymi” w sensie posiadania instrumentalnej wartości w realizacji wszelkich planów życiowych, jakie może mieć dziecko. Walter Veit twierdził, że nie ma wewnętrznej moralnej różnicy między „tworzeniem” a „wybieraniem” życia, co czyni z eugeniki naturalną konsekwencję zaakceptowania zasady dobroczynności prokreacyjnej.

Niepełnosprawni

W 2006 roku trzy procent klinik PGD w USA zgłosiło, że wybrało embrion ze względu na niepełnosprawność. Zaangażowane pary zostały oskarżone o celowe krzywdzenie dziecka. Ta praktyka jest godna uwagi w karłowatości, gdzie rodzice celowo tworzą dziecko, które jest karłem. Przy wyborze zbawiciela rodzeństwa, które zapewni pasujący przeszczep szpiku kostnego już istniejącemu choremu dziecku, pojawiają się problemy, w tym utowarowienie i dobro dziecka dawcy.

Opierając się na wyniku jednej komórki z zarodka wielokomórkowego, PGD działa przy założeniu, że ta komórka jest reprezentatywna dla pozostałej części zarodka. Może tak nie być, ponieważ częstość występowania mozaikowatości jest często stosunkowo wysoka. Czasami PGD może skutkować fałszywie ujemnym wynikiem prowadzącym do akceptacji nieprawidłowego zarodka lub fałszywie dodatnim wynikiem prowadzącym do odznaczenia prawidłowego zarodka.

Innym problematycznym przypadkiem są przypadki pożądanego nieujawniania wyników PGD dla niektórych zaburzeń genetycznych, które mogą jeszcze nie być widoczne u rodzica, takich jak choroba Huntingtona . Stosuje się go, gdy pacjenci nie chcą znać swojego statusu nosicielstwa, ale chcą mieć pewność, że mają potomstwo wolne od choroby. Procedura ta może postawić praktyków w wątpliwych sytuacjach etycznych, np. gdy nie ma zdrowych, nienaruszonych zarodków do transferu i trzeba przeprowadzić próbny transfer, aby pacjent nie podejrzewał, że jest nosicielem. Grupa zadaniowa ESHRE ds. etyki obecnie zaleca stosowanie testów wykluczających. Testy wykluczające opierają się na analizie sprzężeń z markerami polimorficznymi, w których można ustalić rodzicielskie i dziadkowe pochodzenie chromosomów. W ten sposób zastępowane są tylko zarodki, które nie zawierają chromosomu pochodzącego od dotkniętego dziadka, co pozwala uniknąć konieczności wykrycia samej mutacji.

Ze względu na delikatność problemu, jak pokazują powyższe przypadki, diagnostyka preimplantacyjna wywołała bogatą debatę w środowisku akademickim i poza nim. o „istnieniu i nieistnieniu”. To znaczy, jeśli chodzi o możliwą niekorzystną selekcję embrionów, które mogą rozwinąć „niepełnosprawność”, taką jak głuchota. Zgodnie z tym argumentem, jeśli jedyne dwie możliwe alternatywy to „przyjście na świat” lub „nieprzyjście na świat”, przyznanie im prawa do przyjścia na świat jest lepsze niż alternatywa nieistnienia. Innym szeroko stosowanym argumentem za odrzuceniem praktyki „Preimplantation Genetic Diagnosis” jest myślenie o znaczeniu terminu „niepełnosprawność” (Bickenach i Chatterji, 2003). Argumentem na poparcie tego pomysłu jest to, że „niepełnosprawność” jest zdeterminowana przez konstrukcję społeczną dotyczącą pojęcia niepełnosprawności. Z jednej strony język medycyny opisuje niepełnosprawność jako coś, czego funkcje odbiegają od normalnego funkcjonowania. Z drugiej jednak strony znaczna część społeczności osób niepełnosprawnych podkreśla, że ​​niepełnosprawność jest często determinowana przez sposób, w jaki społeczeństwo strukturalizuje świat. Świat stworzony dla określonego typu osoby. W tym sensie ci sami ludzie, którzy podkreślają to przesłanie, starają się podkreślić względność pojęcia „normalności” lub „zdrowia”. Zależą one od czasu, miejsca i społeczeństwa. W tym świetle argument jest taki, że nie powinniśmy unikać narodzin osób niepełnosprawnych – poprzez diagnostykę genetyczną preimplantacyjną – ale powinniśmy dać sobie odpowiedź na pytanie: jak zdecydować, co jest niepełnosprawnością, aby umożliwić PGD. Z drugiej strony, jeśli chodzi o argumenty przemawiające za diagnostyką preimplantacyjną, w piśmiennictwie zwraca się uwagę na trzy najczęstsze typy argumentów. Pierwszy rodzaj argumentów jest wysuwany głównie przez część środowiska akademickiego, która uważa, że ​​niepełnosprawność/zaburzenie prawdopodobnie implikuje zmniejszone prawdopodobieństwo kwitnienia dla nienarodzonego dziecka. Tak więc ten rodzaj argumentacji jest ogólnie związany z ideą szans związanych z życiem jednostki, szans, które, jeśli zostaną wykorzystane, mogą sprawić, że życie jednostki będzie warte przeżycia. skupia się przede wszystkim na obowiązkach rodziców w odniesieniu do ludzkiego rozkwitu jednostki. Argument ten opiera się na założeniu, że rodzice mają obowiązek i odpowiedzialność za zapewnienie nienarodzonemu dziecku minimalnych warunków życia, które można spełnić. Wreszcie ostatnia kategoria argumentacji to taka, która podkreśla wagę sprowadzania osób niepełnosprawnych/zaburzeń na świat z uwzględnieniem tego, jak bardzo mogą one przyczynić się do społeczno-ekonomicznego rozwoju społeczeństwa. Albo raczej ten argument odnosi się do faktu, że osoby te nie byłyby w stanie przyczynić się do poprawy status quo i dobrobytu społeczeństwa jako całości.

Cechy interpłciowe

PGD ​​pozwala na dyskryminację osób z cechami interpłciowymi . Georgiann Davis twierdzi, że taka dyskryminacja nie uwzględnia faktu, że wiele osób z cechami interpłciowymi prowadziło pełne i szczęśliwe życie. Morgan Carpenter zwraca uwagę na pojawienie się kilku odmian międzypłciowych na liście Human Fertilization and Embryology Authority „poważnych” „stanów genetycznych”, które mogą być wykluczone w Wielkiej Brytanii, w tym niedoboru 5 alfa reduktazy i zespołu niewrażliwości na androgeny , cech widocznych w elitarnych sportowców i „pierwszym na świecie otwarcie burmistrzem interpłciowym ”. Organizacja Intersex International Australia wezwała Australijską Narodową Radę ds. Zdrowia i Badań Medycznych do zakazania takich interwencji, zauważając „bliskie uwikłanie statusu interpłciowego, tożsamości płciowej i orientacji seksualnej w społeczne rozumienie płci i normy płciowe oraz w literaturze medycznej i socjologii medycznej ”.

W 2015 r. Rada Europy opublikowała dokument dotyczący praw człowieka i osób interpłciowych , w którym zauważono:

Prawo osób interpłciowych do życia może zostać naruszone w dyskryminującej „doborze płci” i „preimplantacyjnej diagnozie genetycznej, innych formach testowania i selekcji pod kątem określonych cech”. Taka deselekcja lub selektywne aborcje są niezgodne z normami etycznymi i prawami człowieka ze względu na dyskryminację, której dopuszczają się osoby interpłciowe ze względu na ich cechy płciowe.

Zbawiciel rodzeństwo

PGD ​​w połączeniu z dopasowaniem HLA (antygen ludzkich leukocytów) umożliwia parom selekcję embrionów, które nie są dotknięte chorobą genetyczną, w nadziei na uratowanie istniejącego, chorego dziecka. „Rodzeństwo zbawiciela” prawdopodobnie oddałoby ratującą życie tkankę, która jest zgodna z jego bratem lub siostrą. Niektórzy etycy twierdzą, że powstałe w wyniku tej procedury „rodzeństwo zbawiciela” byłoby traktowane jak towar. Innym argumentem przeciwko selekcji na „rodzeństwo zbawiciela” jest to, że prowadzi to do genetycznie zmodyfikowanych „dzieci projektantów”. Argument ten skłania do dyskusji między moralnym rozróżnieniem wzmacniania cech i zapobiegania chorobom. Wreszcie przeciwnicy „rodzeństwa zbawiciela” troszczą się o dobro dziecka, głównie o to, że zabieg wyrządzi dziecku krzywdę emocjonalną i psychiczną.

Obecnie w Stanach Zjednoczonych nie istnieją żadne formalne przepisy ani wytyczne. Decyzje etyczne dotyczące tej procedury pozostają w gestii świadczeniodawców i ich pacjentów. W przeciwieństwie do tego, stosowanie PGD w Wielkiej Brytanii jest regulowane przez Ustawę o zapłodnieniu i embriologii człowieka (HFEA), która wymaga od klinik wykonujących tę technikę uzyskania licencji i przestrzegania ścisłych kryteriów.

Zastrzeżenia religijne

Niektóre organizacje religijne nie pochwalają tej procedury. Na przykład Kościół rzymskokatolicki stoi na stanowisku, że pociąga za sobą niszczenie ludzkiego życia. a poza tym sprzeciwia się koniecznemu zapłodnieniu jaj in vitro jako sprzecznemu z arystotelesowskimi zasadami natury. Żydowska religia ortodoksyjna wierzy, że naprawa genetyki jest w porządku, ale nie wspiera tworzenia dziecka, które jest genetycznie ukształtowane.

Czynnik psychologiczny

Przeprowadzona metaanaliza wskazuje, że badania prowadzone w ramach PGD podkreślają przyszłe badania. Wynika to z pozytywnych wyników ankiety dotyczącej postaw, badań kontrolnych po porodzie, wykazujących brak istotnych różnic między tymi, które stosowały PGD a tymi, które poczęły w sposób naturalny, oraz badań etnograficznych, które potwierdziły, że osoby z wcześniejszymi negatywnymi doświadczeniami uznały PGD za ulgę. Po pierwsze, w badaniu dotyczącym postaw kobiety z historią niepłodności, przerwania ciąży i powtarzających się poronień zgłosiły bardziej pozytywny stosunek do preimplantacyjnej diagnostyki genetycznej. Bardziej akceptowali realizację PGD. Po drugie, podobnie jak w przypadku pierwszego badania dotyczącego postaw, badanie etnograficzne przeprowadzone w 2004 r. wykazało podobne wyniki. Pary z historią wielokrotnych poronień, niepłodności i chorego dziecka uważały, że diagnostyka genetyczna przed implantacją jest realną opcją. Poczuli też większą ulgę; „osoby korzystające z tej technologii były w rzeczywistości zmotywowane, aby nie powtarzać utraty ciąży”. Podsumowując, chociaż niektóre z tych badań są ograniczone ze względu na ich retrospektywny charakter i ograniczone próby, wyniki badania wskazują na ogólną satysfakcję uczestników ze stosowania PGD. Jednak autorzy badań wskazują, że badania te podkreślają potrzebę przyszłych badań, takich jak stworzenie prospektywnego projektu z ważną skalą psychologiczną niezbędną do oceny poziomu stresu i nastroju podczas transferu zarodka i implantacji.

Polityka i legalność

Kanada

Przed wprowadzeniem w 2004 r. ustawy o wspomaganiu rozrodu człowieka (AHR) PGD nie podlegało regulacji w Kanadzie. Ustawa zakazywała selekcji płci w celach niemedycznych.

Z powodu cięć budżetowych w 2012 r. DWH została usunięta. Regulacja rozrodu wspomaganego została następnie delegowana do każdej prowincji. Ta delegacja daje prowincjom dużą swobodę działania. W rezultacie prowincje, takie jak Quebec, Alberta i Manitoba, pokryły prawie wszystkie koszty zapłodnienia in vitro na rachunek publicznej opieki zdrowotnej. Dr Santiago Munne, twórca pierwszego testu PGD na zespół Downa i założyciel Reprogenetics, dostrzegł w tych prowincjonalnych decyzjach szansę dla swojej firmy na rozwój i otwarcie większej liczby laboratoriów Reprogenetics w całej Kanadzie. Odrzucił wszelkie kontrowersje dotyczące katalogowych dzieci i stwierdził, że nie ma problemu z idealnymi dziećmi.

Ontario nie ma jednak konkretnych przepisów dotyczących PGD. Od 2011 roku Ministerstwo ds. Dzieci i Młodzieży w Ontario opowiada się za finansowaną przez rząd edukacją na temat bezpiecznej płodności, monitorowaniem zarodków i usługami wspomaganego rozrodu dla wszystkich mieszkańców Ontario. Ten rządowy raport pokazuje, że Ontario nie tylko posiada nieokreślone przepisy dotyczące usług wspomaganego rozrodu, takich jak IVF i PGD, ale również nie finansuje żadnej z tych usług. Wszystkie istniejące kliniki reprodukcyjne są prywatne i znajdują się tylko w Brampton, Markham, Mississauga, Scarborough, Toronto, Londynie i Ottawie. Z kolei prowincje takie jak Alberta i Quebec mają nie tylko więcej klinik, ale także szczegółowe przepisy dotyczące wspomaganej reprodukcji i rządowego finansowania tych praktyk.

Niemcy

Przed 2010 r. stosowanie PGD znajdowało się w prawnej szarej strefie. W 2010 roku Federalny Trybunał Sprawiedliwości Niemiec orzekł, że PGD może być stosowany w wyjątkowych przypadkach. 7 lipca 2011 r. Bundestag uchwalił ustawę, która w niektórych przypadkach dopuszcza PGD. Procedurę można stosować tylko wtedy, gdy istnieje duże prawdopodobieństwo, że rodzice przekażą chorobę genetyczną lub gdy istnieje wysokie genetyczne prawdopodobieństwo urodzenia martwego dziecka lub poronienia. 1 lutego 2013 r. Bundesrat zatwierdził przepis regulujący praktyczne zastosowanie PGD.

Węgry

Na Węgrzech PGD jest dozwolone w przypadku ciężkich chorób dziedzicznych (gdy ryzyko genetyczne przekracza 10%). Przyjętą metodą jest również preimplantacyjna diagnostyka genetyczna aneuploidii (PGS/PGD-A). Obecnie jest zalecana w przypadku wielu poronień i/lub kilku nieudanych zabiegów zapłodnienia in vitro i/lub gdy matka ma więcej niż 35 lat. Pomimo tego, że jest to zatwierdzona metoda, PGD-A jest dostępna tylko w jednej Klinice Leczenia Niepłodności na Węgrzech.

Indie

W Indiach Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej Rodziny reguluje tę koncepcję zgodnie z – Ustawą o technikach diagnostyki przed poczęciem i prenatalnym z 1994 roku . Ustawa została ponownie zrewidowana po 1994 r., a niezbędne zmiany zostały wprowadzone na czas na oficjalnej stronie internetowej rządu indyjskiego poświęconej sprawie. Stosowanie PGD do identyfikacji płciowej/selekcji dzieci jest w Indiach nielegalne.

Meksyk

Od 2006 roku kliniki w Meksyku legalnie świadczyły usługi PGD.

Afryka Południowa

W Republice Południowej Afryki, gdzie prawo do wolności reprodukcyjnej jest prawem chronionym konstytucyjnie, zaproponowano, aby państwo mogło ograniczyć PGD tylko do tego stopnia, że ​​wybór rodziców może zaszkodzić przyszłemu dziecku lub do takiego stopnia, że ​​wybór rodziców wzmocni uprzedzenia społeczne.

Ukraina

Preimplantacyjna diagnostyka genetyczna jest dozwolona na Ukrainie i od 1 listopada 2013 r. reguluje rozporządzenie Ministerstwa Zdrowia Ukrainy „O zatwierdzeniu stosowania technologii wspomaganego rozrodu na Ukrainie” z 09.09.2013 nr 787. [1] .

Zjednoczone Królestwo

W Wielkiej Brytanii technologie wspomaganego rozrodu są regulowane na mocy ustawy o zapłodnieniu i embriologii człowieka (HFE) z 2008 r. Jednak ustawa HFE nie reguluje kwestii związanych z PGD. W związku z tym w 2003 r. utworzono HFE Authority (HFEA), aby działać jako krajowa agencja regulacyjna, która wydaje licencje i monitoruje kliniki zapewniające PGD. HFEA zezwala na stosowanie PGD tylko wtedy, gdy dana klinika posiada licencję wydaną przez HFEA i określa zasady tego licencjonowania w swoim kodeksie postępowania ( [2] ). Każda klinika i każdy stan chorobowy wymaga osobnego wniosku, w którym HFEA sprawdza przydatność proponowanego testu genetycznego oraz umiejętności personelu i wyposażenie kliniki. Tylko wtedy można zastosować PGD u pacjenta.

HFEA surowo zabrania selekcji płci ze względów społecznych lub kulturowych, ale pozwala uniknąć zaburzeń związanych z płcią. Stwierdzają, że PGD jest nie do przyjęcia w przypadku „cech społecznych lub psychologicznych, normalnych zmian fizycznych lub jakichkolwiek innych stanów, które nie są związane z niepełnosprawnością lub poważnym schorzeniem”. Jest jednak dostępny dla par lub osób ze znaną historią rodzinną poważnych chorób genetycznych. Niemniej jednak HFEA uważa odmiany międzypłciowe za „poważną chorobę genetyczną”, taką jak niedobór 5-alfa-reduktazy , cecha związana z niektórymi elitarnymi sportowcami. Zwolennicy interpłciowości argumentują, że takie decyzje są oparte na normach społecznych płci i przyczynach kulturowych.

Stany Zjednoczone

W Stanach Zjednoczonych nie istnieje jednolity system regulacji technologii wspomaganego rozrodu, w tym testów genetycznych. Praktyka i regulacja PGD najczęściej podlegają przepisom prawa stanowego lub profesjonalnym wytycznym, ponieważ rząd federalny nie ma bezpośredniej jurysdykcji nad praktyką medyczną. Do tej pory żaden stan nie wdrożył przepisów bezpośrednio odnoszących się do PGD, co pozostawia badaczom i klinicystom przestrzeganie wytycznych ustalonych przez stowarzyszenia zawodowe. Centrum Kontroli i Zapobiegania Chorobom (CDC) stwierdza, że wszystkie kliniki zapewniając IVF musi zgłosić wskaźniki sukcesu ciąża rocznie do rządu federalnego, ale sprawozdawczą PGD użytkowania i wyniki nie są wymagane. Organizacje zawodowe, takie jak Amerykańskie Towarzystwo Medycyny Rozrodu (ASRM), dostarczyły ograniczonych wskazówek dotyczących etycznego zastosowania PGD. Amerykańskie Towarzystwo Medycyny Rozrodu (ASRM) stwierdza, że „PGD powinno być traktowane jako siedzibę techniki ze szczególnym i rozszerzanie aplikacji dla standardowej praktyce klinicznej”. Stwierdzają również: „Podczas gdy stosowanie PGD w celu zapobiegania chorobom związanym z płcią jest etyczne, odradza się stosowanie PGD wyłącznie do wyboru płci”.

Odniesienia w kulturze popularnej

  • PGD ​​pojawia się w filmie Gattaca z 1997 roku . Akcja filmu rozgrywa się w niedalekiej przyszłości, gdzie PGD/IVF jest najczęstszą formą reprodukcji. W filmie rodzice rutynowo używają PGD do wyboru pożądanych cech dla swoich dzieci, takich jak wzrost, kolor oczu i brak nawet najmniejszych genetycznych predyspozycji do choroby. Etyczne konsekwencje PGD są eksplorowane poprzez historię głównego bohatera, który spotyka się z dyskryminacją, ponieważ został poczęty bez takich metod.
  • PGD ​​jest wspomniane w powieści My Sister's Keeper z 2004 roku przez bohaterów, ponieważ główna bohaterka, Anna Fitzgerald, została stworzona przez PGD, aby być genetycznym dopasowaniem dla jej pozytywnej siostry Kate, która miała APL, aby mogła oddać szpik kostny przy jej narodzinach, aby pomóc Kate w walce APL. W książce wspomniano również, że jej rodzice otrzymali krytykę za czyn.

Informacje na stronach internetowych klinik

W badaniu 135 klinik IVF 88% posiadało strony internetowe, 70% wymieniło PGD, 27% tych ostatnich to kliniki uniwersyteckie lub szpitalne, a 63% to kliniki prywatne. Strony wspominające o PGD również wspominały o zastosowaniach i korzyściach PGD o wiele bardziej niż związane z nim ryzyko. Spośród stron wymieniających PGD, 76% opisało badania w kierunku chorób jednogenowych, ale tylko 35% wspomniało o ryzyku braku diagnozy docelowej, a tylko 18% wspomniało o ryzyku utraty zarodka. 14% określiło PGD jako nowe lub kontrowersyjne. Prywatne kliniki częściej niż inne programy wymieniały niektóre zagrożenia związane z PGD, na przykład błąd diagnostyczny, lub zwracały uwagę, że PGD jest nowym lub kontrowersyjnym źródłem informacji o PGD, zapewniały wskaźniki dokładności badań genetycznych zarodków i oferowały wybór płci ze względów społecznych .

Zobacz też

Uwagi i referencje

Zewnętrzne linki