Primer (biologia molekularna) - Primer (molecular biology)

Widelec do replikacji DNA. Starter RNA oznaczony na górze.

Starter jest krótka jednoniciowa kwasu nukleinowego stosowane według wszystkich organizmów żywych w inicjacji syntezy DNA . Enzymy polimerazy DNA (odpowiedzialne za replikację DNA) są zdolne tylko do dodawania nukleotydów do 3'-końca istniejącego kwasu nukleinowego, co wymaga związania startera z matrycą, zanim polimeraza DNA będzie mogła rozpocząć nić komplementarną. Żywe organizmy używają wyłącznie starterów RNA, podczas gdy techniki laboratoryjne w biochemii i biologii molekularnej, które wymagają syntezy DNA in vitro (takie jak sekwencjonowanie DNA i reakcja łańcuchowa polimerazy ) zwykle wykorzystują startery DNA, ponieważ są one bardziej stabilne temperaturowo.

Startery RNA in vivo

Startery RNA są wykorzystywane przez żywe organizmy, w inicjacji z syntezy pasmo DNA . Klasa enzymów zwanych primazami dodaje komplementarny starter RNA do matrycy odczytu de novo zarówno na nici wiodącej, jak i opóźnionej . Zaczynając od wolnego 3'-OH startera, znanego jako koniec startera, polimeraza DNA może wydłużać nowo zsyntetyzowaną nić. Prowadzące nić w replikacji DNA jest syntetyzowany w jeden ciągły kawałek porusza się z widełek replikacja wymaga tylko początkowy starter RNA, aby rozpocząć syntezę. W opóźnionej nici matrycowy DNA biegnie w kierunku 5′→3′ . Ponieważ polimeraza DNA nie może dodawać zasad w kierunku 3′→5′ komplementarnym do nici matrycy, DNA jest syntetyzowany „wstecz” w krótkich fragmentach oddalających się od widełek replikacyjnych, znanych jako fragmenty Okazaki . W przeciwieństwie do wiodącej nici, ta metoda skutkuje wielokrotnym uruchamianiem i zatrzymywaniem syntezy DNA, co wymaga wielu starterów RNA. Wzdłuż matrycy DNA, primase przeplata startery RNA, które polimeraza DNA wykorzystuje do syntezy DNA w kierunku 5′→3′.

Innym przykładem starterów wykorzystywanych do syntezy DNA jest odwrotna transkrypcja . Odwrotna transkryptaza to enzym, który wykorzystuje nić matrycy RNA do syntezy komplementarnej nici DNA. Polimeraza DNA składnik odwrotnej transkryptazy wymaga istniejącego końca 3', aby rozpocząć syntezę.

Usuwanie podkładu

Po wstawieniu fragmentów Okazaki , startery RNA są usuwane (mechanizm usuwania różni się u prokariontów i eukariotów ) i zastępowane nowymi dezoksyrybonukleotydami, które wypełniają luki, w których obecny był RNA. Ligaza DNA następnie łączy razem pofragmentowane nici, kończąc syntezę opóźnionej nici.

U prokariontów polimeraza DNA I syntetyzuje fragment Okazaki, aż dotrze do poprzedniego startera RNA. Następnie enzym działa jednocześnie jako egzonukleaza 5′→3′ , usuwając startery rybonukleotydów z przodu i dodając deoksyrybonukleotydy z tyłu, aż region zostanie zastąpiony przez DNA, pozostawiając niewielką przerwę w szkielecie DNA między fragmentami Okazaki, która jest uszczelniana ligazą DNA .

W usuwaniu startera eukariotycznego polimeraza DNA δ wydłuża fragment Okazaki w kierunku 5′→3′ , a po napotkaniu startera RNA z poprzedniego fragmentu Okazaki, przemieszcza koniec 5′ startera do jednoniciowego płata RNA, który jest usuwany przez rozszczepienie nukleazą. Cięcie płatów RNA obejmuje albo cięcie krótkich płatów endonukleazą 1 (FEN1) specyficzną dla struktury płata, albo powlekanie długich płatów przez jednoniciowe białko replikacji białka wiążącego DNA A (RPA) i kolejne cięcie przez nukleazę Dna2 i FEN1.

Zastosowania syntetycznych podkładów

Schematyczne przedstawienie starterów do przodu i do tyłu dla standardowego PCR

Syntetyczne startery to chemicznie syntetyzowane oligonukleotydy , zwykle DNA, które można dostosować do hybrydyzacji w określonym miejscu na matrycy DNA. W roztworze starter spontanicznie hybrydyzuje z matrycą poprzez parowanie zasad Watsona-Cricka, zanim zostanie wydłużony przez polimerazę DNA. Zdolność do tworzenia i dostosowywania syntetycznych starterów okazała się nieocenionym narzędziem niezbędnym w różnych podejściach biologii molekularnej obejmujących analizę DNA. Zarówno metoda terminacji łańcucha Sangera, jak i metoda sekwencjonowania DNA „ Next-Gen ” wymagają starterów do zainicjowania reakcji.

Projekt startera PCR

Reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) stosuje się parę starterów zamówienie do bezpośredniego wydłużania DNA w kierunku siebie na przeciwległych końcach sekwencji wzmacniany. Startery te mają zazwyczaj długość od 18 do 24 zasad i muszą kodować tylko określone miejsca w górę i w dół amplifikowanej sekwencji. Starter, który może wiązać się z wieloma regionami wzdłuż DNA, wzmocni je wszystkie, eliminując cel PCR.

Podczas projektowania pary starterów PCR należy wziąć pod uwagę kilka kryteriów. Pary starterów powinny mieć podobne temperatury topnienia, ponieważ hybrydyzacja podczas PCR zachodzi dla obu nici jednocześnie, a ta wspólna temperatura topnienia nie może być ani zbyt wyższa, ani niższa niż temperatura hybrydyzacji reakcji . Podkład z T m (temperatura topnienia) za dużo wyższa od temperatury wyżarzania przebiegu reakcji może mishybridize i rozciągają się nieprawidłowego położenia wzdłuż sekwencji DNA. T m znacznie niższa niż temperatura wyżarzania nie może wyżarzania i rozciągają się w ogóle.

Dodatkowo, sekwencje starterów muszą być wybrane tak, aby jednoznacznie wyselekcjonować region DNA, unikając możliwości hybrydyzacji z podobną sekwencją w pobliżu. Powszechnie stosowaną metodą wyboru miejsca startera jest przeszukiwanie BLAST , dzięki któremu można zobaczyć wszystkie możliwe regiony, z którymi starter może się związać. BLAST można przeszukiwać zarówno sekwencję nukleotydową, jak i sam starter. Darmowe narzędzie NCBI Primer-BLAST integruje projektowanie podkładów i wyszukiwanie BLAST w jednej aplikacji, podobnie jak komercyjne oprogramowanie, takie jak ePrime i Beacon Designer . Symulacje komputerowe teoretycznych wyników PCR ( Electronic PCR ) mogą być przeprowadzane w celu pomocy w projektowaniu starterów poprzez podanie temperatur topnienia i wyżarzania itp.

Od 2014 r. wiele narzędzi internetowych jest swobodnie dostępnych do projektowania starterów, z których niektóre koncentrują się na konkretnych zastosowaniach PCR. Startery o wysokiej swoistości dla podzbioru matryc DNA w obecności wielu podobnych wariantów można zaprojektować za pomocą ODSZYFROWANIA .

Wybór określonego regionu DNA do wiązania startera wymaga pewnych dodatkowych rozważań. Należy unikać regionów o dużej liczbie powtórzeń mononukleotydowych i dinukleotydowych, ponieważ może wystąpić tworzenie pętli i przyczyniać się do nieprawidłowej hybrydyzacji. Podkłady nie powinny łatwo wygrzewać się z innymi podkładami w mieszance; Zjawisko to może prowadzić do wytwarzania produktów „podkładowych dimerów” zanieczyszczających roztwór końcowy. Startery również nie powinny silnie łączyć się ze sobą, ponieważ wewnętrzne spinki do włosów i pętle mogą utrudniać łączenie z matrycą DNA.

Podczas projektowania starterów do tylnych końców każdego startera można dodać dodatkowe zasady nukleotydowe, co skutkuje dostosowaną sekwencją czapeczki na każdym końcu amplifikowanego regionu. Jednym z zastosowań tej praktyki jest klonowanie TA , specjalna technika subklonowania podobna do PCR, gdzie wydajność można zwiększyć przez dodanie ogonów AG do końców 5' i 3'.

Zdegenerowane podkłady

Niektóre sytuacje mogą wymagać użycia zdegenerowanych starterów. Są to mieszanki starterów, które są podobne, ale nie identyczne. Może to być wygodne przy amplifikacji tego samego genu z różnych organizmów , ponieważ sekwencje są prawdopodobnie podobne, ale nie identyczne. Technika ta jest użyteczna, ponieważ sam kod genetyczny jest zdegenerowany , co oznacza, że ​​kilka różnych kodonów może kodować ten sam aminokwas . Dzięki temu różne organizmy mają znacząco odmienną sekwencję genetyczną, która koduje bardzo podobne białko. Z tego powodu zdegenerowane startery są również stosowane, gdy projektowanie starterów opiera się na sekwencji białka , ponieważ specyficzna sekwencja kodonów nie jest znana. Dlatego sekwencją startera odpowiadającą aminokwasowi izoleucyny może być „ATH”, gdzie A oznacza adeninę , T tyminę , a H adeninę , tyminę lub cytozynę , zgodnie z kodem genetycznym dla każdego kodonu , przy użyciu symboli IUPAC dla zdegenerowane bazy . Zdegenerowane startery mogą nie hybrydyzować idealnie z sekwencją docelową, co może znacznie zmniejszyć specyficzność amplifikacji PCR.

Zdegenerowane startery są szeroko stosowane i niezwykle przydatne w dziedzinie ekologii drobnoustrojów . Pozwalają na amplifikację genów z dotychczas nieuprawianych mikroorganizmów lub odzyskiwanie genów z organizmów, w których informacje genomowe nie są dostępne. Zwykle zdegenerowane startery projektuje się przez dopasowanie sekwencjonowania genów znalezionego w GenBank . Różnice między sekwencjami są wyjaśniane przy użyciu degeneracji IUPAC dla poszczególnych zasad. Startery PCR są następnie syntetyzowane jako mieszanina starterów odpowiadających wszystkim permutacjom sekwencji kodonów.

Zobacz też

Bibliografia

Zewnętrzne linki