Punkt kontrolny wrzeciona - Spindle checkpoint

Etapy cyklu komórkowego. Punkt kontrolny wrzeciona występuje podczas fazy M.
Schemat przedstawiający progresję cyklu komórkowego między prometafazą a anafazą.

Punkt kontrolny wrzeciona , znany również jako przejście metafaza-anafaza , punkt kontrolny zespołu wrzeciona (SAC) , punkt kontrolny metafazy lub punkt kontrolny mitotyczny , jest punktem kontrolnym cyklu komórkowego podczas mitozy lub mejozy, który zapobiega separacji zduplikowanych chromosomów ( anafaza ) do momentu , gdy każdy chromosom zostanie prawidłowo przymocowany do wrzeciona . Aby osiągnąć właściwą segregację, dwa kinetochory na siostrzanych chromatydach muszą być przyłączone do przeciwległych biegunów wrzeciona (orientacja dwubiegunowa). Tylko ten wzór przyłączenia zapewni, że każda komórka potomna otrzyma jedną kopię chromosomu. Cechą biochemiczną tego punktu kontrolnego jest stymulacja kompleksu promującego anafazę przez kompleksy cyklina-CDK fazy M , co z kolei powoduje destrukcję proteolityczną cyklin i białek, które utrzymują razem chromatydy siostrzane .

Przegląd i znaczenie

Początek metafazy charakteryzuje się połączeniem mikrotubul z kinetochorami chromosomów, a także wyrównaniem chromosomów w środku komórki. Każda chromatyda ma swój własny kinetochor, a wszystkie mikrotubule związane z kinetochorami chromatyd siostrzanych promieniują z przeciwnych biegunów komórki. Mikrotubule te wywierają na chromosomy siłę ciągnącą w kierunku przeciwległych końców komórek, podczas gdy spójność między chromatydami siostrzanymi przeciwstawia się tej sile.

W przejściu metafazy do anafazy ta kohezja między chromatydami siostrzanymi jest rozpuszczana, a oddzielone chromatydy są wciągane na przeciwne strony komórki przez mikrotubule wrzeciona. Chromatydy są dalej oddzielone fizycznym ruchem samych biegunów wrzeciona. Przedwczesna dysocjacja chromatyd może prowadzić do nieprawidłowej segregacji chromosomów i aneuploidii w komórkach potomnych. Zatem zadaniem punktu kontrolnego wrzeciona jest zapobieganie temu przejściu w anafazę, dopóki chromosomy nie zostaną prawidłowo połączone, zanim chromatydy siostrzane się rozdzielą.

Dla zachowania tożsamości i prawidłowego funkcjonowania komórki konieczne jest utrzymanie odpowiedniej liczby chromosomów po każdym podziale komórki . Błąd w generowaniu komórek potomnych z mniejszą lub większą liczbą chromosomów niż oczekiwano (sytuacja określana jako aneuploidia ) może w najlepszym przypadku prowadzić do śmierci komórki lub alternatywnie może generować katastrofalne wyniki fenotypowe . Przykłady obejmują:

Odkrycie punktu kontrolnego montażu wrzeciona (SAC)

Obraz mikroskopowy przedstawiający dwie komórki z ich chromosomami wybarwionymi DAPI, jedną w anafazie (po lewej), a drugą w metafazie (po prawej), z większością chromosomów na płytce metafazy, a niektóre chromosomy wciąż nie są wyrównane.

Zirkle (w 1970 r.) był jednym z pierwszych badaczy, którzy zaobserwowali, że kiedy tylko jeden chromosom jest opóźniony w dotarciu do płytki metafazowej, początek anafazy jest opóźniony do kilku minut po jego przybyciu. Ta obserwacja, wraz z podobnymi, sugerowała istnienie mechanizmu kontrolnego na przejściu metafaza-anafaza. Stosując leki, takie jak nokodazol i kolchicyna , wrzeciono mitotyczne rozkłada się, a cykl komórkowy jest blokowany w przejściu metafaza-anafaza. Stosując te leki (patrz przegląd Riedera i Palazzo z 1992 r.), domniemany mechanizm kontrolny nazwano Punktem Kontrolnym Montażu Wrzeciona (SAC). Od tego czasu ten mechanizm regulacyjny był intensywnie badany.

Korzystając z różnych rodzajów badań genetycznych, ustalono, że różne rodzaje defektów mogą aktywować SAC: depolimeryzacja wrzeciona, obecność chromosomów dicentrycznych (z dwoma centromerami), centromery segregujące w nieprawidłowy sposób, defekty w korpusach biegunów wrzeciona u S. cerevisiae , defekty w białkach kinetochorowych, mutacje w centromerowym DNA lub defekty silników molekularnych aktywnych podczas mitozy. Podsumowanie tych obserwacji można znaleźć w artykule Hardwick i współpracowników z 1999 roku.

Korzystając z własnych obserwacji, Zirkle jako pierwszy zaproponował, że „jakaś (…) substancja niezbędna do przejścia komórki do anafazy pojawia się kilka minut po C (momencie przybycia ostatniego chromosomu na płytkę metafazy) lub po drastyczna zmiana stanu cytoplazmatycznego , tuż przy C lub bezpośrednio po C”, co sugeruje, że ta funkcja jest zlokalizowana na kinetochorach nieprzywiązanych do wrzeciona mitotycznego. McIntosh rozszerzył tę propozycję, sugerując, że jeden enzym wrażliwy na napięcie zlokalizowany w centromerach wytwarza inhibitor początku anafazy, gdy dwa siostrzane kinetochory nie są pod napięciem dwubiegunowym. Rzeczywiście, dostępne dane sugerowały, że sygnał „czekaj na wejście w anafazę” jest wytwarzany głównie na lub w pobliżu niepodłączonych kinetochorów. Jednak głównym zdarzeniem związanym z przyłączeniem kinetochoru do wrzeciona, które jest w stanie dezaktywować sygnał hamujący i uwolnić zatrzymanie metafazy, może być albo pozyskiwanie mikrotubul przez kinetochor (jak zaproponowali Rieder i współpracownicy w 1995), albo napięcie stabilizujące zakotwiczenie mikrotubul do kinetochorów (jak sugerują eksperymenty przeprowadzone w laboratorium Nicklasa). Kolejne badania na komórkach zawierających dwa niezależne wrzeciona mitotyczne w jedynej cytoplazmie wykazały, że inhibitor przejścia metafaza-anafaza jest generowany przez niezwiązane kinetochory i nie jest swobodnie dyfundowany w cytoplazmie. Jednak w tym samym badaniu wykazano, że po zainicjowaniu przejścia od metafazy do anafazy w jednej części komórki, informacja ta rozciąga się na całą cytoplazmę i może przezwyciężyć sygnał „czekaj na wejście w anafazę” związany z drugie wrzeciono zawierające niepodłączone kinetochory.

Informacje na temat powielania, spójności i segregacji chromatyd siostrzanych

Podział komórki: powielanie materiału i dystrybucja do komórek potomnych

Trzy rodzaje podziału komórek: rozszczepienie binarne (zachodzące u prokariontów ), mitoza i mejoza (zachodzące u eukariontów ).

Kiedy komórki są gotowe do podziału, ponieważ rozmiar komórki jest wystarczająco duży lub ponieważ otrzymują odpowiedni bodziec, aktywują mechanizm wejścia w cykl komórkowy i duplikują większość organelli podczas fazy S (syntezy), w tym ich centrosomy . Dlatego po zakończeniu procesu podziału komórki każda komórka potomna otrzyma kompletny zestaw organelli. Jednocześnie w fazie S wszystkie komórki muszą bardzo dokładnie duplikować swoje DNA , co określa się mianem replikacji DNA . Po zakończeniu replikacji DNA u eukariontów cząsteczka DNA jest zagęszczana i zagęszczana, tworząc chromosomy mitotyczne , z których każdy składa się z dwóch siostrzanych chromatyd , które utrzymują się razem dzięki ustanowieniu spójności między nimi; każda chromatyda jest kompletną cząsteczką DNA, przyłączoną przez mikrotubule do jednego z dwóch centrosomów dzielącej się komórki, znajdujących się na przeciwległych biegunach komórki. Strukturę utworzoną przez centrosomy i mikrotubule nazwano wrzecionem mitotycznym , ze względu na swój charakterystyczny kształt, utrzymujący chromosomy pomiędzy dwoma centrosomami. Obie chromatydy siostrzane pozostają razem aż do anafazy ; w tym momencie oddzielają się od siebie i podążają w kierunku centrosomu, do którego są przyczepione. W ten sposób, gdy dwie komórki potomne rozdzielą się pod koniec procesu podziału, każda otrzyma kompletny zestaw chromatyd. Mechanizm odpowiedzialny za prawidłową dystrybucję chromatyd siostrzanych podczas podziału komórki nazywa się segregacją chromosomów .

Aby zapewnić prawidłową segregację chromosomów, komórki opracowały precyzyjny i złożony mechanizm. Po pierwsze, komórki muszą koordynować duplikację centrosomów z replikacją DNA, a niepowodzenie tej koordynacji wygeneruje monopolarne lub wielobiegunowe wrzeciona mitotyczne, które generalnie będą powodować nieprawidłową segregację chromosomów, ponieważ w tym przypadku rozkład chromosomów nie będzie przebiegał w sposób zrównoważony. sposób.


Mitoza: zakotwiczenie chromosomów do wrzeciona i segregacja chromosomów

Zobacz też: kinetochor
Obraz komórki ludzkiej podczas mitozy ; mikrotubule są pokazane na zielono (tworzące wrzeciono mitotyczne), chromosomy na równiku wrzeciona są niebieskie, a kinetochory na czerwono.

Podczas fazy S centrosom zaczyna się duplikować. Już na początku mitozy obie centriole osiągają maksymalną długość, rekrutują dodatkowy materiał i wzrasta ich zdolność do zarodkowania mikrotubul. W miarę postępu mitozy oba centrosomy rozdzielają się, tworząc wrzeciono mitotyczne. W ten sposób wrzeciono mitotyczne ma dwa bieguny emanujące mikrotubulami. Mikrotubule (MT) są długimi włóknami białkowymi o asymetrycznych końcach: jeden koniec określany jako „minus” (-), stosunkowo stabilny i blisko centrosomu, oraz koniec określany jako „plus” (+), z naprzemiennymi fazami wzrostu i retrakcja, eksploracja centrum komórki przeszukującej chromosomy. Każda chromatyda ma specjalny region, nazwany centromerem , nad którym zamontowana jest struktura proteiczna zwana kinetochorem , która jest w stanie stabilizować plus koniec mikrotubuli. Dlatego jeśli przypadkowo mikrotubula badająca środek komórki natrafi na kinetochor, może się zdarzyć, że kinetochor go przechwyci, tak że chromosom zostanie przyłączony do wrzeciona przez kinetochor jednej z jego siostrzanych chromatyd. Chromosom odgrywa aktywną rolę w przyłączaniu kinetochorów do wrzeciona. Z chromatyną związany jest czynnik wymiany nukleotydów guaninowych Ran (GEF), który stymuluje cytozolowy Ran w pobliżu chromosomu do wiązania GTP zamiast GDP. Aktywowana forma Ran związana z GTP uwalnia białka stabilizujące mikrotubule, takie jak TPX2, z kompleksów białkowych w cytozolu, co indukuje zarodkowanie i polimeryzację mikrotubul wokół chromosomów. Te mikrotubule pochodzące z kinetochoru, wraz z białkami motorycznymi kinezyn w zewnętrznym kinetochorze, ułatwiają interakcje z boczną powierzchnią mikrotubuli pochodzącej z bieguna wrzeciona. Te boczne mocowania są jednak niestabilne i muszą zostać przekształcone w mocowanie typu end-on. Konwersja z przyłączeń bocznych do przyłączeń typu „end-on” umożliwia przekształcenie wzrostu i kurczenia się plusowych końców mikrotubuli w siły, które popychają i ciągną chromosomy w celu uzyskania właściwej dwuorientacji. Ponieważ zdarza się, że chromatydy siostrzane są połączone razem i oba kinetochory są umieszczone tyłem do siebie na obu chromatydach, kiedy jeden kinetochor zostaje przyczepiony do jednego centrosomu, kinetochor siostrzany zostaje wystawiony na działanie centrosomu znajdującego się w przeciwległym biegunie; z tego powodu, w większości przypadków, drugi kinetochor zostaje powiązany z centrosomu w przeciwległym biegunie, poprzez jego mikrotubule, tak że chromosomy stają się „bi-zorientowane”, fundamentalna konfiguracja (zwana również amfitelicą ), aby zapewnić, że segregacja chromosomów będzie miała miejsce umieść prawidłowo, gdy komórka się podzieli. Czasami jeden z dwóch siostrzanych kinetochorów może przyłączyć się jednocześnie do MT generowanych przez oba bieguny, w konfiguracji zwanej merotelic , która nie jest wykrywana przez punkt kontrolny wrzeciona, ale która może generować chromosomy opóźnione podczas anafazy, a w konsekwencji aneuploidii. Orientacja meroteliczna (charakteryzująca się brakiem napięcia między siostrzanymi kinetochorami) jest częsta na początku mitozy, ale białko Aurora B (kinaza konserwowana od drożdży do kręgowców) wykrywa i eliminuje ten typ zakotwiczenia. (Uwaga: Aurora B często ulega nadekspresji w różnych typach guzów i obecnie jest celem opracowywania leków przeciwnowotworowych.)

Spójność chromatyd siostrzanych podczas mitozy

Kohezyna: białka SMC

Jak wcześniej zauważono, chromatydy siostrzane pozostają związane z fazy S (kiedy DNA jest replikowane w celu wygenerowania dwóch identycznych kopii, dwóch chromatyd) aż do anafazy. W tym momencie dwie siostrzane chromatydy rozdzielają się i podróżują do przeciwległych biegunów w dzielącej się komórce. Badania genetyczne i biochemiczne na drożdżach i ekstraktach z jaj w Xenopus laevis zidentyfikowały kompleks poliproteinowy jako istotny element kohezji siostrzanych chromatyd (patrz przegląd Hirano z 2000 r.). Kompleks ten jest znany jako kompleks kohezyny iw Saccharomyces cerevisiae składa się z co najmniej czterech podjednostek: Smc1p, Smc3p, Scc1p (lub Mcd1p) i Scc3p. Zarówno Smc1p, jak i Smc3p należą do rodziny białek strukturalnego utrzymania chromosomów (SMC), które stanowią grupę chromosomowych ATPaz wysoce konserwatywnych i tworzą heterodimer (Smc1p/Smc3p). Scc1p jest homologiczny w S. cerevisiae z Rad21, zidentyfikowany jako białko zaangażowane w procesach naprawy DNA w S. pombe . Te cztery białka są niezbędne w drożdżach, a mutacja w którymkolwiek z nich spowoduje przedwczesną separację chromatyd siostrzanych. U drożdży kohezyna wiąże się z preferencyjnymi miejscami wzdłuż ramion chromosomów i występuje bardzo obficie w pobliżu centromerów, jak wykazano w badaniu z wykorzystaniem immunoprecypitacji chromatyny.

Rola heterochromatyny

Klasyczne obserwacje cytologiczne sugerowały, że chromatydy siostrzane są silniej związane z regionami heterochromatycznymi , co sugeruje, że specjalna struktura lub skład heterochromatyny może sprzyjać rekrutacji kohezyny. W rzeczywistości wykazano, że Swi6 (homolog HP-1 w S. pombe ) wiąże się z metylowaną Lys 9 histonu H3 i promuje wiązanie kohezyny z powtórzeniami centromerowymi w S. pombe . Nowsze badania wskazują, że maszyneria RNAi reguluje powstawanie heterochromatyny, która z kolei rekrutuje kohezynę do tego regionu, zarówno w S. pombe, jak iw komórkach kręgowców. Muszą jednak istnieć inne mechanizmy niż heterochromatyna, aby zapewnić zwiększoną kohezję w centromerach, ponieważ S. cerevisiae nie ma heterochromatyny obok centromerów, ale obecność funkcjonalnego centromeru indukuje wzrost asocjacji kohezyny w sąsiednim regionie, obejmującym 20-50 kb.

W tym kierunku Orc2 (jedno białko zawarte w kompleksie rozpoznającym miejsce pochodzenia , ORC, zaangażowane w inicjację replikacji DNA podczas fazy S ) jest również zlokalizowane na kinetochorach podczas mitozy w ludzkich komórkach; zgodnie z tą lokalizacją, niektóre obserwacje wskazują, że Orc2 w drożdżach bierze udział w kohezji chromatyd siostrzanych, a jego usunięcie indukuje aktywację SAC. Zaobserwowano również, że inne składniki kompleksu ORC (takie jak orc5 w S. pombe ) są zaangażowane w kohezję. Jednak szlak molekularny obejmujący białka ORC wydaje się być addytywny do szlaku kohezyn i jest w większości nieznany.

Funkcja kohezji i jej rozpuszczanie
Schemat przedstawiający kohezję siostrzanych chromatyd, zakotwiczonych w mikrotubulach wrzeciona poprzez ich kinetochory

Spójność centromerowa opiera się siłom wywieranym przez mikrotubule wrzeciona w kierunku biegunów, które generują napięcie między siostrzanymi kinetochorami. Z kolei to napięcie stabilizuje przyczepność mikrotubula-kinetochor, poprzez mechanizm angażujący białko Aurora B (przegląd na ten temat: Hauf i Watanabe 2004).

Rzeczywiście, obniżenie poziomu kohezyny w komórkach powoduje przedwczesne oddzielenie chromatyd siostrzanych, a także defekty w kongresji chromosomów na płytce metafazowej i delokalizację białek w chromosomalnym kompleksie pasażerskim , który zawiera białko Aurora B. Proponowana struktura dla kompleksu kohezyny sugeruje, że kompleks ten łączy bezpośrednio obie siostrzane chromatydy. W tej proponowanej strukturze składniki SMC kohezyny odgrywają rolę strukturalną, tak że heterodimer SMC może funkcjonować jako białko wiążące DNA, którego konformacja jest regulowana przez ATP . Scc1p i Scc3p odgrywałyby jednak rolę regulacyjną.

U S. cerevisiae Pds1p (znany również jako sekuryna ) reguluje kohezję chromatyd siostrzanych, ponieważ wiąże i hamuje proteazę Esp1p ( separyna lub separaza ). Gdy wyzwalany jest początek anafazy, kompleks promujący anafazę ( APC/C lub Cyclosome) rozkłada sekurynę. APC/C jest pierścieniową ligazą ubikwityny E3, która rekrutuje enzym sprzęgający ubikwitynę E2 obciążony ubikwityną. Securin jest rozpoznawany tylko wtedy, gdy Cdc20, podjednostka aktywatora, jest połączona z rdzeniem APC/C. Gdy sekuryna, Cdc20 i E2 są wszystkie związane z APC/C, E2 ubikwitynuje sekurynę i selektywnie ją degraduje. Degradacja sekuryny uwalnia proteazę Esp1p/separazę, która degraduje pierścienie kohezyny łączące dwie siostrzane chromatydy, promując w ten sposób rozdział siostrzanych chromatyd. Wykazano również, że kinaza Polo/Cdc5 fosforyluje reszty seryny obok miejsca cięcia Scc1 i ta fosforylacja ułatwiłaby czynność cięcia.

Chociaż maszyneria ta jest konserwowana przez ewolucję, u kręgowców większość cząsteczek kohezyny jest uwalniana w profazie, niezależnie od obecności APC/C, w procesie zależnym od Polo-like 1 ( PLK1 ) i Aurora B. Wykazano jednak, że niewielka ilość Scc1 pozostaje związana z centromerami w komórkach ludzkich aż do metafazy, a podobna ilość jest wycinana w anafazie, kiedy znika z centromerów. Z drugiej strony, niektóre eksperymenty pokazują, że spójność siostrzanych chromatyd w ramionach jest stopniowo tracona po rozdzieleniu siostrzanych centromerów, a siostrzane chromatydy poruszają się w kierunku przeciwnych biegunów komórki.

Według niektórych obserwacji frakcja kohezyn w ramionach chromosomowych i kohezyny centromerowe jest chroniona przez białko Shugoshin (Sgo1), co zapobiega ich uwalnianiu podczas profazy. Aby móc działać jako protektor kohezji centromerowej, Sgo1 musi być dezaktywowane na początku anafazy, podobnie jak Pds1p. W rzeczywistości zarówno Pds1p, jak i Sgo1 są substratami APC/C u kręgowców.

Przegląd punktu kontrolnego montażu wrzeciona

Punkt kontrolny zespołu wrzeciona (SAC) jest aktywnym sygnałem wytwarzanym przez niewłaściwie przyczepione kinetochory , który jest zachowany u wszystkich eukariontów . SAC zatrzymuje cykl komórkowy poprzez negatywną regulację CDC20, zapobiegając w ten sposób aktywacji aktywności poliubikwitylacji kompleksu promującego anafazę (APC). Białka odpowiedzialne za sygnał SAC tworzą kompleks mitotycznego punktu kontrolnego (MCC), który obejmuje białka SAC, MAD2 / MAD3 (niedobór zatrzymania mitotycznego), BUB3 (pączkowanie niehamowane przez benzimidazol) i CDC20 . Inne białka zaangażowane w SAC obejmują MAD1 , BUB1 , MPS1 i Aurora B . W przypadku wyższych eukariontów dodatkowe regulatory SAC obejmują składniki kompleksu ROD-ZW10 , kometę p31 , MAPK , CDK1-cyklinę-B , NEK2 i PLK1 .

Schemat przedstawiający różne komponenty punktu kontrolnego wrzeciona u kręgowców.

Aktywacja punktu kontrolnego

SAC monitoruje interakcję między nieprawidłowo połączonymi kinetochorami a mikrotubulami wrzeciona i jest utrzymywany do momentu prawidłowego przymocowania kinetochorów do wrzeciona. Podczas prometafazy białka CDC20 i SAC koncentrują się w kinetochorach przed przyłączeniem do zespołu wrzeciona. Białka te utrzymują aktywację SAC do czasu ich usunięcia i prawidłowego połączenia kinetochoru z mikrotubulami. Nawet pojedynczy niepodłączony kinetochor może utrzymać punkt kontrolny wrzeciona. Po przyłączeniu końców dodatnich mikrotubuli i utworzeniu mikrotubul kinetochorowych, MAD1 i MAD2 są usuwane z zespołu kinetochorowego. Kolejnym regulatorem aktywacji punktu kontrolnego jest napięcie kinetochorowe. Kiedy siostrzane kinetochory są prawidłowo przymocowane do przeciwległych biegunów wrzeciona, siły we wrzecionie mitotycznym wytwarzają napięcie w kinetochorach. Dwukierunkowe siostrzane kinetochory stabilizują zespół kinetochor-mikrotubule, podczas gdy słabe napięcie ma działanie destabilizujące. W odpowiedzi na nieprawidłowe mocowanie kinetochorów, takie jak mocowanie syntetyczne , w którym oba kinetochory zostają przymocowane do jednego drążka wrzeciona, generowane słabe napięcie destabilizuje nieprawidłowe mocowanie i umożliwia prawidłowe przyłączenie kinetochoru do korpusu wrzeciona. Podczas tego procesu kinetochory, które są przymocowane do wrzeciona mitotycznego, ale nie są naprężone, uruchamiają punkt kontrolny wrzeciona. Kinaza Aurora-B/Ipl1 chromosomalnego kompleksu pasażerskiego pełni funkcję czujnika napięć w nieprawidłowych przyczepach kinetochorowych. Wykrywa i destabilizuje nieprawidłowych narzędzia poprzez kontrolę mikrotubul odcinania kini kinezyny MCAK, w DASH złożonym i Ndc80 / Hec1 złożony z interfejsu mikrotubule kinetochoru. Kinaza Aurora-B/Ipl1 ma również kluczowe znaczenie w korygowaniu przyłączeń merotelicznych , w których jeden kinetochor jest jednocześnie przyłączony do obu biegunów wrzeciona. Przyłącza meroteliczne wytwarzają wystarczające napięcie i nie są wykrywane przez SAC, a bez korekcji mogą skutkować nieprawidłową segregacją chromosomów z powodu wolnej prędkości migracji chromatyd. Chociaż przyłączenie mikrotubul jest niezależnie wymagane do aktywacji SAC, nie jest jasne, czy napięcie jest niezależnym regulatorem SAC, chociaż jasne jest, że wraz z napięciem pojawiają się różne zachowania regulacyjne.

Po aktywacji punkt kontrolny wrzeciona blokuje wejście w anafazę poprzez hamowanie kompleksu promującego anafazę poprzez regulację aktywności mitotycznego kompleksu punktu kontrolnego. Mechanizm hamowania APC przez kompleks mitotycznego punktu kontrolnego jest słabo poznany, chociaż przypuszcza się, że MCC wiąże się z APC jako pseudosubstrat przy użyciu motywu kasety KEN w BUBR1 . W tym samym czasie, gdy aktywowany jest mitotyczny kompleks punktów kontrolnych, białko centromerowe CENP-E aktywuje BUBR1, który również blokuje anafazę.

Formacja kompleksu mitotycznego punktu kontrolnego

Mitotyczny kompleks punktów kontrolnych składa się z BUB3 wraz z MAD2 i MAD3 związanym z Cdc20 . MAD2 i MAD3 mają różne miejsca wiązania na CDC20 i działają synergistycznie, hamując APC/C. Kompleks MAD3 składa się z BUB3, który wiąże się z Mad3 i BUB1B poprzez krótki liniowy motyw znany jako motyw GLEBS. Dokładna kolejność załączników, które muszą mieć miejsce, aby utworzyć MCC, pozostaje nieznana. Możliwe, że Mad2-Cdc20 tworzy kompleks w tym samym czasie, co BUBR1-BUB3-Cdc20 tworzy inny kompleks, a te dwa subkompleksy są konsekwentnie łączone w celu utworzenia kompleksu mitotycznego punktu kontrolnego. W komórkach ludzkich wiązanie BUBR1 do CDC20 wymaga uprzedniego wiązania MAD2 do CDC20, więc możliwe jest, że podkompleks MAD2-CDC20 działa jako inicjator tworzenia MCC. Ubytek BUBR1 prowadzi tylko do łagodnego zmniejszenia poziomów Mad2-Cdc20, podczas gdy Mad2 jest wymagane do wiązania BubR1-Bub3 do Cdc20. Niemniej jednak BUBR1 jest nadal wymagany do aktywacji punktu kontrolnego.

Mechanizm powstawania MCC jest niejasny i istnieją konkurencyjne teorie dotyczące zarówno formacji zależnej od kinetochoru, jak i niezależnej od kinetochoru. Na poparcie teorii niezależnej od kinetochoru, MCC jest wykrywalny w komórkach S. cerevisiae , w których zmutowano białka tworzące rdzeń kinetokoru i komórki, w których SAC został dezaktywowany, co sugeruje, że MCC może być składane podczas mitozy bez lokalizacji kinetochoru. W jednym modelu niezwiązane kinetochory prometafazy mogą „uczulać” APC na hamowanie MCC poprzez rekrutację APC do kinetochorów poprzez funkcjonujący SAC. Ponadto, deplecje różnych białek SAC wykazały, że deplecje MAD2 i BUBR1 wpływają na czas mitozy niezależnie od kinetochorów, podczas gdy deplecje innych białek SAC prowadzą do dysfunkcji SAC bez zmiany czasu trwania mitozy. Jest więc możliwe, że SAC działa poprzez dwustopniowy zegar, w którym MAD2 i BUBR1 kontrolują czas trwania mitozy w pierwszym etapie, który może zostać wydłużony w drugim etapie, jeśli występują nieprzyłączone kinetochory, a także inne białka SAC. Istnieją jednak dowody, które przemawiają na niekorzyść zgromadzenia niezależnego od kinetochorów. MCC nie zostało jeszcze wykryte podczas interfazy , podczas gdy MCC nie powstaje ze swoich składników w ekstraktach X. laevis meiosis II bez dodatku plemników jąder i nokodazolu, aby zapobiec tworzeniu się wrzeciona.

Wiodącym modelem tworzenia MCC jest „model szablonu MAD2, który zależy od dynamiki kinetochorowej MAD2 w celu utworzenia MCC. MAD1 lokalizuje się w niepodłączonych kinetochorach, jednocześnie silnie wiążąc się z MAD2. Lokalizacja MAD2 i BubR1 w kinetochorze może również zależeć od kinazy Aurora B . Komórki pozbawione Aurora B nie zatrzymują się w metafazie, nawet gdy chromosomy nie mają przyłączenia mikrotubul. Nieprzyłączone kinetochory najpierw wiążą się z kompleksem komet MAD1-C-MAD2-p31 i uwalniają kometę p31 przez nieznane mechanizmy. Powstały kompleks MAD-C-MAD2 rekrutuje otwarty konformer Mad2 (O-Mad2) do kinetochorów. Ten O-Mad2 zmienia swoją konformację na zamkniętą Mad2 (C-Mad2) i wiąże Mad1. Ten kompleks Mad1/C-Mad2 odpowiada za rekrutację większej ilości O-Mad2 do kinetochorów, który zmienia swoją konformację na C-Mad2 i wiąże Cdc20 w reakcji autoamplifikacji. Ponieważ MAD1 i CDC20 zawierają podobny motyw wiążący MAD2, pusta konformacja O-MAD2 zmienia się w C-MAD2 podczas wiązania z CDC20. Ta pętla dodatniego sprzężenia zwrotnego jest ujemnie regulowana przez kometę p31 , która kompetycyjnie wiąże się z C-MAD2 związanym z MAD1 lub CDC20 i zmniejsza dalsze wiązanie O-MAD2 z C-MAD2. Mogą również istnieć dalsze mechanizmy kontrolne, biorąc pod uwagę, że kometa p31 nie występuje u niższych eukariontów. Nomenklatura „modelu szablonu” wywodzi się zatem z procesu, w którym MAD1-C-MAD2 działa jako szablon do tworzenia kopii C-MAD2-CDC20. Ta sekwestracja Cdc20 jest niezbędna do utrzymania punktu kontrolnego wrzeciona.

Dezaktywacja punktu kontrolnego

Istnieje kilka mechanizmów dezaktywacji SAC po prawidłowej dwuorientacji chromatyd siostrzanych . Po przyłączeniu mikrotubula-kinetochor mechanizm strippingu poprzez kompleks motoryczny dyneina-dyneina transportuje białka punktu kontrolnego wrzeciona z dala od kinetochorów. Białka pozbawione warstwy, które obejmują MAD1, MAD2, MPS1 i CENP-F , są następnie redystrybuowane do biegunów wrzeciona . Proces strippingu w dużym stopniu zależy od nieuszkodzonej struktury mikrotubul oraz ruchliwości dyneiny wzdłuż mikrotubul. Oprócz funkcjonowania jako regulator pętli dodatniego sprzężenia zwrotnego C-MAD2, kometa p31 może również działać jako dezaktywator SAC. Nieprzyłączone kinetochory tymczasowo dezaktywują kometę p31 , ale przyłączenie reaktywuje białko i hamuje aktywację MAD2, prawdopodobnie przez hamującą fosforylację. Inny możliwy mechanizm inaktywacji SAC wynika z zależnej od energii dysocjacji kompleksu MAD2-CDC20 poprzez niedegradacyjną ubikwitylację CDC20. Odwrotnie, de ubiquitylating enzym Protectin jest wymagane w celu utrzymania ulicy. W ten sposób niezwiązane kinetochory utrzymują punkt kontrolny, stale odtwarzając podkompleks MAD2-CDC20 z jego komponentów. SAC może być również dezaktywowany przez proteolizę indukowaną aktywacją APC . Ponieważ SAC nie jest reaktywowany przez utratę kohezji chromatyd siostrzanych podczas anafazy, proteoliza cykliny B i inaktywacja kinazy CDK1-cyklina-B również hamuje aktywność SAC. Degradacja MPS1 podczas anafazy zapobiega reaktywacji SAC po usunięciu kohezji chromatyd siostrzanych. Po dezaktywacji punktu kontrolnego i podczas normalnej anafazy cyklu komórkowego, kompleks promujący anafazę jest aktywowany poprzez zmniejszenie aktywności MCC. Gdy to się stanie, kompleks enzymatyczny polyubiquitinates inhibitor anafaza securin . Ubikwitynacja i zniszczenie sekuryny pod koniec metafazy uwalnia aktywną proteazę zwaną separazą. Separaza rozszczepia cząsteczki kohezyjne, które utrzymują razem chromatydy siostrzane, aby aktywować anafazę.

Nowy model dezaktywacji SAC u S. cerevisiae : wyłącznik mechaniczny

Zasugerowano nowy mechanizm wyjaśniający, w jaki sposób przyczepienie mikrotubul na końcach do kinetochoru może zakłócać określone etapy sygnalizacji SAC. W nieprzyłączonym kinetochorze pierwszym krokiem w tworzeniu MCC jest fosforylacja Spc105 przez kinazę Mps1. Fosforylowane Spc105 jest następnie zdolne do rekrutacji białek sygnałowych Bub1 i 3 w dół; Szalony 1,2 i 3; i Cdc20. Skojarzenie z Mad1 w nieprzywiązanych kinetochorach powoduje, że Mad2 przechodzi zmianę konformacyjną, która przekształca go z formy otwartej (O-Mad2) do formy zamkniętej (C-Mad2.) C-Mad2 związany z Mad1 następnie dimeryzuje z drugim O-Mad2 i katalizuje jego zamknięcie wokół Cdc20. Ten kompleks C-Mad2 i Cdc20, MCC, pozostawia Mad1 i C-Mad2 w kinetochorze, tworząc kolejny MCC. Każdy z MCC sekwestruje dwie cząsteczki Cdc20, aby zapobiec ich interakcji z APC/C, utrzymując w ten sposób SAC. Fosforylacja Spc105 przez Mps1 jest zarówno konieczna, jak i wystarczająca do zainicjowania szlaku sygnałowego SAC, ale ten etap może nastąpić tylko przy braku przyłączenia mikrotubul do kinetochoru. Wykazano, że endogenny Mps1 łączy się z domeną homologii kalponinowej (CH) Ndc80, która znajduje się w zewnętrznym regionie kinetochoru, który jest odległy od chromosomu. Chociaż Mps1 jest zadokowany w zewnętrznym kinetochorze, nadal jest w stanie zlokalizować się w wewnętrznym kinetochorze i fosforylować Spc105 ze względu na elastyczne regiony zawiasowe na Ndc80. Jednak model mechanicznego przełącznika sugeruje, że zamocowanie mikrotubuli do kinetochoru na końcu dezaktywuje SAC za pomocą dwóch mechanizmów. Obecność przyłączonej mikrotubuli zwiększa odległość między domeną CH Ndc80 a Spc105. Dodatkowo Dam1/DASH, duży kompleks składający się ze 160 białek tworzących pierścień wokół przyłączonej mikrotubuli, działa jako bariera między tymi dwoma białkami. Separacja zapobiega oddziaływaniom między Mps1 i Spc105, a tym samym hamuje szlak sygnałowy SAC.

Należy zauważyć, że ten model nie ma zastosowania do regulacji SAC u organizmów wyższego rzędu, w tym zwierząt. Głównym aspektem mechanizmu przełącznika mechanicznego jest to, że u S. cerevisiae struktura kinetochoru pozwala na przyłączenie tylko jednej mikrotubuli. Z drugiej strony kinetochory u zwierząt są znacznie bardziej złożonymi siatkami zawierającymi miejsca wiązania wielu mikrotubul. Przyłączenie mikrotubul we wszystkich miejscach wiązania kinetochoru nie jest konieczne do dezaktywacji SAC i przejścia do anafazy. Dlatego stany związane z mikrotubulami i niezwiązane z mikrotubulami współistnieją w kinetochorze zwierząt, podczas gdy SAC jest zahamowany. Model ten nie zawiera bariery, która zapobiegałaby fosforylacji Spc105 w sąsiednim nieprzyłączonym kinetochorze przez Mps1 związany z przyłączonym kinetochorem. Ponadto drożdżowy kompleks Dam1/DASH nie występuje w komórkach zwierzęcych.

Wady punktu kontrolnego wrzeciona i rak

Nieprawidłowe działanie punktu kontrolnego wrzeciona może prowadzić do nieprawidłowej segregacji chromosomów, aneuploidii, a nawet nowotworzenia . Transformacja zachodzi i jest przyspieszona, gdy załamuje się zachowanie integralności genomowej, zwłaszcza na ogólnym poziomie całych chromosomów lub ich dużych części. W rzeczywistości aneuploidia jest najczęstszą cechą ludzkich guzów litych, a zatem punkt kontrolny zespołu wrzeciona można uznać za możliwy cel terapii przeciwnowotworowej. Jest to mało doceniany fakt, ponieważ uważa się, że mutacje w określonych genach, znanych jako onkogeny lub supresory nowotworu, są przede wszystkim odpowiedzialne za niestabilność genetyczną i onkogenezę. Zwykle różne punkty kontrolne w cyklu komórkowym dbają o integralność genomową poprzez wysoce konserwatywne, nadmiarowe mechanizmy, które są ważne dla utrzymania homeostazy komórkowej i zapobiegania nowotworzenia. Kilka białek punktu kontrolnego składania wrzeciona działa zarówno jako pozytywne, jak i negatywne regulatory, aby zapewnić prawidłową segregację chromosomów w każdym cyklu komórkowym, zapobiegając niestabilności chromosomów (CIN), znanej również jako niestabilność genomu .

Analiza cytometryczna raka złośliwego wykazującego aneuploidię

Integralność genomowa jest obecnie doceniana na kilku poziomach, gdzie niektóre nowotwory wykazują niestabilność objawiającą się podstawieniami, insercjami i delecjami zasad, podczas gdy większość wykazuje przyrost lub utratę całych chromosomów.

Ze względu na fakt, że zmiany w mitotycznych białkach regulatorowych mogą prowadzić do aneuploidii, co jest częstym zjawiskiem w raku , początkowo sądzono, że te geny mogą ulec mutacji w tkankach nowotworowych.

Zmutowane geny w nowotworach

W przypadku niektórych nowotworów dobrze scharakteryzowano geny leżące u podstaw defektów prowadzących do transformacji. W nowotworach hematologicznych, takich jak szpiczak mnogi, nieprawidłowości cytogenetyczne są bardzo częste ze względu na nieodłączny charakter pęknięć DNA potrzebnych do rearanżacji genów immunoglobulin. Jednak defekty w białkach, takich jak MAD2, które działają głównie w SAC, również charakteryzują się szpiczakiem mnogim. Większość guzów litych jest również głównie aneuploidalna. W przypadku raka jelita grubego, BUB1 i BUBR1 oraz amplifikacja STK15 są kluczowymi regulatorami, które biorą udział w niestabilności genomowej prowadzącej do raka. W raku piersi forma genetyczna charakteryzująca się genem BRCA-1 wykazuje wyższy poziom niestabilności genomowej niż formy sporadyczne. Eksperymenty wykazały, że myszy zerowe BRCA-1 mają obniżoną ekspresję kluczowego białka MAD2 punktu kontrolnego wrzeciona. W przypadku innych nowotworów konieczne są dalsze prace w celu zidentyfikowania przyczyn aneuploidii.

Inne geny niezwiązane tradycyjnie z SAC w przypadku raka

Wyraźnie różnice w poziomach fizjologicznych tych białek (takich jak Mad2 lub BubR1) są związane z aneuploidią i onkogenezą, co wykazano na modelach zwierzęcych . Jednak ostatnie badania wskazują, że to, co wydaje się mieć miejsce, jest bardziej skomplikowanym scenariuszem: aneuploidia prowadziłaby do wysokiej częstości onkogenezy tylko wtedy, gdy zmiany w poziomach określonych elementów mitotycznych punktów kontrolnych (redukcja lub nadekspresja) w tkankach powodują również inne defekty zdolne do predysponować je do nowotworów. Oznacza to defekty, takie jak wzrost uszkodzenia DNA, rearanżacje chromosomowe i/lub zmniejszona częstość śmierci komórek. Wiadomo, że w przypadku niektórych elementów mitotycznych punktów kontrolnych są one związane z funkcjami poza mitozą: importem jądrowym (Mad1), represją transkrypcji (Bub3) i śmiercią komórki, odpowiedzią na uszkodzenie DNA, starzeniem się i megakariopoezą dla BubR1. Wszystko to potwierdza wniosek, że wzrost onkogenezy jest związany z defektami innymi niż sama aneuploidia.

Mutacje związane z rakiem wpływające na znane geny punktów kontrolnych, takie jak BUB1 lub BUBR1 są w rzeczywistości rzadkie. Jednak kilka białek związanych z rakiem ma przecięcia z sieciami zespołów wrzecion. Kluczowe supresory nowotworów, takie jak p53, również odgrywają rolę w punkcie kontrolnym wrzeciona. Brak p53, najczęściej zmutowanego genu w ludzkim raku, ma duży wpływ na regulatory punktów kontrolnych cyklu komórkowego i wykazano w przeszłości, że działa w punkcie kontrolnym G1, ale teraz wydaje się być również ważny w regulacji punktu kontrolnego wrzeciona. Innym kluczowym aspektem raka jest hamowanie śmierci komórek lub apoptozy . Surwiwina , członek rodziny inhibitorów apoptozy (IAP), jest zlokalizowana w pulach w mikrotubulach wrzeciona mitotycznego w pobliżu centrosomów oraz w kinetochorach chromosomów metafazowych. Surwiwina nie tylko hamuje apoptozę w celu promowania onkogenezy, ale została powiązana (poprzez eksperymentalne myszy knockout) jako ważny regulator segregacji chromosomów i późnego stadium mitozy, podobnie jak jej rola w bardziej prymitywnych organizmach.

Inne aspekty punktu kontrolnego zespołu wrzeciona, takie jak przyczepność kinetochoru, funkcja mikrotubul i kohezja chromatydy siostrzanej, prawdopodobnie również będą wadliwe, powodując aneuploidię. Zaobserwowano, że komórki rakowe dzielą się w wielu kierunkach, omijając punkt kontrolny zespołu wrzeciona, co skutkuje wielobiegunowymi mitozami. Wielobiegunowe przejście metafaza-anafaza zachodzi poprzez niepełny cykl separacji, który skutkuje częstymi zdarzeniami niedysjunkcyjnymi, które wzmacniają aneuploidię w komórkach rakowych.

Terapie przeciwnowotworowe SAC

Struktura chemiczna paklitakselu lub TAXOL, inhibitora mitotycznego stosowanego w chemioterapii nowotworów

Postępy w tej dziedzinie doprowadziły do ​​opracowania niektórych terapii ukierunkowanych na defekty montażu wrzecion. Starsze metody leczenia, takie jak alkaloidy barwinka i taksany, są ukierunkowane na mikrotubule towarzyszące tworzeniu wrzeciona mitotycznego poprzez zakłócenie dynamiki mikrotubul, które angażują SAC, zatrzymując komórkę i ostatecznie prowadząc do jej śmierci. Taksol i Docetaksel są nadal stosowane w leczeniu raka piersi, raka jajnika i innych rodzajów raka nabłonkowego. Jednak te terapie często charakteryzują się wysokim wskaźnikiem skutków ubocznych i lekoopornością.

Realizowane są również inne cele w ramach sieci organów regulacyjnych, które mają wpływ na SAC; duże zainteresowanie przesunęło się w kierunku białek kinazy aurora . Gen kinazy Aurora A po amplifikacji działa jak onkogen nadrzędny nad SAC, prowadząc do nieprawidłowej inicjacji anafazy i następującej po niej aneuploidii, a także oporności na TAXOL. Co ciekawe, drobnocząsteczkowy inhibitor Aurora A wykazał działanie przeciwnowotworowe w modelu in vivo, co sugeruje, że może to być dobry cel dla dalszego rozwoju klinicznego. Inhibitory Aurora B , które również znajdują się w fazie rozwoju klinicznego, prowadzą do nieprawidłowego kinetochoru przyczepiania się do mikrotubul, a także znoszą mitotyczny punkt kontrolny. Surwiwina jest również atrakcyjnym celem molekularnym dla klinicznego rozwoju terapeutycznego, ponieważ działa jako główny węzeł w wielu szlakach, z których jednym jest tworzenie wrzeciona i kontrola punktów kontrolnych. Jeszcze inne podejścia obejmowały spojrzenie na hamowanie mitotycznych białek motorycznych, takich jak KSP. Inhibitory te, które niedawno weszły do ​​badań klinicznych, powodują zatrzymanie mitotyczne i poprzez włączenie punktu kontrolnego zespołu wrzeciona wywołują apoptozę.

Bibliografia

Dalsza lektura

Zewnętrzne linki