Wektor wirusowy - Viral vector

Wektory wirusowe to narzędzia powszechnie używane przez biologów molekularnych do dostarczania materiału genetycznego do komórek . Proces ten może odbywać się wewnątrz żywego organizmu ( in vivo ) lub w hodowli komórkowej ( in vitro ). Wirusy wykształciły wyspecjalizowane mechanizmy molekularne, aby skutecznie transportować swoje genomy do zakażonych komórek. Dostarczanie genów lub innego materiału genetycznego przez wektor nazywa się transdukcją, a zakażone komórki określa się jako transdukowane. Biolodzy molekularni po raz pierwszy wykorzystali tę maszynerię w latach siedemdziesiątych. Paul Berg użył zmodyfikowanego wirusa SV40 zawierającego DNA z bakteriofaga λ do zakażenia komórek nerki małpy utrzymywanych w hodowli.

Oprócz zastosowania w badaniach biologii molekularnej wektory wirusowe są wykorzystywane do terapii genowej i opracowywania szczepionek .

Kluczowe właściwości wektora wirusowego

Wektory wirusowe są dostosowane do ich konkretnych zastosowań, ale generalnie mają kilka kluczowych właściwości.

• Bezpieczeństwo : Chociaż wektory wirusowe są czasami tworzone z wirusów chorobotwórczych , są one modyfikowane w taki sposób, aby zminimalizować ryzyko związane z ich obchodzeniem się. Zwykle wiąże się to z delecją części genomu wirusa, krytycznej dla replikacji wirusa . Taki wirus może skutecznie infekować komórki, ale po zakażeniu wymaga wirusa pomocniczego, który dostarczy brakujące białka do produkcji nowych wirionów .
• Niska toksyczność : wektor wirusowy powinien mieć minimalny wpływ na fizjologię zainfekowanej komórki.
• Stabilność : Niektóre wirusy są niestabilne genetycznie i mogą szybko zmieniać swoje genomy. Jest to szkodliwe dla przewidywalności i odtwarzalności prac prowadzonych przy użyciu wektora wirusowego i unika się tego w ich projektowaniu.
• Specyficzność typu komórki : Większość wektorów wirusowych jest zaprojektowana tak, aby infekować jak najszerszy zakres typów komórek . Czasami jednak preferowane jest odwrotne rozwiązanie. Receptor wirusowy można zmodyfikować tak, aby kierował wirusa do określonego rodzaju komórki. Mówi się, że wirusy zmodyfikowane w ten sposób są pseudotypowane .
• Identyfikacja : wektory wirusowe często otrzymują pewne geny, które pomagają zidentyfikować, które komórki przejęły geny wirusa. Te geny nazywane są markerami . Powszechnym markerem jest oporność na pewien antybiotyk. Komórki można następnie łatwo wyizolować, ponieważ te, które nie wchłonęły genów wektora wirusowego, nie mają oporności na antybiotyki, a zatem nie mogą rosnąć w hodowli z obecnym odpowiednim antybiotykiem.

Aplikacje

Podstawowe badania

Wektory wirusowe były początkowo opracowane jako alternatywa do transfekcji z nagim DNA do genetyki molekularnej eksperymentów. W porównaniu z tradycyjnymi metodami transfekcji (takimi jak wytrącanie fosforanem wapnia ), transdukcja może zapewnić, że prawie 100% komórek zostanie zainfekowanych bez poważnego wpływu na żywotność komórek. Ponadto niektóre wirusy integrują się z genomem komórki, ułatwiając stabilną ekspresję.

Białko geny kodujące mogą być wyrażane za pomocą wektorów wirusowych, powszechnie do badania funkcji konkretnego białka. Wektory wirusowe, zwłaszcza retrowirusy, stabilnie eksprymujące geny markerowe, takie jak GFP, są szeroko stosowane do trwałego znakowania komórek w celu śledzenia ich i ich potomstwa, na przykład w doświadczeniach z ksenotransplantacją , gdy komórki zakażone in vitro wszczepia się zwierzęciu-gospodarzowi.

Insercja genów , którą można przeprowadzić za pomocą wektorów wirusowych, jest tańsza do przeprowadzenia niż nokaut genu . Ale ponieważ wyciszanie genów , efekt, który może być zamierzony z insercją genów, jest czasami niespecyficzny i ma wpływ na inne geny, co zapewnia mniej wiarygodne wyniki. Ważną rolę odgrywają również wektory-żywiciel zwierzęcy .

Terapia genowa

Terapia genowa to technika korygowania wadliwych genów odpowiedzialnych za rozwój choroby. W przyszłości terapia genowa może stanowić sposób na wyleczenie zaburzeń genetycznych , takich jak ciężki złożony niedobór odporności , mukowiscydoza czy nawet hemofilia A . Ponieważ choroby te wynikają z mutacji w sekwencji DNA określonych genów, próby terapii genowej wykorzystywały wirusy do dostarczania niezmutowanych kopii tych genów do komórek ciała pacjenta. Odnotowano ogromną liczbę sukcesów laboratoryjnych związanych z terapią genową. Jednak kilka problemów związanych z wirusową terapią genową musi zostać przezwyciężonych, zanim stanie się ona powszechnie stosowana. Odpowiedź immunologiczna na wirusy nie tylko utrudnia dostarczanie genów do komórek docelowych, ale może powodować poważne komplikacje u pacjenta. W jednej z pierwszych prób terapii genowej w 1999 roku doprowadziło to do śmierci Jessego Gelsingera , który był leczony wektorem adenowirusowym.

Niektóre wektory wirusowe, na przykład gamma-retrowirusy , umieszczają swoje genomy w pozornie losowym miejscu na jednym z chromosomów gospodarza , co może zaburzać funkcję genów komórkowych i prowadzić do raka. W próbie ciężkiej złożonej terapii genowej z niedoborem odporności, przeprowadzonej w 2002 roku, czterech pacjentów rozwinęło białaczkę w wyniku leczenia; trzech pacjentów wyzdrowiało po chemioterapii. Wektory oparte na wirusach związanych z adenowirusem są pod tym względem znacznie bezpieczniejsze, ponieważ zawsze integrują się w tym samym miejscu w genomie człowieka, znajdując zastosowanie w różnych zaburzeniach, takich jak choroba Alzheimera .

Szczepionki

Żywa szczepionka wektorowa jest szczepionka , która wykorzystuje organizmu (zwykle bakterii lub wirusa), która nie powoduje choroby transportu geny patogenu do organizmu w celu stymulowania odpowiedzi immunologicznej . Wirusy eksprymujące białka patogenów są obecnie opracowywane jako szczepionki przeciwko tym patogenom, w oparciu o te same przesłanki, co szczepionki DNA . Geny stosowane w takich szczepionkach są zazwyczaj białkami powierzchniowymi kodującymi antygen z organizmu chorobotwórczego . Są one następnie wprowadzane do genomu niepatogennego organizmu, gdzie ulegają ekspresji na powierzchni organizmu i mogą wywołać odpowiedź immunologiczną.

W przeciwieństwie do szczepionek atenuowanych, w szczepionkach zawierających wektory wirusowe brakuje innych genów patogenów wymaganych do replikacji, więc zakażenie patogenem jest niemożliwe. Adenowirusy są aktywnie rozwijane jako wektory szczepionkowe.

Dostawa leków

Szczep wirusa ospy kanarków zmodyfikowany do przenoszenia kociej interleukiny-2 jest stosowany w leczeniu kotów z włókniakomięsakiem .

Rodzaje

Retrowirusy

Retrowirusy są jednym z filarów obecnych podejść do terapii genowej. Rekombinowane retrowirusy, takie jak wirus mysiej białaczki Moloneya, mają zdolność stabilnej integracji z genomem gospodarza. Zawierają odwrotną transkryptazę do tworzenia kopii DNA genomu RNA oraz integrazę, która umożliwia integrację z genomem gospodarza . Były używane w wielu zatwierdzonych przez FDA badaniach klinicznych, takich jak badanie SCID-X1 .

Wektory retrowirusowe mogą być zdolne do replikacji lub niezdolne do replikacji. Najczęstszym wyborem w badaniach są wektory z defektem replikacji, ponieważ wirusy mają regiony kodujące geny niezbędne do dodatkowych rund replikacji i pakowania wirionów zastąpione innymi genami lub usunięte. Wirusy te są w stanie infekować komórki docelowe i dostarczać swój ładunek wirusowy, ale następnie nie są w stanie kontynuować typowego szlaku litycznego, który prowadzi do lizy komórki i śmierci.

Odwrotnie, wektory wirusowe zdolne do replikacji zawierają wszystkie niezbędne geny do syntezy wirionów i kontynuują rozprzestrzenianie się po wystąpieniu infekcji. Ponieważ genom wirusowy dla tych wektorów jest znacznie dłuższy, długość faktycznie wstawionego genu będącego przedmiotem zainteresowania jest ograniczona w porównaniu z możliwą długością wstawki dla wektorów niezdolnych do replikacji. W zależności od wektora wirusowego, typowa maksymalna długość dopuszczalnej wstawki DNA w wektorze wirusowym niezdolnym do replikacji wynosi zwykle około 8–10 kB. Chociaż ogranicza to wprowadzanie wielu sekwencji genomowych, większość sekwencji cDNA nadal może być dostosowana.

Podstawowa wada stosowania retrowirusów, takich jak retrowirus Moloney'a, obejmuje wymaganie aktywnego podziału komórek w celu transdukcji . W rezultacie komórki takie jak neurony są bardzo odporne na infekcje i transdukcję przez retrowirusy.

Istnieje obawa, że mutageneza insercyjna spowodowana integracją z genomem gospodarza może prowadzić do raka lub białaczki . Obawa ta pozostała teoretyczna do czasu, gdy terapia genowa dziesięciu pacjentów ze SCID-X1 przy użyciu wirusa mysiej białaczki Moloneya spowodowała dwa przypadki białaczki spowodowanej aktywacją onkogenu LMO2 z powodu pobliskiej integracji wektora.

lentiwirusy

Lentiwirusy są podklasą Retrowirusów. Czasami są wykorzystywane jako wektory do terapii genowej dzięki ich zdolności do integracji z genomem niedzielących się komórek, co jest unikalną cechą Lentiwirusów, ponieważ inne Retrowirusy mogą infekować tylko dzielące się komórki. Genom wirusowy w postaci RNA jest poddawany odwrotnej transkrypcji, gdy wirus wchodzi do komórki w celu wytworzenia DNA , który jest następnie wstawiany do genomu w losowej pozycji (ostatnie odkrycia faktycznie sugerują, że wstawienie wirusowego DNA nie jest przypadkowe, ale skierowane do specyficzne geny aktywne i związane z organizacją genomu) przez wirusowy enzym integrazę . Wektor, obecnie nazywany prowirusem , pozostaje w genomie i jest przekazywany potomstwu komórki podczas podziału. Jak dotąd nie ma technik określania miejsca integracji, co może stanowić problem. Prowirus może zaburzać funkcje genów komórkowych i prowadzą do aktywacji onkogenów promujących rozwój z rakiem , co zwiększa obawy co do możliwych zastosowań lentiwirusów w terapii genowej. Jednak badania wykazały, że wektory lentiwirusowe mają mniejszą tendencję do integrowania się w miejscach potencjalnie powodujących raka niż wektory gamma-retrowirusowe. Dokładniej, jedno z badań wykazało, że wektory lentiwirusowe nie powodowały ani wzrostu zachorowalności na nowotwory, ani wcześniejszego wystąpienia nowotworów u szczepu myszy o znacznie większej częstości występowania nowotworów. Co więcej, badania kliniczne, w których stosowano wektory lentiwirusowe do dostarczania terapii genowej do leczenia HIV, nie wykazały wzrostu zdarzeń mutagennych ani onkologicznych.

Ze względów bezpieczeństwa wektory lentiwirusowe nigdy nie zawierają genów wymaganych do ich replikacji. Aby wyprodukować lentiwirus kilka plazmidy są transfekowane do tzw pakowanie linii komórkowej , powszechnie HEK 293 . Jeden lub więcej plazmidów, ogólnie określanych jako plazmidy pakujące, koduje białka wirionu , takie jak kapsyd i odwrotna transkryptaza . Inny plazmid zawiera materiał genetyczny dostarczany przez wektor. Jest on transkrybowany w celu wytworzenia genomu wirusowego jednoniciowego RNA i jest oznaczony obecnością sekwencji ψ (psi). Ta sekwencja jest używana do pakowania genomu do wirionu.

Adenowirusy

W przeciwieństwie do lentiwirusów, adenowirusowy DNA nie integruje się z genomem i nie ulega replikacji podczas podziału komórki. Ogranicza to ich zastosowanie w badaniach podstawowych, chociaż wektory adenowirusowe są nadal wykorzystywane w eksperymentach in vitro, a także in vivo . Ich główne zastosowania to terapia genowa i szczepienia . Ponieważ ludzie często stykają się z adenowirusami , które powodują infekcje dróg oddechowych, przewodu pokarmowego i oczu, większość pacjentów wytworzyła już przeciwciała neutralizujące, które mogą inaktywować wirusa, zanim dotrze on do komórki docelowej. Aby rozwiązać ten problem, naukowcy badają obecnie adenowirusy, które infekują różne gatunki, na które ludzie nie mają odporności, na przykład adenowirus szympansa używany jako wektor do transportu genu wypustki SARS - CoV - 2 w szczepionce Oxford AstraZeneca COVID.

Wirusy związane z adenowirusami

Wirus związany z adenowirusem (AAV) to mały wirus, który zaraża ludzi i niektóre inne gatunki naczelnych. Obecnie nie wiadomo, czy AAV powoduje chorobę i powoduje bardzo łagodną odpowiedź immunologiczną. AAV może infekować zarówno dzielące się, jak i niedzielące się komórki i może włączać swój genom do genomu komórki gospodarza. Co więcej, AAV w większości pozostaje episomalny (replikuje się bez włączenia do chromosomu); wykonywanie długiej i stabilnej wypowiedzi. Cechy te sprawiają, że AAV jest bardzo atrakcyjnym kandydatem do tworzenia wektorów wirusowych do terapii genowej. Jednak AAV może przenosić tylko do 5 kb, co jest znacznie mniejsze w porównaniu z oryginalną pojemnością AAV.

Co więcej, ze względu na jego potencjalne zastosowanie jako wektora terapii genowej, naukowcy stworzyli zmieniony AAV zwany samokomplementarnym wirusem adenowirusowym (scAAV). Podczas gdy AAV pakuje pojedynczą nić DNA i wymaga procesu syntezy drugiej nici, scAAV pakuje obie nici, które łączą się ze sobą, tworząc dwuniciowy DNA. Poprzez pominięcie syntezy drugiej nici scAAV umożliwia szybką ekspresję w komórce. Poza tym scAAV ma wiele cech swojego odpowiednika AAV.

Wirusy roślinne

Wirusy roślinne można wykorzystać do inżynierii wektorów wirusowych, narzędzi powszechnie stosowanych do dostarczania materiału genetycznego do komórek roślinnych ; są również źródłem biomateriałów i urządzeń nanotechnologicznych. Wirus mozaiki tytoniu (TMV) jest pierwszym odkrytym wirusem. Wektory wirusowe oparte na wirusie mozaiki tytoniu obejmują te z technologii ekspresji roślinnej magnICON i TRBO.

Hybrydy

Wektory hybrydowe to wirusy wektorowe, które zostały genetycznie zmodyfikowane tak, aby miały cechy więcej niż jednego wektora. Wirusy są zmieniane w celu uniknięcia wad typowych wektorów wirusowych, które mogą mieć ograniczoną zdolność ładowania, immunogenność, genotoksyczność i nie wspierać długotrwałej odpowiedniej ekspresji transgenicznej . Poprzez zastąpienie niepożądanych elementów pożądanymi zdolnościami, wektory hybrydowe mogą w przyszłości przewyższyć standardowe wektory transfekcyjne pod względem bezpieczeństwa i skuteczności terapeutycznej.

Wyzwania w aplikacji

Wybór wektora wirusowego do dostarczania materiału genetycznego do komórek wiąże się z pewnymi problemami logistycznymi. Istnieje ograniczona liczba wektorów wirusowych dostępnych do użytku terapeutycznego. Każdy z tych kilku wektorów wirusowych może spowodować, że organizm rozwinie odpowiedź immunologiczną, jeśli wektor jest postrzegany jako obcy najeźdźca. Raz użyty wektor wirusowy nie może być ponownie skutecznie wykorzystany u pacjenta, ponieważ zostanie rozpoznany przez organizm. Jeśli szczepionka lub terapia genowa zakończą się niepowodzeniem w badaniach klinicznych , wirusa nie można w przyszłości ponownie wykorzystać u pacjenta do innej szczepionki lub terapii genowej.

U pacjenta może również występować istniejąca wcześniej odporność na wektor wirusowy, co czyni terapię nieskuteczną dla tego pacjenta. Ponieważ szczepienie szczepionką z nagim DNA i wzmacnianie wektorem wirusowym skutkuje silną odpowiedzią immunologiczną poprzez jeszcze nieokreślone mechanizmy, pomimo istniejącej wcześniej odporności na wektory wirusowe, ta strategia szczepienia może przeciwdziałać temu problemowi. Jednak ten sposób może stanowić inny koszt i przeszkodę w procesie dystrybucji szczepionki. Istniejąca wcześniej odporność może być również zagrożona przez zwiększenie dawki szczepionki lub zmianę drogi szczepienia .

Niektóre wady wektorów wirusowych (takie jak genotoksyczność i niska ekspresja transgeniczna) można przezwyciężyć przez zastosowanie wektorów hybrydowych .

Zobacz też

• Transformacja wirusowa

Bibliografia

Dalsza lektura

• Torashima, T.; Koyama, C.; Higashida, H.; Hirai, H. (2007). „Produkcja neuronów preferencyjnych wektorów lentiwirusowych”. Wymiana protokołu . doi : 10.1038/prot.2007.89 .
• Okada, Y.; Ikawa, M. (2007). „Swoista manipulacja genów łożyska przez transdukcję wolnej od strefy blastocysty przy użyciu wektora lentiwirusowego”. Wymiana protokołu . doi : 10.1038/prot.2007.62 .
• Fry JW, Wood KJ (8 czerwca 1999). „Porównanie wektorów stosowanych do klinicznego transferu genów” . Opinie ekspertów w medycynie molekularnej .