Ciało embrionalne - Embryoid body
Ciała zarodkowe ( EB ) to trójwymiarowe agregaty pluripotencjalnych komórek macierzystych .
EB to różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w ciała embrionalne, które naruszają trzy embrionalne listki zarodkowe.
Tło
Typy komórek pluripotencjalnych, które zawierają ciała embrionalne, obejmują embrionalne komórki macierzyste (ESC) pochodzące z stadium blastocysty zarodków mysich (mESC), naczelnych i ludzkich (hESC). Dodatkowo, EB mogą być tworzone z embrionalnych komórek macierzystych uzyskanych za pomocą alternatywnych technik, w tym przeniesienia jądra komórki somatycznej lub przeprogramowania komórek somatycznych w celu uzyskania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS). Podobnie jak ESC hodowane w formatach jednowarstwowych , ESC w ciałach zarodkowych przechodzą różnicowanie i specyfikację komórek wzdłuż trzech linii zarodkowych – endodermy, ektodermy i mezodermy – które obejmują wszystkie typy komórek somatycznych .
Jednak w przeciwieństwie do hodowli jednowarstwowych, struktury sferoidalne, które tworzą się, gdy ESC agregują, umożliwiają nieprzyległą hodowlę EB w zawiesinie, dzięki czemu kultury EB są z natury skalowalne, co jest przydatne w podejściach do bioprzetwarzania, dzięki czemu można wytwarzać duże ilości komórek do potencjalne zastosowania kliniczne. Dodatkowo, chociaż EB w dużej mierze wykazują heterogeniczne wzorce zróżnicowanych typów komórek, ESC są zdolne do reagowania na podobne sygnały, które kierują rozwojem embrionalnym . W związku z tym trójwymiarowa struktura, w tym ustanowienie złożonych adhezji komórek i sygnalizacji parakrynnej w mikrośrodowisku EB, umożliwia różnicowanie i morfogenezę, w wyniku której powstają mikrotkanki podobne do natywnych struktur tkankowych. Takie mikrotkanki są obiecujące w bezpośredniej lub pośredniej naprawie uszkodzonej lub chorej tkanki w zastosowaniach medycyny regeneracyjnej, a także w testach in vitro w przemyśle farmaceutycznym oraz jako model rozwoju embrionalnego.
Tworzenie
EB są tworzone przez homofilne wiązanie zależnej od Ca2+ cząsteczki adhezyjnej E-kadheryny , która jest silnie eksprymowana na niezróżnicowanych ESC. W przypadku hodowli jako pojedyncze komórki przy braku czynników przeciwdziałających różnicowaniu, ESC spontanicznie agregują, tworząc EB. Takie spontaniczne tworzenie jest często osiągane w hodowlach zawiesinowych masowych, w których szalkę powleka się materiałami nieadhezyjnymi, takimi jak agar lub polimery hydrofilowe, w celu promowania preferencyjnej adhezji między pojedynczymi komórkami, a nie do podłoża hodowli. Ponieważ hESC ulega apoptozie, gdy są hodowane jako pojedyncze komórki, tworzenie EB często wymaga zastosowania inhibitorów szlaku kinazy związanej z rho (ROCK), w tym małych cząsteczek Y-27632 i 2,4 dipodstawionego tiazolu (Tiazowiwina/Tzv). Alternatywnie, aby uniknąć dysocjacji na pojedyncze komórki, EB można wytworzyć z hESC przez ręczne oddzielenie przylegających kolonii (lub regionów kolonii), a następnie hodować w zawiesinie. Tworzenie EB w zawiesinie jest podatne na tworzenie dużych ilości EB, ale zapewnia niewielką kontrolę nad wielkością powstałych agregatów, często prowadząc do dużych, nieregularnych kształtów EB. Alternatywnie, siły hydrodynamiczne wywierane na platformy hodowli mieszanej zwiększają jednorodność rozmiarów EB, gdy ESC są inokulowane w zawiesinach masowych.
Tworzenie się EB może być również bardziej precyzyjnie kontrolowane przez inokulację znanych gęstości komórek w pojedynczych kroplach (10-20 µl) zawieszonych na pokrywce szalki Petriego, znanych jako wiszące krople. Chociaż ta metoda umożliwia kontrolę wielkości EB poprzez zmianę liczby komórek na kroplę, tworzenie wiszących kropli jest pracochłonne i niełatwo podatne na skalowalne hodowle. Dodatkowo, pożywki nie można łatwo wymienić w tradycyjnym formacie wiszących kropli, co wymaga przeniesienia wiszących kropli do kultur zawiesinowych masowych po 2-3 dniach tworzenia, przez co poszczególne EB mają tendencję do aglomeracji. Ostatnio opracowano nowe technologie umożliwiające wymianę mediów w zmodyfikowanym formacie wiszącej kropli. Ponadto opracowano również technologie fizycznego oddzielania komórek poprzez wymuszoną agregację ESC w poszczególnych dołkach lub na podłożu adhezyjnym, co umożliwia zwiększenie przepustowości i kontrolowane tworzenie EB. Ostatecznie metody stosowane do tworzenia EB mogą wpływać na heterogeniczność populacji EB pod względem kinetyki agregacji, wielkości i wydajności EB, a także trajektorii różnicowania.
Zróżnicowanie w ramach EB
W kontekście protokołów różnicowania ESC , tworzenie EB jest często używane jako metoda inicjacji spontanicznego różnicowania w kierunku trzech linii zarodkowych . Różnicowanie EB zaczyna się od określenia zewnętrznych komórek w kierunku prymitywnego fenotypu endodermy. Komórki na zewnątrz następnie odkładają macierz zewnątrzkomórkową (ECM), zawierającą kolagen IV i lamininę , podobną do składu i struktury błony podstawnej . W odpowiedzi na odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej, EBs często tworzą jamę torbielowatą, w której komórki w kontakcie z błoną podstawną pozostają żywe, a te we wnętrzu przechodzą apoptozę, w wyniku czego powstaje wypełniona płynem jama otoczona komórkami. Kolejne różnicowanie prowadzi do powstania pochodnych trzech linii zarodkowych. W przypadku braku suplementów, „domyślne” zróżnicowanie ESC dotyczy głównie ektodermy i późniejszych linii neuronalnych . Jednakże, w celu promowania różnicowania w kierunku linii mezodermy i endodermy opracowano alternatywne kompozycje pożywek, w tym zastosowanie płodowej surowicy bydlęcej, jak również określonych dodatków czynnika wzrostu .
W wyniku trójwymiarowej struktury EB podczas różnicowania EB zachodzi złożona morfogeneza, obejmująca pojawienie się populacji komórek zarówno nabłonkowych, jak i mezenchymalnych, a także pojawienie się markerów związanych z przejściem nabłonkowo-mezenchymalnym (EMT). Dodatkowo efekty indukcyjne wynikające z sygnalizacji między populacjami komórek w EB powodują zmiany przestrzennie i czasowo określone, które sprzyjają złożonej morfogenezie . Struktury tkankowe są często widoczne w obrębie EB, w tym pojawienie się wysp krwi przypominających wczesne struktury naczyń krwionośnych w rozwijającym się zarodku, a także wzorce rozszerzeń neurytów (wskazujące na organizację neuronów) i spontaniczną aktywność skurczową (wskazujące na różnicowanie kardiomiocytów ) gdy EB są nakładane na podłoża adhezyjne , takie jak żelatyna . Niedawno w wyniku różnicowania EB powstały złożone struktury, w tym struktury przypominające miseczkę optyczną.
Paralele z rozwojem embrionalnym
Wiele badań dotyczących różnicowania i morfogenezy embrionalnych komórek macierzystych pochodzi z badań z zakresu biologii rozwoju i embriogenezy ssaków. Na przykład, zaraz po stadium blastocysty (z którego pochodzą ESC) zarodek przechodzi gastrulację , w wyniku której komórkowa specyfikacja wewnętrznej masy komórek skutkuje powstaniem endodermy trzewnej i epiblastu . Gdy tworzy się oś przednio-tylna , zarodek rozwija przejściową strukturę znaną jako prymitywna smuga. Wiele przestrzennych wzorców, które występują podczas tworzenia i migracji prymitywnej smugi, wynika z wydzielania agonistów i antagonistów przez różne populacje komórek, w tym czynniki wzrostu z rodziny Wnt i transformującego czynnika wzrostu β (TGFβ) (Lefty 1, Nodal ), jak również represory tych samych cząsteczek (Dkk-1, Sfrp1, Sfrp5). Ze względu na podobieństwa między embriogenezą a różnicowaniem ESC, wiele z tych samych czynników wzrostu ma kluczowe znaczenie dla podejścia ukierunkowanego różnicowania.
Ponadto postęp w hodowli EB spowodował rozwój embrionalnych organoidów (gastruloidów), które wykazują niezwykłe podobieństwa do rozwoju embrionalnego, takie jak łamanie symetrii, zlokalizowana ekspresja brachyury , tworzenie osi embrionalnych (przednio-tylnej, grzbietowo-brzusznej i lewo-prawo) oraz ruchy podobne do gastrulacji.
Wyzwania w kierowaniu różnicowaniem
W przeciwieństwie do różnicowania ESC w hodowlach jednowarstwowych, w którym dodatek rozpuszczalnych morfogenów i mikrośrodowiska zewnątrzkomórkowego można precyzyjnie i jednorodnie kontrolować, trójwymiarowa struktura EB stanowi wyzwanie dla ukierunkowanego różnicowania. Na przykład, populacja endodermy trzewnej, która tworzy zewnętrzną część EB, tworzy zewnętrzną „powłokę” składającą się z ściśle połączonych komórek podobnych do nabłonka , a także gęstej macierzy zewnątrzkomórkowej . Z powodu takich fizycznych ograniczeń, w połączeniu z rozmiarem EB, w obrębie EB występują ograniczenia transportu , tworząc gradienty morfogenów, metabolitów i składników odżywczych. Oszacowano, że transport tlenu jest ograniczony w agregatach komórkowych o średnicy większej niż około 300 µm; jednak na rozwój takich gradientów ma również wpływ wielkość cząsteczek i szybkość pobierania komórek. Dlatego dostarczanie morfogenów do EB skutkuje zwiększoną heterogenicznością i zmniejszoną wydajnością zróżnicowanych populacji komórek w porównaniu z hodowlami jednowarstwowymi. Jedną z metod rozwiązywania ograniczeń transportu w EB jest dostarczanie przez polimery morfogenów z wnętrza struktury EB. Ponadto EB można hodować jako pojedyncze mikrotkanki, a następnie składać w większe struktury do zastosowań w inżynierii tkankowej. Chociaż złożoność wynikająca z trójwymiarowych adhezji i sygnalizacji może rekapitulować bardziej natywne struktury tkankowe, stwarza również wyzwania dla zrozumienia względnych wkładów sygnałów mechanicznych, chemicznych i fizycznych w powstałych fenotypach komórek i morfogenezie.