Indukowane komórki macierzyste - Induced stem cells

Indukowane komórki macierzyste ( iSC ) to komórki macierzyste pochodzące z komórek somatycznych , rozrodczych , pluripotencjalnych lub innych typów poprzez celowe przeprogramowanie epigenetyczne . Są one klasyfikowane jako totipotencjalne (iTC), pluripotencjalne (iPSC) lub progenitorowe (multipotentne – iMSC, zwane również indukowanymi multipotencjalnymi komórkami progenitorowymi – iMPC) lub unipotencjalne – (iUSC) w zależności od ich potencjału rozwojowego i stopnia odróżnicowania . Komórki progenitorowe są uzyskiwane przez tak zwane bezpośrednie przeprogramowanie lub ukierunkowane różnicowanie i nazywane są również indukowanymi somatycznymi komórkami macierzystymi .

Powszechnie znane są trzy techniki:

• Transplantacja jąder pobranych z komórek somatycznych do oocytu (komórki jajowej) pozbawionej własnego jądra (usuniętego w laboratorium)
• Fuzja komórek somatycznych z pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi i
• Przekształcenie komórek somatycznych w komórki macierzyste z wykorzystaniem materiału genetycznego kodującego przeprogramowujące czynniki białkowe , białka rekombinowane; microRNA, syntetyczny, samoreplikujący się policistronowy RNA i biologicznie aktywne substancje o niskiej masie cząsteczkowej.

Naturalne procesy

W 1895 Thomas Morgan usunął jeden z dwóch blastomerów żaby i odkrył, że z pozostałej części płazy są w stanie formować całe embriony . Oznaczało to, że komórki mogą zmienić swój szlak różnicowania. W 1924 Spemann i Mangold wykazali kluczowe znaczenie indukcji komórka-komórka podczas rozwoju zwierząt. Odwracalna transformacja komórek jednego zróżnicowanego typu komórek w inny nazywana jest metaplazją . To przejście może być częścią normalnego procesu dojrzewania lub być spowodowane przez zachętę.

Jednym z przykładów jest transformacja komórek tęczówki w komórki soczewki w procesie dojrzewania i transformacja komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w siatkówkę nerwową podczas regeneracji w oczach dorosłych traszek . Proces ten umożliwia organizmowi zastąpienie komórek nieodpowiednich do nowych warunków bardziej odpowiednimi nowymi komórkami. W krążkach urojonych Drosophila komórki muszą wybierać spośród ograniczonej liczby standardowych dyskretnych stanów różnicowania. Fakt, że transdeterminacja (zmiana ścieżki różnicowania) często zachodzi dla grupy komórek, a nie pojedynczych komórek, pokazuje, że jest ona indukowana, a nie część dojrzewania.

Naukowcom udało się zidentyfikować minimalne warunki i czynniki , które wystarczyłyby do rozpoczęcia kaskady procesów molekularnych i komórkowych w celu nakazania komórkom pluripotencjalnym organizowania zarodka . Wykazały one, że przeciwległe gradienty na białko morfogenetyczne kości (BMP) i węzłowych , dwa transformującego czynnika wzrostu członków rodziny, które działają jako morfogenów są wystarczające do wywołania molekularnych i komórkowych mechanizmów konieczne organizowanie, in vivo lub in vitro , niewykorzystane komórek z danio pręgowanego blastuli biegun zwierzęcy w dobrze rozwinięty zarodek .

Niektóre typy dojrzałych, wyspecjalizowanych dorosłych komórek mogą naturalnie powrócić do komórek macierzystych. Na przykład komórki „główne” wyrażają marker komórek macierzystych Troy. Chociaż normalnie wytwarzają płyny trawienne dla żołądka, mogą przekształcić się w komórki macierzyste, aby tymczasowo naprawić urazy żołądka, takie jak skaleczenie lub uszkodzenie spowodowane infekcją. Co więcej, mogą dokonać tego przejścia nawet przy braku zauważalnych obrażeń i są w stanie uzupełnić całe jednostki żołądkowe, w istocie służąc jako nieaktywne „rezerwowe” komórki macierzyste. Zróżnicowane komórki nabłonka dróg oddechowych mogą przekształcić się w stabilne i funkcjonalne komórki macierzyste in vivo . Po uszkodzeniu, dojrzałe ostatecznie zróżnicowane komórki nerki odróżnicują się w bardziej pierwotne wersje samych siebie, a następnie różnicują się w typy komórek wymagające wymiany w uszkodzonej tkance. Makrofagi mogą samoodnawiać się poprzez lokalną proliferację dojrzałych zróżnicowanych komórek. U traszek tkanka mięśniowa jest regenerowana z wyspecjalizowanych komórek mięśniowych, które odróżnicują się i zapominają o rodzaju komórek, którymi były. Ta zdolność do regeneracji nie zmniejsza się wraz z wiekiem i może być związana z ich zdolnością do wytwarzania na żądanie nowych komórek macierzystych z komórek mięśniowych.

Różnorodne nienowotworowe komórki macierzyste wykazują zdolność generowania wielu typów komórek. Na przykład, wieloliniowe, różnicujące komórki stresogenne (Muse) to odporne na stres dorosłe ludzkie komórki macierzyste, które mogą się samoodnawiać. Tworzą charakterystyczne skupiska komórek w hodowli zawiesinowej, które wyrażają zestaw genów związanych z pluripotencją i mogą różnicować się w komórki endodermalne , ektodermalne i mezodermalne zarówno in vitro, jak i in vivo.

Szczegółowo opisano inne dobrze udokumentowane przykłady transdyferencjacji i ich znaczenie w rozwoju i regeneracji.

Indukowane komórki totipotencjalne zwykle można uzyskać poprzez przeprogramowanie komórek somatycznych przez przeniesienie jądra komórki somatycznej (SCNT).

Indukowane komórki totipotencjalne

Za pośrednictwem SCNT

Indukowane komórki totipotencjalne można uzyskać poprzez przeprogramowanie komórek somatycznych z przeniesieniem jądra komórki somatycznej (SCNT). Proces polega na odessaniu jądra komórki somatycznej (ciała) i wstrzyknięciu go do komórki jajowej, której usunięto jądro

Stosując podejście oparte na protokole nakreślonym przez Tachibana i wsp., komórki hESC mogą być generowane przez SCNT przy użyciu jąder fibroblastów skóry zarówno od mężczyzny w średnim wieku 35, jak i starszego mężczyzny w wieku 75 lat, co sugeruje, że wiek związane z tym zmiany niekoniecznie są przeszkodą w przeprogramowaniu jądrowym ludzkich komórek w oparciu o SCNT. Takie przeprogramowanie komórek somatycznych do stanu pluripotencjalnego niesie ze sobą ogromny potencjał w medycynie regeneracyjnej . Niestety, komórki generowane tą technologią potencjalnie nie są całkowicie chronione przed układem odpornościowym pacjenta (dawcy jąder), ponieważ mają to samo mitochondrialne DNA, co dawca oocytów, zamiast mitochondrialnego DNA pacjenta. Zmniejsza to ich wartość jako źródła terapii autologicznych przeszczepów komórek macierzystych ; jak na razie nie jest jasne, czy może indukować odpowiedź immunologiczną pacjenta po leczeniu.

Indukowane androgenetyczne haploidalne embrionalne komórki macierzyste mogą być użyte zamiast plemników do klonowania. Komórki te, zsynchronizowane w fazie M i wstrzyknięte do komórki jajowej, mogą wytworzyć żywotne potomstwo.

Te osiągnięcia, wraz z danymi na temat możliwości nieograniczonej liczby oocytów z mitotycznie aktywnych reprodukcyjnych komórek macierzystych, dają możliwość przemysłowej produkcji transgenicznych zwierząt gospodarskich. Wielokrotne ponowne klonowanie żywych myszy metodą SCNT, która obejmuje inhibitor deacetylazy histonowej , trichostatynę, dodaną do pożywki do hodowli komórkowej, pokazuje, że możliwe jest ponowne klonowanie zwierząt w nieskończoność bez widocznej akumulacji błędów przeprogramowania lub genomicznych. Jednak badania nad technologiami rozwój plemników i komórek jajowych z komórek macierzystych stwarza problemy bioetyczne .

Takie technologie mogą również mieć daleko idące zastosowania kliniczne do przezwyciężania defektów cytoplazmatycznych w ludzkich oocytach. Na przykład technologia może zapobiec przenoszeniu dziedzicznej choroby mitochondrialnej na przyszłe pokolenia. Mitochondrialny materiał genetyczny jest przekazywany z matki na dziecko. Mutacje mogą powodować cukrzycę, głuchotę, zaburzenia oczu, zaburzenia żołądkowo-jelitowe, choroby serca, demencję i inne choroby neurologiczne. Jądro z jednego ludzkiego jaja zostało przeniesione do drugiego, w tym do mitochondriów, tworząc komórkę, którą można uznać za posiadającą dwie matki. Jaja zostały następnie zapłodnione, a powstałe embrionalne komórki macierzyste przeniosły zamienione mitochondrialne DNA. Jako dowód na to, że technika jest bezpieczna, autor tej metody wskazuje na istnienie zdrowych małp, które mają teraz ponad cztery lata – i są produktem przeszczepów mitochondrialnych z różnych środowisk genetycznych.

U myszy późnej generacji z niedoborem telomerazy (Terc-/-) przeprogramowanie za pośrednictwem SCNT łagodzi dysfunkcję telomerów i defekty mitochondriów w większym stopniu niż przeprogramowanie oparte na iPSC.

Opisano inne osiągnięcia w zakresie klonowania i transformacji totipotencjalnej.

Otrzymane bez SCNT

Ostatnio niektórym badaczom udało się uzyskać komórki totipotencjalne bez pomocy SCNT. Komórki totipotencjalne uzyskano przy użyciu czynników epigenetycznych, takich jak germinalna izoforma histonu oocytu. Przeprogramowanie in vivo, przez przejściową indukcję czterech czynników Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc u myszy, nadaje cechy totipotencji. Dootrzewnowe wstrzyknięcie takich komórek iPS in vivo wytwarza struktury podobne do embrionów, które wyrażają markery embrionalne i pozaembrionalne ( trofektodermalne ). Potencjał rozwojowy mysich pluripotencjalnych komórek macierzystych do tworzenia zarówno linii embrionalnych, jak i pozaembrionalnych może być również rozszerzony przez niedobór mikroRNA miR-34a , co prowadzi do silnej indukcji endogennych retrowirusów MuERV-L (MERVL).

Odmłodzenie dla iPSC

Przeszczepienie pluripotencjalnych/embrionalnych komórek macierzystych do ciała dorosłych ssaków zwykle prowadzi do powstania potworniaków , które następnie mogą przekształcić się w złośliwego potworniaka nowotworowego. Jednak wprowadzenie komórek potworniaka do zarodka w stadium blastocysty powodowało ich włączenie do masy komórkowej i często wytwarzało normalne zdrowe zwierzę chimeryczne (tj. złożone z komórek z różnych organizmów)

iPSc po raz pierwszy uzyskano w postaci przeszczepialnego potworniaka indukowanego przez przeszczepy pobrane z zarodków myszy. Teratocarcinoma powstały z komórek somatycznych. Genetycznie mozaikowe myszy uzyskano ze złośliwych komórek potworniaka, potwierdzając pluripotencję komórek. Okazało się, że komórki potworniaka są w stanie utrzymać hodowlę pluripotencjalnych embrionalnych komórek macierzystych w stanie niezróżnicowanym, zasilając pożywkę hodowlaną różnymi czynnikami. W latach 80. stało się jasne, że przeszczepienie pluripotencjalnych/embrionalnych komórek macierzystych do organizmu dorosłych ssaków zwykle prowadzi do powstania potworniaków , które następnie mogą przekształcić się w złośliwego potworniaka nowotworowego. Jednak wprowadzenie komórek potworniaka do zarodka w stadium blastocysty powodowało ich włączenie do wewnętrznej masy komórkowej i często wytwarzało normalne zwierzę chimeryczne (tj. złożone z komórek z różnych organizmów). Wskazywało to, że przyczyną potworniaka jest dysonans - wzajemna nieumiejętność komunikacji między młodymi komórkami dawcy i otaczającymi je komórkami dorosłymi (tzw. " nisza " biorcy ).

W sierpniu 2006 roku japońscy naukowcy ominęli potrzebę oocytu, tak jak w przypadku SCNT. Przeprogramowując mysie fibroblasty embrionalne w pluripotencjalne komórki macierzyste poprzez ektopową ekspresję czterech czynników transkrypcyjnych , mianowicie Oct4 , Sox2 , Klf4 i c-Myc , dowiedli , że nadekspresja niewielkiej liczby czynników może popchnąć komórkę do przejścia do nowej stabilnej . stan, który jest związany ze zmianami w aktywności tysięcy genów.

Ludzkie komórki somatyczne stają się pluripotencjalne poprzez transdukcję czynnikami indukującymi pluripotencję (OCT 3/4, SOX2, Klf4, c-Myc, NANOG i LIN28). Powoduje to wytwarzanie komórek IPS, które mogą różnicować się w dowolną komórkę z trzech listków zarodkowych embrionów (Mesoderm, Endoderm, Ectoderm).

Mechanizmy przeprogramowania są zatem raczej powiązane niż niezależne i koncentrują się na niewielkiej liczbie genów. Właściwości IPSC są bardzo podobne do ESC. Wykazano, że iPSC wspierają rozwój myszy zawierających wyłącznie iPSC przy użyciu zarodka tetraploidalnego (4n), najbardziej rygorystycznego testu potencjału rozwojowego. Jednak niektóre genetycznie normalne iPSC nie produkowały myszy zawierających wyłącznie iPSC z powodu nieprawidłowego wyciszania epigenetycznego wdrukowanego klastra genu Dlk1-Dio3 . Zespół kierowany przez Hansa Schölera (który odkrył gen Oct4 w 1989 roku) wykazał, że nadekspresja Oct4 prowadzi do masowej aktywacji genów poza celem podczas przeprogramowania, pogarszając jakość iPSC. W porównaniu z OSKM (Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc), które wykazują nieprawidłowe wzorce imprintingu i różnicowania, przeprogramowanie SKM (Sox2, Klf4 i c-Myc) generuje iPSC o wysokim potencjale rozwojowym (prawie 20-krotnie wyższym niż OSKM) równoważne embrionalnej komórce macierzystej , jak określono na podstawie ich zdolności do generowania myszy zawierających wyłącznie iPSC poprzez tetraploidalną komplementację zarodków.

Ważną przewagą iPSC nad ESC jest to, że mogą pochodzić z komórek dorosłych, a nie z zarodków. W związku z tym możliwe staje się uzyskanie iPSC od pacjentów dorosłych, a nawet starszych.

Przeprogramowanie komórek somatycznych w iPSC prowadzi do odmłodzenia. Stwierdzono, że przeprogramowanie prowadzi do wydłużenia telomerów, a następnie ich skrócenia po ich zróżnicowaniu z powrotem do pochodnych podobnych do fibroblastów. Tak więc przeprogramowanie prowadzi do przywrócenia embrionalnej długości telomerów, a tym samym zwiększa potencjalną liczbę podziałów komórkowych, w innym przypadku ograniczonych przez limit Hayflicka .

Jednak ze względu na dysonans między odmłodzonymi komórkami a otaczającą niszą starszych komórek biorcy, wstrzyknięcie własnego iPSC zwykle prowadzi do odpowiedzi immunologicznej , która może być wykorzystana do celów medycznych lub powstania guzów, takich jak potworniak. Hipotetycznym powodem jest to, że niektóre komórki odróżnione od ESC i iPSC in vivo nadal syntetyzują embrionalne izoformy białek . Tak więc układ odpornościowy może wykryć i zaatakować komórki, które nie współpracują prawidłowo.

Mała cząsteczka zwana MitoBloCK-6 może zmusić pluripotencjalne komórki macierzyste do śmierci poprzez wywołanie apoptozy (poprzez uwalnianie cytochromu c przez zewnętrzną błonę mitochondrialną ) w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych, ale nie w komórkach zróżnicowanych. Wkrótce po zróżnicowaniu komórki potomne stały się odporne na śmierć. Gdy MitoBloCK-6 został wprowadzony do zróżnicowanych linii komórkowych, komórki pozostały zdrowe. Postawiono hipotezę, że kluczem do ich przetrwania są zmiany zachodzące przez pluripotencjalne mitochondria komórek macierzystych w procesie różnicowania komórek. Ta zdolność MitoBloCK-6 do oddzielania pluripotencjalnych i zróżnicowanych linii komórkowych może potencjalnie zmniejszyć ryzyko potworniaków i innych problemów w medycynie regeneracyjnej.

W 2012 roku zidentyfikowano inne małe cząsteczki (selektywne cytotoksyczne inhibitory ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych – hPSC), które zapobiegały tworzeniu potworniaków ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych u myszy. Najsilniejszy i najbardziej selektywny z nich związek (PluriSIn #1) hamuje desaturazę stearoilo-coA (kluczowy enzym w biosyntezie kwasu oleinowego ), co ostatecznie prowadzi do apoptozy. Za pomocą tej cząsteczki niezróżnicowane komórki mogą być selektywnie usuwane z hodowli. Skuteczną strategią selektywnej eliminacji pluripotencjalnych komórek z potencjałem potworniaka jest celowanie w czynnik(i) antyapoptotyczny specyficzny dla pluripotencjalnych komórek macierzystych (tj. surwiwinę lub Bcl10). Pojedyncze leczenie chemicznymi inhibitorami surwiwiny (np. kwercetyną lub YM155) może indukować selektywną i całkowitą śmierć komórkową niezróżnicowanych hPSC i uważa się, że jest wystarczające do zapobiegania tworzeniu się potworniaka po przeszczepie. Jednak jest mało prawdopodobne, aby jakiekolwiek wstępne odprawy były w stanie zabezpieczyć ponowne zasadzenie iPSC lub ESC. Po selektywnym usunięciu komórek pluripotencjalnych, szybko pojawiają się ponownie, przekształcając zróżnicowane komórki w komórki macierzyste, co prowadzi do nowotworów. Może to być związane z zaburzeniami let-7 regulacji swojej tarczy Nr6a1 (znany również jako komórki rozrodcze czynnika jądrowego - GCNF) embrionalnej represor transkrypcji genów pluripotencja, który reguluje ekspresję genów w fibroblastach dorosłych po mikro-RNA miRNA strat.

Tworzenie potworniaka przez pluripotencjalne komórki macierzyste może być spowodowane niską aktywnością enzymu PTEN , o którym doniesiono, że sprzyja przeżyciu małej populacji (0,1–5% całej populacji) wysoce rakotwórczych, agresywnych, inicjujących potworniaka komórek rakowych podobnych do potworniaków podczas różnicowania . Przeżycie tych komórek inicjujących potworniaka jest związane z nieudaną represją Nanog , jak również ze skłonnością do zwiększonego metabolizmu glukozy i cholesterolu. Te komórki inicjujące potworniaka wyrażały również niższy stosunek p53/p21 w porównaniu z komórkami nienowotworowymi. W związku z powyższymi problemami bezpieczeństwa, zastosowanie iPSCs do terapii komórkowej jest nadal ograniczone. Można je jednak wykorzystać do wielu innych celów, w tym do modelowania choroby, skriningu (selektywnej selekcji) leków i testowania toksyczności różnych leków.

Modulatory małocząsteczkowe losu komórek macierzystych.

Hodowana tkanka z iPSC umieszczony w „chimeryczne” zarodki we wczesnych stadiach rozwoju myszy praktycznie nie wywołują odpowiedzi immunologicznej (po zarodki są hodowane na dorosłych myszy) i nadają się do autologicznego przeszczepiania Jednocześnie, pełne przeprogramowanie dorosłych komórek in vivo w tkankach przez przejściową indukcję czterech czynników Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc u myszy skutkuje potworniakami wyłaniającymi się z wielu narządów. Co więcej, częściowe przeprogramowanie komórek w kierunku pluripotencji in vivo u myszy pokazuje, że niepełne przeprogramowanie pociąga za sobą zmiany epigenetyczne (nieudane represje celów Polycomb i zmienioną metylację DNA ) w komórkach, które kierują rozwojem raka. Jednak wielu badaczom udało się później przeprowadzić cykliczne częściowe przeprogramowanie in vivo poprzez ekspresję czynników Yamanaka przez krótki czas bez późniejszej karcynogenezy, w ten sposób częściowo odmładzając i wydłużając życie u myszy progeroidalnych. Przy metodzie in vitro wykorzystującej nieco dłuższe okresy przeprogramowania (w celu znacznego odmłodzenia) komórki chwilowo tracą swoją tożsamość komórkową, ale „powracając do początkowego losu somatycznego, gdy czynniki przeprogramowujące zostaną wycofane”.

Przykład hodowli komórkowej małej cząsteczki jako narzędzia zamiast białka. w hodowli komórkowej, w celu uzyskania trzustki rodu z mezodermalnych komórek macierzystych kwas retinowy szlaku sygnalizacji muszą być aktywowane gdy Sonic hedgehog ścieżka jest hamowany, które mogą być wykonywane przez dodanie do nośnika przeciw Shh przeciwciała , jeż interakcji białkowych lub cyclopamine - pierwszy dwa to białka, a ostatnia mała cząsteczka.

Wywoływanie chemiczne

Używając wyłącznie małych cząsteczek , Deng Hongkui i współpracownicy wykazali, że endogenne „geny nadrzędne” wystarczą do przeprogramowania losu komórki. Indukowali stan pluripotencjalny w dorosłych komórkach myszy, stosując siedem związków małocząsteczkowych. Skuteczność metody jest dość wysoka: była w stanie przekształcić 0,02% dorosłych komórek tkankowych w iPSC, co jest porównywalne ze współczynnikiem konwersji insercji genów. Autorzy zauważają, że myszy wygenerowane z CiPSC były „w 100% żywotne i najwyraźniej zdrowe przez okres do 6 miesięcy”. Tak więc ta strategia przeprogramowania chemicznego ma potencjalne zastosowanie w generowaniu funkcjonalnych pożądanych typów komórek do zastosowań klinicznych.

W 2015 r. ustanowiono solidny system przeprogramowania chemicznego z wydajnością do 1000 razy większą niż poprzednio zgłoszony protokół. Tak więc przeprogramowanie chemiczne stało się obiecującym podejściem do manipulowania losami komórek.

Różnicowanie od indukowanego potworniaka

Fakt, że ludzkie iPSC są zdolne do tworzenia potworniaków nie tylko u ludzi, ale także w niektórych organizmach zwierząt, w szczególności myszy lub świń, umożliwił naukowcom opracowanie metody różnicowania iPSC in vivo. W tym celu iPSC ze środkiem do indukowania różnicowania do komórek docelowych wstrzykuje się genetycznie zmodyfikowanej świni lub myszy, która tłumi aktywację układu odpornościowego na ludzkich komórkach. Utworzony potworniak jest wycinany i wykorzystywany do izolacji niezbędnych zróżnicowanych komórek ludzkich za pomocą przeciwciała monoklonalnego wobec markerów tkankowo-specyficznych na powierzchni tych komórek. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do produkcji funkcjonalnych ludzkich komórek szpikowych, erytroidalnych i limfoidalnych nadających się do przeszczepu (ale tylko u myszy). Myszy z wszczepionymi ludzkimi komórkami krwiotwórczymi pochodzącymi z potworniaka iPSC wytwarzały ludzkie limfocyty B i T zdolne do funkcjonalnej odpowiedzi immunologicznej. Wyniki te dają nadzieję, że generowanie in vivo komórek dostosowanych do potrzeb pacjenta jest wykonalne, zapewniając materiały, które mogą być przydatne do przeszczepów, wytwarzania ludzkich przeciwciał i badań przesiewowych leków. Stosując MitoBloCK-6 i/lub PluriSIn # 1 zróżnicowane komórki progenitorowe można dalej oczyszczać z komórek pluripotencjalnych tworzących potworniaka. Fakt, że różnicowanie zachodzi nawet w niszy potworniaka daje nadzieję, że powstałe komórki są wystarczająco stabilne, aby bodźce mogły spowodować ich przejście z powrotem do stanu odróżnicowania (pluripotencjalnego), a zatem bezpieczne. Podobny system różnicowania in vivo, dający wszczepialne hematopoetyczne komórki macierzyste z mysich i ludzkich iPSC u zwierząt z potworniakiem w połączeniu z manewrem ułatwiającym hematopoezę, opisali Suzuki i in. Zauważyli, że ani białaczki, ani guzów nie zaobserwowano u biorców po dożylnym wstrzyknięciu krwiotwórczych komórek macierzystych pochodzących z iPSC napromieniowanym biorcom. Co więcej, wstrzyknięcie to skutkowało wieloliniową i długotrwałą rekonstrukcją układu krwiotwórczo-limfopoetycznego w transferach seryjnych. Taki system stanowi użyteczne narzędzie do praktycznego zastosowania iPSCs w leczeniu chorób hematologicznych i immunologicznych.

W celu dalszego rozwoju tej metody zwierzęta (takie jak myszy), u których hoduje się przeszczep komórek ludzkich, muszą mieć zmodyfikowany genom tak, aby wszystkie jego komórki wyrażały i miały na swojej powierzchni ludzki SIRPα . Aby zapobiec odrzuceniu po przeszczepieniu pacjentowi allogenicznego narządu lub tkanki, wyhodowanych z pluripotencjalnych komórek macierzystych in vivo u zwierzęcia, komórki te powinny eksprymować dwie cząsteczki: CTLA4-Ig , która zaburza szlaki kostymulacyjne komórek T oraz PD-L1 , która aktywuje szlak hamowania komórek T.

Zobacz także: patent US 20130058900  .

Zróżnicowane typy komórek

Komórki siatkówki

W niedalekiej przyszłości rozpoczną się badania kliniczne mające na celu wykazanie bezpieczeństwa stosowania iPSC w terapii komórkowej osób ze związanym z wiekiem zwyrodnieniem plamki żółtej, chorobą powodującą ślepotę z powodu uszkodzenia siatkówki. Istnieje kilka artykułów opisujących metody wytwarzania komórek siatkówki z komórek iPSC oraz sposoby ich wykorzystania w terapii komórkowej. Raporty o przeszczepieniu nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPSC wykazały ulepszone wizualne zachowania zwierząt doświadczalnych przez 6 tygodni po przeszczepie. Jednak próby kliniczne zakończyły się sukcesem: dziesięciu pacjentom cierpiącym na barwnikowe zwyrodnienie siatkówki przywrócono wzrok, w tym kobieta, której pozostało tylko 17 procent wzroku.

Komórki nabłonka płuc i dróg oddechowych

Przewlekłe choroby płuc, takie jak idiopatyczne zwłóknienie płuc i mukowiscydoza lub przewlekła obturacyjna choroba płuc i astma , są głównymi przyczynami zachorowalności i umieralności na całym świecie, ze znacznym obciążeniem ludzkim, społecznym i finansowym. Dlatego istnieje pilna potrzeba skutecznej terapii komórkowej i inżynierii tkankowej płuc . Opracowano kilka protokołów do generowania większości typów komórek układu oddechowego , które mogą być przydatne do uzyskiwania komórek terapeutycznych specyficznych dla pacjenta.

Komórki rozrodcze

Niektóre linie iPSC mają potencjał do różnicowania się w męskie komórki rozrodcze i komórki oocytopodobne w odpowiedniej niszy (poprzez hodowlę w podłożu do różnicowania kwasu retinowego i świńskiego płynu pęcherzykowego lub przeszczep kanalików nasiennych). Ponadto przeszczep iPSC przyczynia się do naprawy jąder niepłodnych myszy, wykazując potencjał pozyskiwania gamet z iPSC in vivo i in vitro.

Indukowane progenitorowe komórki macierzyste

Transdyferencjacja bezpośrednia

Ryzyko raka i guzów stwarza potrzebę opracowania metod bezpieczniejszych linii komórkowych nadających się do zastosowania klinicznego. Alternatywnym podejściem jest tzw. „przeprogramowanie bezpośrednie” – transdyferencjacja komórek bez przechodzenia przez stan pluripotencjalny. Podstawą tego podejścia było to, że 5-azacytydyna – odczynnik do demetylacji DNA – może powodować powstawanie klonów miogenicznych , chondrogennych i adipogenicznych w nieśmiertelnej linii komórkowej mysich embrionalnych fibroblastów oraz aktywacja pojedynczego genu, nazwanego później MyoD1. wystarczy do takiego przeprogramowania. W porównaniu z iPSC, których przeprogramowanie wymaga co najmniej dwóch tygodni, tworzenie indukowanych komórek progenitorowych pojawia się czasem w ciągu kilku dni, a skuteczność przeprogramowania jest zwykle wielokrotnie wyższa. To przeprogramowanie nie zawsze wymaga podziału komórek. Komórki powstałe w wyniku takiego przeprogramowania są bardziej odpowiednie do terapii komórkowej, ponieważ nie tworzą potworniaków. Na przykład Chandrakanthan i wsp., & Pimanda opisują wytwarzanie regenerujących tkanki multipotencjalnych komórek macierzystych (komórek iMS) poprzez przejściową obróbkę dojrzałych kości i komórek tłuszczowych czynnikiem wzrostu ( płytkowy czynnik wzrostu –AB (PDGF-AB)) i 5-azacytydyna. Autorzy ci stwierdzają, że „w przeciwieństwie do pierwotnych mezenchymalnych komórek macierzystych, które są wykorzystywane z niewielkimi obiektywnymi dowodami w praktyce klinicznej do promowania naprawy tkanek, komórki iMS przyczyniają się bezpośrednio do regeneracji tkanek in vivo w sposób zależny od kontekstu, bez tworzenia guzów” i dlatego „mają znaczące zakres zastosowania w regeneracji tkanek”.

Transdyferencjacja pojedynczego czynnika transkrypcyjnego

Pierwotnie do zmiany tożsamości można było nakłonić tylko wczesne komórki embrionalne. Dojrzałe komórki są odporne na zmianę swojej tożsamości po zaangażowaniu się w określony rodzaj. Jednak krótka ekspresja pojedynczego czynnika transkrypcyjnego, czynnika ELT-7 GATA, może przekształcić tożsamość w pełni zróżnicowanych, wyspecjalizowanych nieendodermalnych komórek gardła w w pełni zróżnicowane komórki jelitowe u nienaruszonych larw i dorosłych nicieni Caenorhabditis elegans bez konieczności odróżnicowany półprodukt.

Transdyferencjacja z aktywatorem pośredniczonym przez CRISPR

Los komórek można skutecznie manipulować poprzez edycję epigenomu , w szczególności poprzez bezpośrednią aktywację specyficznej endogennej ekspresji genów za pomocą aktywatora za pośrednictwem CRISPR . Kiedy dCas9 (który został zmodyfikowany tak, że nie przecina już DNA, ale nadal może być naprowadzany na określone sekwencje i wiązać się z nimi) jest połączony z aktywatorami transkrypcji, może precyzyjnie manipulować ekspresją endogennych genów. Stosując tę ​​metodę, Wei i wsp. wzmocnili ekspresję endogennych genów Cdx2 i Gata6 przez aktywatory pośredniczone przez CRISPR, w ten sposób bezpośrednio przekształcając mysie embrionalne komórki macierzyste w dwie pozaembrionalne linie, tj. typowe trofoblastowe komórki macierzyste i pozaembrionalne komórki endodermy. Analogiczne podejście zastosowano do indukcji aktywacji endogennych genów Brn2, Ascl1 i Myt11 w celu przekształcenia mysich embrionalnych fibroblastów w indukowane komórki neuronalne. Zatem aktywacja transkrypcji i przebudowa epigenetyczna endogennych głównych czynników transkrypcyjnych są wystarczające do konwersji między typami komórek. Szybka i trwała aktywacja endogennych genów w ich natywnym kontekście chromatyny dzięki temu podejściu może ułatwić przeprogramowanie metodami przejściowymi, które unikają integracji genomowej i zapewniają nową strategię pokonywania barier epigenetycznych w określaniu losu komórki.

Fazowa regeneracja modelowania procesu

Innym sposobem przeprogramowania jest symulacja procesów zachodzących podczas regeneracji kończyn płazów . U płazów urodelowych wczesnym etapem regeneracji kończyn jest odróżnicowanie włókien mięśni szkieletowych w celulat, który proliferuje do tkanki kończyny. Jednakże, sekwencyjne leczenie drobnocząsteczkowy włókien mięśniowych miosewerynę, reversine (The B kinazy Aurora inhibitora) i innych substancji chemicznych (Bio (syntazy glikogenu-3 inhibitor kinazy), kwasu lizofosfatydowego (plejotropowymi aktywatora białka G-sprzężonych receptorów) , SB203580 ( inhibitor kinazy p38 MAP ) lub SQ22536 (inhibitor cyklazy adenylowej)) powoduje tworzenie nowych typów komórek mięśniowych, a także innych typów komórek, takich jak prekursory komórek tłuszczowych, kostnych i nerwowych.

Transdyferencjacja na podstawie przeciwciał

Naukowcy odkryli, że przeciwciało naśladujące GCSF może aktywować stymulujący wzrost receptor na komórkach szpiku w sposób, który indukuje komórki macierzyste szpiku, które normalnie rozwijają się w białe krwinki, stając się neuronalnymi komórkami progenitorowymi. Technika ta umożliwia naukowcom przeszukiwanie dużych bibliotek przeciwciał i szybkie wybieranie tych o pożądanym działaniu biologicznym.

Przeprogramowanie przez bakterie

Przewód pokarmowy człowieka jest skolonizowany przez ogromną społeczność symbiontów i komensali. Naukowcy demonstrują zjawisko przeprogramowania komórek somatycznych przez bakterie i generowania komórek multipotencjalnych z komórek fibroblastów skóry dorosłego człowieka poprzez włączenie bakterii kwasu mlekowego. To transdyferencjacja komórkowa jest powodowana przez rybosomy i „może zachodzić przez bakterie dawcy, które są połykane i trawione przez komórki gospodarza. które mogą wywoływać stres rybosomalny i stymulować plastyczność rozwojową komórek”.

Warunkowo przeprogramowane komórki

Schlegel i Liu wykazali, że połączenie komórek odżywczych i inhibitora kinazy Rho (Y-27632) indukuje normalne i nowotworowe komórki nabłonkowe z wielu tkanek do nieograniczonej proliferacji in vitro. Proces ten zachodzi bez potrzeby transdukcji egzogennych genów wirusowych lub komórkowych. Komórki te nazwano „Warunkowo przeprogramowanymi komórkami (CRC)”. Indukcja CRC jest szybka i wynika z przeprogramowania całej populacji komórek. CRC nie wyrażają wysokich poziomów białek charakterystycznych dla iPSC lub embrionalnych komórek macierzystych (ESC) (np. Sox2, Oct4, Nanog lub Klf4). Ta indukcja CRC jest odwracalna, a usunięcie Y-27632 i substancji odżywczych pozwala komórkom na normalne różnicowanie. Technika CRC generuje 2 x 10 ⁶ komórek w ciągu 5 do 6 dni z biopsji igłowych i może generować z hodowli tkanek kriogenicznie i od mniej niż czterech żywych komórek. CRC zachowują prawidłowy kariotyp i pozostają nienowotworowe. Ta technika również skutecznie zakłada hodowle komórek z guzów ludzkich i gryzoni.

Zdolność do szybkiego generowania wielu komórek nowotworowych z małych próbek biopsyjnych i zamrożonej tkanki zapewnia znaczące możliwości w diagnostyce i terapii opartej na komórkach (w tym w testach chemowrażliwości) i znacznie zwiększa wartość biobanków. Korzystając z technologii CRC, naukowcy byli w stanie zidentyfikować skuteczną terapię dla pacjenta z rzadkim typem nowotworu płuca. Grupa Englemana opisuje platformę farmakogenomiczną, która umożliwia szybkie odkrywanie kombinacji leków, które mogą przezwyciężyć oporność za pomocą systemu CRC. Ponadto metoda CRC pozwala na manipulację genetyczną komórek nabłonkowych ex vivo i ich późniejszą ocenę in vivo w tym samym gospodarzu. Podczas gdy wstępne badania wykazały, że wspólne hodowanie komórek nabłonkowych z komórkami Swiss 3T3 J2 było niezbędne do indukcji CRC, w przypadku płytek hodowlanych przez studzienkę fizyczny kontakt między żywicielami a komórkami nabłonkowymi nie jest wymagany do indukcji CRC, a co ważniejsze, napromienianie komórek odżywczych jest wymagana do tej indukcji. Zgodnie z doświadczeniami z transwell, pożywka kondycjonowana indukuje i utrzymuje CRC, czemu towarzyszy równoczesny wzrost aktywności telomerazy komórkowej. Aktywność kondycjonowanej pożywki jest bezpośrednio skorelowana z apoptozą komórek odżywczych wywołaną promieniowaniem. Tak więc, warunkowe przeprogramowanie komórek nabłonkowych odbywa się za pośrednictwem kombinacji Y-27632 i rozpuszczalnego czynnika(ów) uwalnianego przez apoptotyczne komórki odżywcze.

Riegel i in. wykazują, że mysie komórki ME, wyizolowane z prawidłowych gruczołów sutkowych lub z guzów sutka indukowanych wirusem nowotworu sutka myszy (MMTV)-Neu, mogą być hodowane bez końca jako komórki przeprogramowane warunkowo (CRC). Markery związane z powierzchnią komórek progenitorowych są szybko indukowane w normalnych mysich ME-CRC w stosunku do komórek ME. Jednak ekspresja pewnych subpopulacji komórek progenitorowych sutka, takich jak CD49f+ ESA+ CD44+, znacznie spada w późniejszych pasażach. Niemniej jednak mysie ME-CRC hodowane w trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej dały początek strukturom groniastym gruczołu mlekowego. ME-CRC izolowane z transgenicznych mysich guzów sutka MMTV-Neu wyrażają wysokie poziomy HER2/neu, jak również markery komórek inicjujących nowotwór, takie jak CD44+, CD49f+ i ESA+ (EpCam). Te wzorce ekspresji są podtrzymywane w późniejszych fragmentach CRC. ME-CRC z wczesnego i późnego pasażu z guzów MMTV-Neu, które wszczepiono do poduszek tłuszczowych sutka myszy syngenicznych lub nagich, rozwinęły guzy naczyniowe, które dały przerzuty w ciągu 6 tygodni od przeszczepu. Co ważne, histopatologia tych guzów była nie do odróżnienia od guzów rodzicielskich, które rozwijają się u myszy MMTV-Neu. Zastosowanie systemu CRC do mysich komórek nabłonka sutka zapewnia atrakcyjny system modelowy do badania genetyki i fenotypu normalnego i przekształconego nabłonka myszy w określonym środowisku hodowlanym oraz w badaniach przeszczepów in vivo.

Inne podejście do CRC w celu zahamowania CD47 - do białka błonowego , który jest trombospondynę-1 receptora. Utrata CD47 umożliwia przedłużoną proliferację pierwotnych mysich komórek śródbłonka, zwiększa asymetryczny podział i umożliwia tym komórkom spontaniczne przeprogramowanie w celu utworzenia multipotencjalnych skupisk podobnych do ciał embrionalnych . Nokaut CD47 ostro zwiększa poziom mRNA c-Myc i innych czynników transkrypcyjnych komórek macierzystych w komórkach in vitro i in vivo. Trombospondyna-1 jest kluczowym sygnałem środowiskowym, który hamuje samoodnowę komórek macierzystych za pośrednictwem CD47. Tak więc antagoniści CD47 umożliwiają samoodnowę i przeprogramowanie komórek poprzez przezwyciężenie negatywnej regulacji c-Myc i innych czynników transkrypcyjnych komórek macierzystych. Blokada CD47 in vivo przy użyciu antysensownego morfolino zwiększa przeżywalność myszy narażonych na śmiertelne napromienianie całego ciała z powodu zwiększonej zdolności proliferacyjnej komórek pochodzących ze szpiku kostnego i ochrony przed promieniowaniem radiowrażliwych tkanek przewodu pokarmowego.

Wzmacniacze specyficzne dla linii

Zróżnicowane makrofagi mogą samoodnawiać się w tkankach i długotrwale rozwijać się w hodowli. W pewnych warunkach makrofagi mogą dzielić się bez utraty cech, które nabyły podczas specjalizacji w komórkach odpornościowych – co zwykle nie jest możliwe w przypadku komórek zróżnicowanych . Makrofagi osiągają to poprzez aktywację sieci genów podobnej do tej znajdującej się w embrionalnych komórkach macierzystych. Analiza pojedynczych komórek wykazała, że in vivo proliferujące makrofagi mogą osłabiać repertuar wzmacniaczy specyficzny dla makrofagów powiązany z siecią genów kontrolującą samoodnowę. Stało się tak, gdy stężenia dwóch czynników transkrypcyjnych o nazwie MafB i c-Maf były naturalnie niskie lub zostały zahamowane przez krótki czas. Manipulacje genetyczne, które wyłączały MafB i c-Maf w makrofagach, spowodowały, że komórki rozpoczęły program samoodnowy. Podobna sieć kontroluje również samoodnowę embrionalnych komórek macierzystych, ale jest powiązana z różnymi wzmacniaczami specyficznymi dla embrionalnych komórek macierzystych.

Stąd makrofagi izolowane od myszy z niedoborem MafB- i c-Maf-double dzielą się w nieskończoność; samoodnowa zależy od c-Myc i Klf4 .

Pośrednia konwersja rodowodu

Pośrednia konwersja linii jest metodologią przeprogramowania, w której komórki somatyczne przechodzą przez plastyczny stan pośredni częściowo przeprogramowanych komórek (pre-iPSC), indukowany przez krótkotrwałą ekspozycję na czynniki przeprogramowania, a następnie różnicowanie w specjalnie opracowanym środowisku chemicznym (sztuczna nisza).

Ta metoda może być zarówno bardziej wydajna, jak i bezpieczniejsza, ponieważ wydaje się, że nie powoduje powstawania guzów ani innych niepożądanych zmian genetycznych i daje znacznie większą wydajność niż inne metody. Jednak bezpieczeństwo tych komórek pozostaje wątpliwe. Ponieważ konwersja linii z pre-iPSC opiera się na wykorzystaniu warunków przeprogramowania iPSC, frakcja komórek może uzyskać właściwości pluripotencjalne, jeśli nie zatrzymają procesu odróżnicowania in vitro lub z powodu dalszego odróżnicowania in vivo.

Glikoproteina błony zewnętrznej

Wspólną cechą pluripotencjalnych komórek macierzystych jest specyficzny charakter glikozylacji białek ich błony zewnętrznej. To odróżnia je od większości komórek niepluripotencjalnych, chociaż nie od białych krwinek . W glikany na powierzchni komórek macierzystych reagują szybko do zmian w stanie komórek i sygnalizacji, a zatem są idealne do identyfikacji nawet niewielkich zmian w populacjach komórek. Wiele markerów komórek macierzystych jest opartych na epitopach glikanów na powierzchni komórki, w tym szeroko stosowane markery SSEA-3 , SSEA-4, Tra 1-60 i Tra 1-81. Suila Heli i in. spekulują, że w ludzkich komórkach macierzystych zewnątrzkomórkowe O-GlcNAc i zewnątrzkomórkowe O-LacNAc odgrywają kluczową rolę w dostrajaniu ścieżki sygnalizacyjnej Notch - wysoce konserwatywnego systemu sygnalizacji komórkowej, który reguluje specyfikację losu komórek, różnicowanie, asymetrię lewo-prawo, apoptozę, somitogeneza i angiogeneza oraz odgrywa kluczową rolę w proliferacji komórek macierzystych (przegląd dokonali Perdigoto i Bardin oraz Jafar-Nejad i wsp.)

Zmiany w glikozylacji białek błony zewnętrznej są markerami stanów komórek związanych w pewien sposób z pluripotencją i różnicowaniem. Zmiana glikozylacji jest najwyraźniej nie tylko wynikiem inicjalizacji ekspresji genów, ale także pełni rolę ważnego regulatora genu zaangażowanego w nabywanie i utrzymywanie stanu niezróżnicowanego.

Na przykład aktywacja glikoproteiny ACA, łącząca glikozylofosfatydyloinozytol na powierzchni komórek progenitorowych w ludzkiej krwi obwodowej indukuje zwiększoną ekspresję genów Wnt , Notch-1 , BMI1 i HOXB4 poprzez kaskadę sygnalizacyjną PI3K / Akt / mTor / PTEN i sprzyja powstawaniu samoodnawialnej populacji krwiotwórczych komórek macierzystych.

Ponadto odróżnicowanie komórek progenitorowych indukowane przez zależny od ACA szlak sygnałowy prowadzi do indukowanych przez ACA pluripotencjalnych komórek macierzystych, zdolnych do różnicowania się in vitro do komórek wszystkich trzech listków zarodkowych . Badanie zdolności lektyn do utrzymywania hodowli pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych doprowadziło do odkrycia lektyny Erythrina crista-galli (ECA), która może służyć jako prosta i wysoce skuteczna macierz do hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Przeprogramowanie za pomocą proteoglikanu

Alternatywną strategią przekształcania komórek somatycznych w stany pluripotencjalne może być ciągła stymulacja fibroblastów przez pojedynczy proteoglikan ECM , fibromodulinę . Takie komórki wykazują zdolność do regeneracji mięśni szkieletowych przy znacznie niższym ryzyku powstawania nowotworów w porównaniu z iPSC. Zmniejszona rakotwórczość takich komórek jest związana z regulacją w górę CDKN2B podczas procesu przeprogramowania rekombinowanej ludzkiej fibromoduliny

Przeprogramowanie poprzez podejście fizyczne

Białko adhezji komórkowej E-kadheryna jest niezbędne dla silnego pluripotencjalnego fenotypu . Podczas przeprogramowania pod kątem generowania komórek iPS, N-kadheryna może zastąpić funkcję E-kadheryny. Te funkcje kadheryn nie są bezpośrednio związane z adhezją, ponieważ morfologia kuli pomaga w utrzymaniu „łodygości” komórek macierzystych. Co więcej, tworzenie kuli, spowodowane wymuszonym wzrostem komórek na powierzchni o niskiej przyczepności, czasami powoduje przeprogramowanie. Na przykład, nerwowe komórki progenitorowe można generować z fibroblastów bezpośrednio poprzez podejście fizyczne, bez wprowadzania egzogennych czynników przeprogramowania.

Wskazówki fizyczne, w postaci równoległych mikrorowków na powierzchni podłoży adhezyjnych do komórek, mogą zastąpić działanie drobnocząsteczkowych modyfikatorów epigenetycznych i znacznie poprawić wydajność przeprogramowania. Mechanizm polega na mechanomodulacji stanu epigenetycznego komórek. W szczególności „zmniejszona aktywność deacetylazy histonowej i zwiększenie ekspresji domeny 5 powtórzeń WD (WDR5) – podjednostki metylotranferazy H3 – przez mikrorowkowane powierzchnie prowadzą do zwiększonej acetylacji i metylacji histonów H3”. Rusztowania nanowłókniste z wyrównaną orientacją włókien dają efekty podobne do tych wytwarzanych przez mikrorowki, co sugeruje, że zmiany w morfologii komórek mogą być odpowiedzialne za modulację stanu epigenetycznego.

Rola adhezji komórkowych w rozwoju neuronów . Zdjęcie dzięki uprzejmości użytkownika Wikipedii JWSchmidt na licencji GNU Free Documentation License

Sztywność podłoża jest ważnym wskaźnikiem biofizycznym wpływającym na indukcję neuronalną i specyfikację podtypów. Na przykład miękkie substraty promują konwersję neuroepitelialną, jednocześnie hamując różnicowanie grzebienia nerwowego hESC w sposób zależny od BMP4 . Mechanistyczne badania wykazały wielokierunkowy proces mechanotransductive obejmującej mechanoczułych Smad fosforylacji i nucleocytoplasmic tasowanie, regulowanych przez sztywność zależne Hippo® / YAP działania i actomyosin cytoszkieletu integralności i kurczliwości .

Mysie embrionalne komórki macierzyste (mESC) ulegają samoodnowie w obecności czynnika hamującego białaczkę cytokinową (LIF). Po wycofaniu LIF mESC ulegają różnicowaniu, czemu towarzyszy wzrost adhezji komórka-podłoże i rozprzestrzenianie się komórek. Ograniczone rozprzestrzenianie się komórek przy braku LIF przez hodowanie mESC na chemicznie zdefiniowanych, słabo adhezyjnych biosubstratach lub przez manipulację cytoszkieletem pozwoliło komórkom pozostać w stanie niezróżnicowanym i pluripotencjalnym. Wpływ ograniczonego rozprzestrzeniania się komórek na samoodnowę mESC nie jest pośredniczony przez zwiększoną adhezję międzykomórkową, ponieważ hamowanie adhezji mESC przy użyciu funkcji blokującej przeciwciało przeciwko E-kadherynie lub siRNA nie sprzyja różnicowaniu. Opisano możliwe mechanizmy predeterminacji losu komórek macierzystych poprzez fizyczne interakcje z macierzą zewnątrzkomórkową.

Opracowano nową metodę, która zamienia komórki w komórki macierzyste szybciej i wydajniej poprzez "ściskanie" ich za pomocą trójwymiarowej sztywności mikrośrodowiska i gęstości otaczającego żelu. Technikę można zastosować do dużej liczby komórek w celu wytworzenia komórek macierzystych do celów medycznych na skalę przemysłową.

Komórki zaangażowane w proces przeprogramowania zmieniają się morfologicznie w miarę postępu procesu. Powoduje to fizyczne różnice w siłach adhezji między komórkami. Znaczące różnice w „sygnaturze adhezyjnej” pomiędzy pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi, częściowo przeprogramowanymi komórkami, zróżnicowanymi komórkami potomnymi i somatycznymi pozwoliły na opracowanie procesu separacji w celu izolacji pluripotencjalnych komórek macierzystych w urządzeniach mikroprzepływowych , czyli:

1. szybko (rozdzielanie zajmuje mniej niż 10 minut);
2. wydajny (w wyniku separacji uzyskuje się ponad 95 procent czystej kultury komórek iPS);
3. nieszkodliwe (wskaźnik przeżycia komórek wynosi ponad 80 procent, a powstałe komórki zachowują normalne profile transkrypcyjne, potencjał różnicowania i kariotyp).

Komórki macierzyste posiadają pamięć mechaniczną (zapamiętują przeszłe sygnały fizyczne) – z czynnikami szlaku sygnałowego Hippo : białko związane z Yes (YAP) i koaktywator transkrypcyjny z domeną wiążącą PDZ (TAZ) działającą jako wewnątrzkomórkowy reostat mechaniczny – przechowujący informacje z przeszłości środowiska fizycznego i wpływa na losy komórek.

Nerwowe komórki macierzyste

Udar i wiele chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona, choroba Alzheimera i stwardnienie zanikowe boczne, wymagają terapii zastępowania komórek. Pomyślne wykorzystanie przekształconych komórek nerwowych (cN) w transplantacjach otwiera nowe możliwości leczenia takich chorób. Niemniej jednak, indukowane neurony (iN) bezpośrednio przekształcone z fibroblastów są ostatecznie zaangażowane i wykazują bardzo ograniczoną zdolność proliferacyjną, która może nie zapewnić wystarczającej ilości autologicznych komórek dawcy do przeszczepu. Samoodnawiające się nerwowe komórki macierzyste (iNSC) zapewniają dodatkowe korzyści w porównaniu z iN zarówno w badaniach podstawowych, jak i zastosowaniach klinicznych.

Na przykład, w określonych warunkach wzrostu, mysie fibroblasty można przeprogramować za pomocą jednego czynnika, Sox2, w celu utworzenia iNSC, które samoodnawiają się w hodowli i po przeszczepie oraz mogą przetrwać i integrować się bez tworzenia guzów w mózgach myszy. INSC można uzyskać z fibroblastów dorosłego człowieka za pomocą technik niewirusowych, oferując w ten sposób bezpieczną metodę autologicznego przeszczepu lub opracowania komórkowych modeli chorób.

Neuronowe indukowane chemicznie komórki progenitorowe (ciNPC) mogą być generowane z mysich fibroblastów koniuszka ogona i ludzkich komórek somatycznych moczu bez wprowadzania czynników egzogennych, ale za pomocą chemicznego koktajlu, mianowicie VCR (V, VPA , inhibitor HDAC ; C, CHIR99021, inhibitor kinazy GSK-3, a R i RepSox , inhibitor TGF szlaków sygnalizacyjnych beta ), zgodnie z fizjologicznym stan niedotlenienia . Alternatywne koktajle z inhibitorami deacetylacji histonów, kinazy syntazy glikogenu i szlaków TGF-β (gdzie: maślan sodu (NaB) lub trichostatyna A (TSA) mogą zastąpić VPA, chlorek litu (LiCl) lub węglan litu (Li2CO3) mogą zastąpić CHIR99021, lub Repsox można zastąpić SB-431542 lub Tranilast ) wykazują podobną skuteczność w indukcji ciNPC. Zhang i wsp. donoszą również o wysoce wydajnym przeprogramowaniu mysich fibroblastów w indukowane nerwowe komórki macierzyste podobne do komórek (ciNSLC) przy użyciu koktajlu dziewięciu składników.

Opisano wiele metod bezpośredniej transformacji komórek somatycznych w indukowane nerwowe komórki macierzyste.

Eksperymenty potwierdzające zasadę działania pokazują, że możliwe jest przekształcenie przeszczepionych ludzkich fibroblastów i ludzkich astrocytów bezpośrednio w mózgu, które są tak skonstruowane, aby eksprymowały indukowalne formy genów przeprogramowania neuronów, w neurony, gdy przeprogramowujące geny ( Ascl1 , Brn2a i Myt1l ) są aktywowane po przeszczepie za pomocą narkotyków.

Astrocyty – najpowszechniejsze komórki nerwowo-glejowe , które przyczyniają się do tworzenia blizn w odpowiedzi na uraz – mogą być bezpośrednio przeprogramowane in vivo, aby stały się funkcjonalnymi neuronami, które tworzą sieci u myszy bez potrzeby przeszczepiania komórek. Naukowcy obserwowali myszy przez prawie rok, szukając oznak powstawania guza i stwierdzili, że ich nie znaleźli. Ci sami badacze zamienili tworzące blizny astrocyty w komórki progenitorowe, zwane neuroblastami, które zregenerowały się w neurony w uszkodzonym rdzeniu kręgowym dorosłego człowieka.

Komórki prekursorowe oligodendrocytów

Bez mieliny izolującej neurony, sygnały nerwowe szybko tracą moc. Choroby atakujące mielinę, takie jak stwardnienie rozsiane, powodują sygnały nerwowe, które nie mogą się rozprzestrzeniać do zakończeń nerwowych, aw konsekwencji prowadzą do problemów poznawczych, motorycznych i czuciowych. Transplantacja komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC), które mogą z powodzeniem tworzyć osłonki mielinowe wokół komórek nerwowych, jest obiecującą potencjalną odpowiedzią terapeutyczną. Bezpośrednia konwersja linii fibroblastów myszy i szczura w komórki oligodendrogleju stanowi potencjalne źródło OPC. Konwersja przez wymuszoną ekspresję zarówno ośmiu, jak i trzech czynników transkrypcyjnych Sox10, Olig2 i Zfp536, może dostarczyć takich komórek.

Kardiomiocyty

Terapie in vivo oparte na komórkach mogą zapewnić transformacyjne podejście do zwiększania wzrostu naczyń i mięśni oraz zapobiegania powstawaniu niekurczliwych blizn poprzez dostarczanie do serca czynników transkrypcyjnych lub mikroRNA. Fibroblasty sercowe, które stanowią 50% komórek w sercu ssaków, mogą być przeprogramowane w komórki podobne do kardiomiocytów in vivo przez lokalne dostarczanie czynników transkrypcyjnych rdzenia serca (GATA4, MEF2C, TBX5 oraz dla lepszego przeprogramowania plus ESRRG, MESP1, miokardina i ZFPM2) po podwiązaniu naczyń wieńcowych . Wyniki te implikują terapie, które mogą bezpośrednio remuskularyzować serce bez przeszczepiania komórek. Jednak skuteczność takiego przeprogramowania okazała się bardzo niska, a fenotyp otrzymanych komórek kardiomiocytopodobnych nie przypomina dojrzałych normalnych kardiomiocytów. Ponadto przeszczepienie sercowych czynników transkrypcyjnych do uszkodzonych mysich serc spowodowało słabą przeżywalność komórek i minimalną ekspresję genów sercowych.

W międzyczasie nastąpił postęp w metodach pozyskiwania miocytów sercowych in vitro. Skuteczne różnicowanie ludzkich komórek iPS w sercu dało początek progenitorom zatrzymanym w sercach szczurów po zawale i zmniejszeniu przebudowy serca po uszkodzeniu niedokrwiennym.

Zespół naukowców kierowany przez Shenga Dinga wykorzystał koktajl dziewięciu substancji chemicznych (9C) do transdyferencjacji ludzkich komórek skóry w komórki serca. Dzięki tej metodzie ponad 97% komórek zaczęło bić, co jest charakterystyczne dla w pełni rozwiniętych, zdrowych komórek serca. Chemicznie indukowane komórki podobne do kardiomiocytów (ciCM) jednolicie kurczyły się i przypominały ludzkie kardiomiocyty pod względem właściwości transkryptomicznych, epigenetycznych i elektrofizjologicznych. Po przeszczepieniu do mysich serc z zawałem, fibroblasty poddane działaniu 9C zostały skutecznie przekształcone w ciCM i rozwinęły się w zdrowo wyglądające komórki mięśnia sercowego w obrębie narządu. To podejście polegające na przeprogramowaniu chemicznym, po dalszej optymalizacji, może w prosty sposób dostarczyć wskazówek, które pobudzają mięsień sercowy do lokalnej regeneracji.

W innym badaniu celem przeszczepu komórek iPS była kardiomiopatia niedokrwienna w mysim modelu zawału. Zsynchronizował niesprawne komory, oferując strategię regeneracyjną w celu osiągnięcia resynchronizacji i ochrony przed dekompensacją dzięki poprawie przewodnictwa i kurczliwości lewej komory, zmniejszeniu bliznowacenia i odwróceniu przebudowy strukturalnej. Jeden protokół wygenerował populacje do 98% kardiomiocytów z hPSC po prostu przez modulowanie kanonicznego szlaku sygnałowego Wnt w określonych punktach czasowych podczas różnicowania, przy użyciu łatwo dostępnych związków drobnocząsteczkowych.

Odkrycie mechanizmów kontrolujących powstawanie kardiomiocytów doprowadziło do opracowania leku ITD-1, który skutecznie oczyszcza powierzchnię komórki z receptora TGF-β typu II i selektywnie hamuje wewnątrzkomórkową sygnalizację TGF-β. W ten sposób selektywnie zwiększa różnicowanie niezwiązanej mezodermy do kardiomiocytów, ale nie do komórek mięśni gładkich naczyń i śródbłonka.

W jednym z projektów zaszczepiono odkomórkowione mysie serca multipotencjalnymi komórkami progenitorowymi układu sercowo-naczyniowego wywodzącymi się z ludzkiego iPSC. Wprowadzone komórki migrowały, proliferowały i różnicowały się in situ do kardiomiocytów, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka w celu odbudowy serca. Ponadto macierz pozakomórkowa serca (podłoże rusztowania serca) sygnalizowała komórkom ludzkim, aby stały się wyspecjalizowanymi komórkami potrzebnymi do prawidłowego funkcjonowania serca. Po 20 dniach perfuzji czynnikami wzrostu, zmodyfikowane tkanki serca ponownie zaczęły bić i reagowały na leki.

Przeprogramowanie fibroblastów sercowych w indukowane komórki przypominające kardiomiocyty (iCM) in situ stanowi obiecującą strategię regeneracji serca. Myszy eksponowane in vivo na trzy sercowe czynniki transkrypcyjne GMT (Gata4, Mef2c, Tbx5) i małe cząsteczki: SB-431542 ( inhibitor transformującego czynnika wzrostu (TGF)-β) i XAV939 (inhibitor WNT) przez 2 tygodnie po zawale mięśnia sercowego wykazali znaczną poprawę przeprogramowania (efektywność przeprogramowania wzrosła ośmiokrotnie) i funkcji serca w porównaniu do osób narażonych tylko na GMT.

Zobacz też: recenzja

Odmładzanie komórek macierzystych mięśni

Osoby starsze często cierpią na postępujące osłabienie mięśni i niewydolność regeneracyjną, częściowo z powodu podwyższonej aktywności szlaku kinaz aktywowanych mitogenami p38α i p38β w starzejących się komórkach macierzystych mięśni szkieletowych. Poddanie takich komórek macierzystych przejściowej inhibicji p38α i p38β w połączeniu z hodowlą na miękkich podłożach hydrożelowych powoduje ich szybką ekspansję i odmłodzenie, co skutkuje powrotem ich siły.

U myszy geriatrycznych, spoczynkowe komórki satelitarne tracą odwracalny stan spoczynku poprzez przejście do nieodwracalnego stanu przedsenescencji , spowodowanego derepresją p16 INK4a (zwanej również Cdkn2a). W przypadku kontuzji komórki te nie aktywują się i nie rozszerzają, nawet w młodym środowisku. Wyciszanie p16INK4a w geriatrycznych komórkach satelitarnych przywraca spoczynek i funkcje regeneracyjne mięśni.

Miogenne komórki progenitorowe do potencjalnego zastosowania w modelowaniu choroby lub terapiach komórkowych ukierunkowanych na mięśnie szkieletowe mogą być również generowane bezpośrednio z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu swobodnie pływającej kultury sferycznej (kulki EZ) w pożywce hodowlanej uzupełnionej wysokimi stężeniami (100 ng/ml) czynnika wzrostu fibroblastów-2 ( FGF- 2 ) i naskórkowego czynnika wzrostu .

Hepatocyty

W przeciwieństwie do obecnych protokołów pozyskiwania hepatocytów z ludzkich fibroblastów, Saiyong Zhu i wsp. (2014) nie wygenerowali iPSC, ale przy użyciu małych cząsteczek skrócili przeprogramowanie do pluripotencji, aby wygenerować stan indukowanej multipotencjalnej komórki progenitorowej (iMPC), z której komórki progenitorowe endodermy a następnie hepatocyty (iMPC-Heps) były skutecznie różnicowane. Po przeszczepie do mysiego modelu ludzkiej niewydolności wątroby z niedoborem odporności, iMPC-Heps rozprzestrzenił się w dużym stopniu i nabyte poziomy funkcji hepatocytów były podobne do tych z ludzkich pierwotnych hepatocytów dorosłych. iMPC-Heps nie utworzyły guzów, najprawdopodobniej dlatego, że nigdy nie weszły w stan pluripotencjalny.

Krypta jelitowa - dostępne i obfite źródło komórek nabłonka jelitowego do konwersji w komórki β-podobne.

Wyniki te potwierdzają możliwość znacznego ponownego zaludnienia wątroby myszy z ludzkimi hepatocytami wytworzonymi in vitro, co usuwa długotrwałą przeszkodę na drodze do autologicznej terapii komórkami wątroby.

Koktajl małych cząsteczek, Y-27632 , A-83-01 (inhibitor kinazy TGFβ/receptora podobnego do kinazy aktywiny ( ALK5 )) i CHIR99021 (silny inhibitor GSK-3 ), może przekształcać dojrzałe hepatocyty szczura i myszy in vitro do proliferacyjnych komórek bipotencjalnych – CLiP (chemicznie indukowane komórki progenitorowe wątroby). CLiP mogą różnicować się zarówno w dojrzałe hepatocyty, jak i komórki nabłonka dróg żółciowych, które mogą tworzyć funkcjonalne struktury przewodowe. W hodowli długoterminowej CLiP nie utraciły zdolności proliferacyjnej i zdolności różnicowania wątroby i mogą zasiedlać przewlekle uszkodzoną tkankę wątroby.

Komórki produkujące insulinę

Powikłania cukrzycy, takie jak choroby sercowo-naczyniowe , retinopatia , neuropatia , nefropatia i choroby krążenia obwodowego, zależą od rozregulowania cukru z powodu braku insuliny z komórek beta trzustki i mogą być śmiertelne, jeśli nie są leczone. Jednym z obiecujących podejść do zrozumienia i wyleczenia cukrzycy jest wykorzystanie pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC), w tym embrionalnych komórek macierzystych (ESC) i indukowanych PCS (iPSC). Niestety, ludzkie komórki z ekspresją insuliny pochodzące z PSC przypominają bardziej ludzkie płodowe komórki β niż dorosłe komórki β. W przeciwieństwie do dorosłych komórek β, płodowe komórki β wydają się funkcjonalnie niedojrzałe, na co wskazuje zwiększone podstawowe wydzielanie glukozy i brak stymulacji glukozy, co potwierdza sekwencja RNA ich transkryptów .

Alternatywną strategią jest konwersja fibroblastów w kierunku odrębnych populacji komórek progenitorowych endodermy i, przy użyciu koktajli czynników sygnałowych, skuteczne różnicowanie tych komórek progenitorowych endodermy w funkcjonalne komórki beta-podobne zarówno in vitro, jak i in vivo.

Nadekspresja trzech czynników transkrypcyjnych , PDX1 (wymagany do wzrostu pączków trzustki i dojrzewania komórek beta), NGN3 (wymagany do tworzenia endokrynnych komórek prekursorowych) i MAFA (do dojrzewania komórek beta) (nazywany PNM) może prowadzić do transformacji niektóre typy komórek w stan podobny do komórki beta. Dostępnym i obfitym źródłem funkcjonalnych komórek produkujących insulinę jest jelito . Ekspresja PMN w ludzkich „ organoidach ” jelitowych stymuluje konwersję komórek nabłonka jelitowego w komórki β-podobne, możliwe do przyjęcia do przeszczepu .

Przodkowie Nefronu

Dorosłe komórki kanalików proksymalnych zostały bezpośrednio przeprogramowane transkrypcyjnie do prekursorów nefronu embrionalnej nerki , przy użyciu puli sześciu genów instruktażowych czynników transkrypcyjnych (SIX1, SIX2, OSR1, Eyes absent homolog 1 (EYA1), Homeobox A11 (HOXA11) i Snail homolog 2 (SNAI2)), które aktywowały geny zgodne z fenotypem mezenchymu kapelusza /potomka nefronu w dorosłej linii komórkowej kanalika proksymalnego. Wytwarzanie takich komórek może prowadzić do komórkowych terapii chorób nerek dorosłych . Zarodkowe organoidy nerkowe umieszczone w nerkach dorosłego szczura mogą podlegać dalszemu rozwojowi i rozwojowi naczyniowemu.

Komórki naczyń krwionośnych

Wraz ze starzeniem się naczyń krwionośnych często stają się nienormalne pod względem struktury i funkcji, przyczyniając się w ten sposób do wielu chorób związanych z wiekiem, w tym zawału mięśnia sercowego, udaru niedokrwiennego i miażdżycy tętnic zaopatrujących serce, mózg i kończyny dolne. Tak więc ważnym celem jest stymulowanie wzrostu naczyń dla krążenia obocznego, aby zapobiec zaostrzeniu tych chorób. Indukowane naczyniowe komórki progenitorowe (iVPC) są przydatne w terapii komórkowej mającej na celu stymulowanie wzrostu obocznego naczyń wieńcowych. Zostały wygenerowane przez częściowe przeprogramowanie komórek śródbłonka. Zaangażowanie naczyniowe iVPCs jest związane z pamięcią epigenetyczną komórek śródbłonka, co powoduje, że stają się one komponentami komórkowymi rosnących naczyń krwionośnych. Dlatego po wszczepieniu iVPC do mięśnia sercowego wszczepiły się one w naczynia krwionośne i zwiększyły przepływ wieńcowy lepiej niż iPSC, mezenchymalne komórki macierzyste lub natywne komórki śródbłonka.

Modyfikacja genetyczna ex vivo może być skuteczną strategią poprawy funkcji komórek macierzystych. Na przykład, terapia komórkowa wykorzystująca modyfikację genetyczną z użyciem kinazy Pim-1 (efektor downstream Akt , który pozytywnie reguluje proces neonaczynienia) komórek pochodzących ze szpiku kostnego lub ludzkich komórek progenitorowych serca, wyizolowanych z niewydolnego mięśnia sercowego, skutkuje trwałością naprawy wraz z poprawa parametrów czynnościowych wydolności hemodynamicznej mięśnia sercowego.

Komórki macierzyste wyekstrahowane z tkanki tłuszczowej po liposukcji mogą zostać nakłonione do przekształcenia się w progenitorowe komórki mięśni gładkich (iPVSMC) znajdujące się w tętnicach i żyłach.

System hodowli 2D ludzkich komórek iPS w połączeniu z selekcją potrójnego markera ( CD34 (powierzchniowa glikofosfoproteina eksprymowana na fibroblastach rozwojowo wczesnych embrionów), NP1 (receptor – neuropilina 1) i KDR (receptor zawierający domenę wstawki kinazy)) do izolacji waskulogenne komórki prekursorowe z ludzkiego iPSC wytworzyły komórki śródbłonka, które po przeszczepieniu utworzyły stabilne, funkcjonalne mysie naczynia krwionośne in vivo, utrzymujące się przez 280 dni.

W leczeniu zawału ważne jest zapobieganie powstawaniu zwłóknieniowej tkanki bliznowatej. Można to osiągnąć in vivo przez przejściowe zastosowanie czynników parakrynnych , które przekierowują wkład natywnych progenitorowych komórek macierzystych serca z tkanki bliznowatej do tkanki sercowo-naczyniowej. Na przykład, w mysim modelu zawału mięśnia sercowego, pojedyncze wstrzyknięcie do mięśnia sercowego mRNA ludzkiego czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF-A modRNA), zmodyfikowanego tak, aby wymykało się normalnemu systemowi obronnemu organizmu, skutkuje długotrwałą poprawą czynności serca w wyniku mobilizacji i przekierowanie nasierdziowych komórek progenitorowych w kierunku typów komórek sercowo-naczyniowych.

Komórki macierzyste krwi

Czerwone krwinki

U wielu pacjentów konieczna jest transfuzja krwinek czerwonych . Jednak do tej pory podaż czerwonych krwinek pozostaje niestabilna. Ponadto transfuzja stwarza ryzyko przeniesienia chorób zakaźnych. Duża podaż bezpiecznych krwinek czerwonych wytworzonych in vitro pomogłaby rozwiązać ten problem. Wytwarzanie ex vivo komórek erytroidalnych może dostarczyć alternatywnych produktów transfuzji, aby spełnić obecne i przyszłe wymagania kliniczne. Czerwone krwinki (RBC) wytworzone in vitro z mobilizowanych komórek CD34- dodatnich mają normalne przeżycie po przetoczeniu autologicznemu biorcy. RBC wyprodukowane in vitro zawierały wyłącznie hemoglobinę płodową (HbF), która ratuje funkcjonalność tych RBC. In vivo zmianę hemoglobiny płodowej na dorosłego obserwowano po infuzji jądrzastych prekursorów erytroidalnych pochodzących z iPSC. Chociaż RBC nie mają jąder i dlatego nie mogą tworzyć guza, ich bezpośrednie prekursory erytroblastów mają jądra. Końcowe dojrzewanie erytroblastów do funkcjonalnych krwinek czerwonych wymaga złożonego procesu przebudowy, który kończy się wysunięciem jądra i utworzeniem wyłuszczonej krwinki czerwonej. Przeprogramowanie komórek często zakłóca wyłuszczenie. Transfuzja krwinek czerwonych lub erytroblastów wytworzonych in vitro nie chroni w wystarczającym stopniu przed powstawaniem guza.

Szlak receptora węglowodorów arylowych (AhR) (który, jak wykazano, bierze udział w promowaniu rozwoju komórek rakowych) odgrywa ważną rolę w prawidłowym rozwoju komórek krwi. Aktywacja AhR w ludzkich hematopoetycznych komórkach progenitorowych (HP) napędza bezprecedensową ekspansję komórek HP, megakariocytów i komórek erytroidalnych. Zobacz także Zwięzły przegląd: Gen SH2B3 koduje negatywny regulator sygnalizacji cytokin, a naturalnie występujące warianty utraty funkcji w tym genie zwiększają liczbę RBC in vivo. Ukierunkowana supresja SH2B3 w pierwotnych ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych zwiększyła dojrzewanie i ogólną wydajność RBC pochodzących z in vitro. Co więcej, inaktywacja SH2B3 przez edycję genomu CRISPR / Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych pozwoliła na zwiększoną ekspansję komórek erytroidalnych z zachowanym różnicowaniem. (Patrz także przegląd.)

Płytki krwi ekstrudowane z megakariocytów

Płytki krwi

Płytki krwi pomaga zapobiec krwotok w trombocytopenia pacjentów i pacjentów z samoistną . Istotnym problemem dla pacjentów poddawanych wielokrotnym transfuzjom jest oporność na transfuzje płytek krwi. Zatem zdolność do wytwarzania produktów płytkowych ex vivo i produktów płytkowych pozbawionych antygenów HLA w pożywkach bez surowicy miałaby wartość kliniczną. Interferencji RNA mechanizm -na zastosowano wektor lentiwirusowy wyrazić krótkim spinki RNAi kierowania transkryptów β2 mikroglobuliny CD34-dodatnich komórek. Wygenerowane płytki krwi wykazały 85% redukcję antygenów HLA klasy I. Te płytki krwi wydawały się działać normalnie in vitro

Jedna z możliwych do zastosowania klinicznie strategii uzyskiwania funkcjonalnych płytek krwi z ludzkiego iPSC obejmuje ustanowienie stabilnych unieśmiertelnionych linii komórek progenitorowych megakariocytów (imMKCL) poprzez nadekspresję BMI1 i BCL-XL zależną od doksycykliny . Powstałe imMKCLs można namnażać w hodowli przez dłuższe okresy (4-5 miesięcy), nawet po kriokonserwacji . Zatrzymanie nadekspresji (poprzez usunięcie doksycykliny z pożywki) c-MYC, BMI1 i BCL-XL w rosnących imMKCLs doprowadziło do wytworzenia płytek CD42b + o funkcjonalności porównywalnej z płytkami natywnymi na podstawie szeregu testów in vitro i in vivo. Thomas i wsp. opisują strategię programowania do przodu opartą na jednoczesnej egzogennej ekspresji 3 czynników transkrypcyjnych: GATA1 , FLI1 i TAL1 . Przednia zaprogramowane megakariocytami proliferacji i różnicowania w hodowli przez kilka miesięcy z czystością megakariocytów ponad 90% osiągając maksymalnie 2x10 ⁵ dojrzałych megakariocytów za HPSC wejściowego. Funkcjonalne płytki krwi są generowane w całej hodowli, co umożliwia prospektywne pobranie kilku jednostek transfuzyjnych z zaledwie miliona początkowych hPSC. Zobacz także przegląd

Komórki odpornościowe

Wyspecjalizowany typ białych krwinek , znany jako cytotoksyczne limfocyty T (CTL), jest wytwarzany przez układ odpornościowy i jest w stanie rozpoznać określone markery na powierzchni różnych komórek zakaźnych lub nowotworowych, powodując ich atak w celu zabicia szkodliwych komórki. Stąd immunoterapia funkcjonalnymi, swoistymi dla antygenu komórkami T ma potencjał jako strategia terapeutyczna do zwalczania wielu nowotworów i infekcji wirusowych. Źródła komórek są jednak ograniczone, ponieważ są naturalnie produkowane w niewielkich ilościach i mają krótką żywotność.

Potencjalnie skutecznym podejściem do wytwarzania CTL swoistych dla antygenu jest przekształcenie dojrzałych immunologicznych komórek T w iPSC, które mają nieograniczoną zdolność proliferacyjną in vitro i po ich namnożeniu, aby nakłonić je do ponownego różnicowania się w komórki T.

Inna metoda łączy technologie iPSC i chimerowego receptora antygenowego (CAR) w celu wytworzenia ludzkich komórek T ukierunkowanych na CD19 , antygen wyrażany przez złośliwe komórki B , w hodowli tkankowej. To podejście do generowania terapeutycznych ludzkich komórek T może być przydatne w immunoterapii raka i innych zastosowaniach medycznych.

Niezmienne limfocyty T (iNKT) mają ogromny potencjał kliniczny jako adiuwanty w immunoterapii nowotworów. Komórki iNKT działają jak wrodzone limfocyty T i służą jako pomost między wrodzonym a nabytym układem odpornościowym . Wzmacniają one odpowiedzi przeciwnowotworowe poprzez wytwarzanie interferonu-gamma (IFN-γ). Zaproponowano podejście polegające na zbieraniu, przeprogramowaniu/odróżnicowaniu, ponownemu różnicowaniu i wstrzykiwaniu do powiązanego leczenia nowotworu.

Komórki dendrytyczne (DC) specjalizują się w kontrolowaniu odpowiedzi komórek T. DC z odpowiednimi modyfikacjami genetycznymi mogą przetrwać wystarczająco długo, aby stymulować CTL swoiste dla antygenu, a następnie zostać całkowicie wyeliminowane. Komórki prezentujące antygen podobne do DC uzyskane z indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych mogą służyć jako źródło terapii szczepionkowej .

Białko wiążące CCAAT/wzmacniacz-α (C/EBPα) indukuje transdyferencjację komórek B do makrofagów z wysoką wydajnością i wzmaga przeprogramowanie do komórek iPS, gdy ulega koekspresji z czynnikami transkrypcyjnymi Oct4, Sox2, Klf4 i Myc. przy 100-krotnym wzroście wydajności przeprogramowania komórek iPS, obejmującym 95% populacji. Ponadto C/EBPa może z dużą wydajnością przekształcać wybrane ludzkie komórki chłoniaka i białaczki z komórek B w komórki przypominające makrofagi, osłabiając zdolność komórek do tworzenia guzów.

Odmładzanie komórek nabłonka grasicy

Grasica jest pierwszym organem pogorszeniu wraz z wiekiem. To kurczenie się jest jednym z głównych powodów, dla których z wiekiem układ odpornościowy staje się mniej skuteczny. Zmniejszona ekspresja czynnika transkrypcji komórek nabłonka grasicy FOXN1 została powiązana z elementem mechanizmu regulującego inwolucję związaną z wiekiem.

Clare Blackburn i współpracownicy wykazali, że ustaloną, związaną z wiekiem inwolucję grasicy można odwrócić przez wymuszoną regulację w górę tylko jednego czynnika transkrypcyjnego – FOXN1 w komórkach nabłonka grasicy w celu promowania odmładzania , proliferacji i różnicowania tych komórek do w pełni funkcjonalnego nabłonka grasicy. Temu odmłodzeniu i zwiększonej proliferacji towarzyszyła regulacja w górę genów promujących progresję cyklu komórkowego ( cyklina D1 , ΔN p63 , FgfR2IIIb ) i które są wymagane w komórkach nabłonka grasicy do promowania określonych aspektów rozwoju limfocytów T ( Dll4 , Kitl , Ccl25 , Cxcl12 ) , Cd40 , Cd80 , Ctsl , Pax 1 ). W przyszłości metoda ta może być szeroko stosowana w celu wzmocnienia funkcji odpornościowej i zwalczania stanów zapalnych u pacjentów poprzez odmładzanie grasicy in situ .

Mezenchymalne komórki macierzyste

Wprowadzenie

Mezenchymalne komórki macierzyste/zrębowe (MSC) są badane pod kątem zastosowań w naprawie serca, nerek, układu nerwowego, stawów i kości, a także w stanach zapalnych i współprzeszczepianiu układu krwiotwórczego. Wynika to z ich właściwości immunosupresyjnych i zdolności do różnicowania się w szeroką gamę tkanek o linii mezenchymalnej. MSC są zazwyczaj pobierane ze szpiku kostnego lub tłuszczu dorosłych, ale wymagają one bolesnych procedur inwazyjnych i są źródłami o niskiej częstotliwości, stanowiąc zaledwie 0,001–0,01% komórek szpiku kostnego i 0,05% w aspiratach liposukcji. Niepokój związany z zastosowaniem autologicznym, w szczególności u osób starszych najbardziej potrzebujących naprawy tkanek, liczba i jakość MSC zmniejsza się wraz z wiekiem.

IPSC można było uzyskać przez odmładzanie komórek nawet stulatków. Ponieważ iPSC można zbierać bez ograniczeń etycznych, a kulturę można rozwijać w nieskończoność, są one korzystnym źródłem MSC. Leczenie IPSC za pomocą SB-431542 prowadzi do szybkiego i jednolitego wytwarzania MSC z ludzkich iPSC. (SB-431542 jest inhibitorem aktywina / TGF ścieżki blokując fosforylacji z ALK4 , ALK5 i ALK7 receptorów). Te IPS MSC może brak zdolności potworniak formowania, wykazują normalną stabilne kariotyp hodowli, wzrostu i różnicowania wykazują właściwości, które bardzo przypominają te z pierwotnych MSC. Ma potencjał do zwiększania skali in vitro, umożliwiając terapie oparte na MSC. MSC pochodzące z iPSC mają zdolność wspomagania regeneracji przyzębia i są obiecującym źródłem łatwo dostępnych komórek macierzystych do zastosowania w klinicznym leczeniu zapalenia przyzębia.

Lai i wsp. oraz Lu opisują metodę chemiczną generowania komórek podobnych do MSC (iMSC) z ludzkich pierwotnych fibroblastów skóry przy użyciu sześciu chemicznych inhibitorów (SP600125, SB202190, Go6983, Y-27632, PD0325901 i CHIR99021) z 3 lub bez 3 czynniki wzrostu (transformujący czynnik wzrostu-β (TGF-β), podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) i czynnik hamujący białaczkę (LIF)). Koktajl chemiczny bezpośrednio przekształca ludzkie fibroblasty w iMSC w hodowli jednowarstwowej w ciągu 6 dni, a współczynnik konwersji wyniósł około 38%.

Oprócz terapii komórkowej in vivo, hodowlę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych można wykorzystać in vitro do masowej produkcji egzosomów , które są idealnymi nośnikami do dostarczania leków.

Odróżnicowane adipocyty

Tkanka tłuszczowa, ze względu na swoją obfitość i stosunkowo mniej inwazyjne metody pozyskiwania, stanowi źródło mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC). Niestety aspiraty liposukcyjne to tylko 0,05% MSCs. Jednak dużą ilość dojrzałych adipocytów, które na ogół utraciły swoje zdolności proliferacyjne i dlatego są zazwyczaj odrzucane, można łatwo wyizolować z zawiesiny komórek tłuszczowych i odróżnicować w pozbawione lipidów komórki podobne do fibroblastów, zwane komórkami odróżnicowanego tłuszczu (DFAT). . Komórki DFAT przywracają zdolność aktywnej proliferacji i wyrażają zdolności multipotencjalne. W porównaniu z dorosłymi komórkami macierzystymi, komórki DFAT wykazują wyjątkowe zalety pod względem obfitości, izolacji i jednorodności. W odpowiedniej hodowli indukcyjnej in vitro lub w odpowiednim środowisku in vivo, komórki DFAT mogą wykazywać potencjał adipogeniczny, osteogenny, chondrogenny i miogenny. Mogą również wykazywać cechy okołonaczyniowe i wywoływać neowaskularyzację.

Komórki chondrogenne

Chrząstka to tkanka łączna odpowiedzialna za ruch stawów bez tarcia. Jego zwyrodnienie prowadzi ostatecznie do całkowitej utraty funkcji stawów w późnych stadiach choroby zwyrodnieniowej stawów . Jako tkanka beznaczyniowa i hipokomórkowa, chrząstka ma ograniczoną zdolność samonaprawy. Chondrocyty są jedynym typem komórek w chrząstce, w której są otoczone macierzą zewnątrzkomórkową, którą wydzielają i gromadzą.

Jedną z metod wytwarzania chrząstki jest indukowanie jej z komórek iPS. Alternatywnie, możliwe jest przekształcenie fibroblastów bezpośrednio w indukowane komórki chondrogenne (iChon) bez pośredniego stadium komórek iPS, przez wprowadzenie trzech czynników reprogramujących (c-MYC, KLF4 i SOX9). Ludzkie komórki iChon wykazywały ekspresję genów markerowych dla chondrocytów (kolagen typu II), ale nie fibroblastów.

Wszczepione w ubytki powstałe w chrząstce stawowej szczurów ludzkie komórki iChon przeżyły, tworząc tkankę chrzęstną przez co najmniej cztery tygodnie, bez guzów. Metoda wykorzystuje c-MYC, o którym sądzi się, że odgrywa główną rolę w onkogenezie i wykorzystuje retrowirusa do wprowadzenia czynników przeprogramowania, wykluczając go z niezmodyfikowanego zastosowania w leczeniu ludzi.

Źródła komórek do przeprogramowania

Najczęściej wykorzystywanymi źródłami przeprogramowania są krwinki i fibroblasty, uzyskane przez biopsję skóry, ale pobieranie komórek z moczu jest mniej inwazyjne. Ta ostatnia metoda nie wymaga biopsji ani pobierania krwi. Od 2013 roku komórki macierzyste pochodzące z moczu różnicowano w linie śródbłonkowe, osteogenne, chondrogenne, adipogeniczne, miogenne szkieletowe i neurogenne, bez tworzenia potworniaków. Dlatego ich pamięć epigenetyczna jest przystosowana do przeprogramowania w komórki iPS. Jednak w moczu pojawia się niewiele komórek, osiągnięto jedynie niską wydajność konwersji, a ryzyko skażenia bakteryjnego jest stosunkowo wysokie.

Innym obiecującym źródłem komórek do przeprogramowania są mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z ludzkich mieszków włosowych.

Pochodzenie komórek somatycznych wykorzystywanych do przeprogramowania może wpływać na skuteczność przeprogramowania, właściwości funkcjonalne otrzymanych indukowanych komórek macierzystych oraz zdolność do tworzenia guzów.

IPSC zachowują pamięć epigenetyczną swojej tkanki, z której pochodzą, co wpływa na ich potencjał różnicowania. Ta pamięć epigenetyczna niekoniecznie objawia się na etapie pluripotencji – iPSC pochodzące z różnych tkanek wykazują odpowiednią morfologię, wyrażają markery pluripotencji i są zdolne do różnicowania się w trzy warstwy embrionalne in vitro i in vivo. Jednak ta pamięć epigenetyczna może objawiać się podczas ponownego różnicowania się na określone typy komórek, które wymagają określonych loci noszących szczątkowe ślady epigenetyczne.

Zobacz też

Bibliografia

Dalsza lektura