Hemocytometr - Hemocytometer

Hemocytometr . Dwa półodblaskowe prostokąty to komory zliczające.
Ładowanie komory
Siatka hemocytometru (patrz tabela)

Hemocytometru (lub hemocytometru) jest urządzenie zliczające komory zaprojektowany i zazwyczaj wykorzystywane do komórek zliczanie we krwi .

Hemocytometr został wynaleziony przez Louisa-Charlesa Malasseza i składa się z grubego szkiełka mikroskopowego z prostokątnym wcięciem, które tworzy precyzyjną komorę objętościową. Ta komora jest wygrawerowana laserowo wytrawioną siatką prostopadłych linii. Urządzenie jest starannie wykonane, aby znany był obszar ograniczony liniami, a także znana jest głębokość komory. Obserwując określony obszar siatki, możliwe jest zatem policzenie liczby komórek lub cząstek w określonej objętości płynu, a tym samym obliczenie ogólnego stężenia komórek w płynie. Dobrze stosowanym typem hemocytometru jest komora zliczeniowa Neubauera .

Inne typy hemocytometrów z różnymi liniałami są używane do różnych zastosowań. linijka Fuchsa-Rosenthala, powszechnie używana do liczenia płynu mózgowo-rdzeniowego, linijka Howarda do liczenia pleśni na produktach spożywczych i opakowaniach żywności, liniatura McMaster Egg Slide używana do liczenia jaj drobnoustrojów w materiale kałowym, liniatura komory Nageotte do liczenia niskich poziomów białych krwinek w bieli składniki płytek krwi o zmniejszonej zawartości komórek, rząd Palmera Nanoplanktonu do liczenia mniejszych plankterów. Licznik Petroff-Hausser wykorzystujący ulepszone linijki Neubauera jest używany do liczenia bakterii i plemników i jest oferowany z różnymi głębokościami komory. Liniatura Sedgwick-Rafter Cell w hemocytometrze jest przeznaczona przede wszystkim do mikroskopii wody pitnej.

Zasady

Gridded obszar Improved Neubauer wykluczyć składa hemocytometru dziewięciu 1 x 1 mm (1 mm 2 ) kwadraty. Są one podzielone na trzy kierunki; 0,25 x 0,25 mm (0,0625 mm 2 ), 0,25 x 0,20 mm (0,05 mm 2 ) i 0,20 x 0,20 mm (0,04 mm 2 ). Centralny kwadrat jest dalej podzielony na kwadraty o wymiarach 0,05 x 0,05 mm (0,0025 mm 2 ). Uniesione krawędzie hemocytometru przytrzymują szkiełko nakrywkowe w odległości 0,1 mm od zaznaczonej siatki, nadając każdemu kwadratowi określoną objętość (patrz rysunek po prawej).

Wymiary Powierzchnia Objętość na głębokości 0,1 mm
1x1mm 1 mm 2 100 nL
0,25 x 0,25 mm 0,0625 mm 2 6,25 nL
0,25 x 0,20 mm 0,05 mm 2 5 nL
0,20 x 0,20 mm 0,04 mm 2 4 nL
0,05 x 0,05 mm 0,0025 mm 2 0,25 nL

Stosowanie

Aby skorzystać z hemocytometru, należy najpierw upewnić się, że specjalne szkiełko nakrywkowe dostarczone wraz z komorą zliczeniową jest prawidłowo umieszczone na powierzchni komory zliczeniowej. Gdy dwie szklane powierzchnie są w odpowiednim kontakcie , można zaobserwować pierścienie Newtona . Jeśli tak, zawiesinę komórek nakłada się na krawędź szkiełka nakrywkowego, które ma być zassane do pustej przestrzeni przez działanie kapilarne, które całkowicie wypełnia komorę próbką. Liczbę komórek w komorze można określić przez bezpośrednie liczenie za pomocą mikroskopu , a komórki rozróżnialne wizualnie można zliczać w różny sposób. Liczba komórek w komorze służy do obliczania stężenia lub gęstości komórek w mieszaninie, z której pochodzi próbka. Jest to liczba komórek w komorze podzielona przez objętość komory, która jest znana od początku z uwzględnieniem ewentualnych rozcieńczeń i skrótów liczenia:

gdzie objętość rozcieńczonej próbki (po rozcieńczeniu) podzielona przez objętość oryginalnej mieszaniny w próbce (przed rozcieńczeniem) jest współczynnikiem rozcieńczenia . Na przykład, jeśli objętość oryginalnej mieszaniny wynosiła 20 µl i została ona jednokrotnie rozcieńczona (dodając 20 µl rozcieńczalnika), to drugi termin w nawiasach wynosi 40 µl/20 µl. Objętość zliczonych kwadratów jest taka, jak pokazano w tabeli u góry, w zależności od rozmiaru (patrz rysunek po prawej). Liczba zliczonych komórek jest sumą wszystkich komórek zliczonych w kwadratach w jednej komorze. Proporcja zliczonych komórek ma zastosowanie, jeśli nie zostaną policzone wszystkie wewnętrzne kwadraty w ekierce (tj. jeśli liczone są tylko 4 z 20 w kwadracie narożnym, to ten wyraz będzie równy 0,2).

Części hemocytometru (widok z boku) są identyfikowane.

W większości zastosowań używane są tylko cztery duże kwadraty narożne. Liczone są komórki, które znajdują się na lub dotykają górnej i lewej linii, ale te, które znajdują się na prawej lub dolnej linii lub dotykają tej linii, są ignorowane.

Wymagania

Pusta siatka hemocytometru przy 100x mocy.

Oryginalną zawiesinę należy dokładnie wymieszać przed pobraniem próbki. Zapewnia to, że próbka jest reprezentatywna, a nie tylko artefaktem konkretnego regionu oryginalnej mieszaniny, z której została pobrana.

Należy zastosować odpowiednie rozcieńczenie mieszaniny w zależności od liczby komórek, które mają być zliczone. Jeśli próbka nie zostanie wystarczająco rozcieńczona, komórki będą zbyt ciasne i trudne do zliczenia. Jeśli jest zbyt rozcieńczony, wielkość próbki nie będzie wystarczająca, aby wnioskować o stężeniu w oryginalnej mieszaninie.

Przeprowadzając nadmiarowy test w drugiej komorze, można porównać wyniki. Jeżeli różnią się one więcej niż 2-krotność błędu liczenia (pierwiastek kwadratowy z liczenia), metoda pobrania próbki może być zawodna (np. oryginalna mieszanina nie jest dokładnie wymieszana).

Komora zliczeniowa powinna być napełniana kapilarnie po założeniu pokrywy komory (specjalne szkiełko nakrywkowe o certyfikowanej grubości i płaskości). Pozwala to uniknąć ryzyka sedymentacji/przyklejenia się komórek do szkła lub wyparowania pewnej objętości przed umieszczeniem szkiełka nakrywkowego na wierzchu, co skutkuje przeszacowaniem stężenia komórek. Sedymentacja jest mniejszym problemem w przypadku bakterii, ale parowanie, bardziej rozpowszechnione w klimatyzowanych laboratoriach o niskiej wilgotności, nadal musi być zminimalizowane.

Aplikacje

  • Morfologia : dla pacjentów z nieprawidłowymi komórkami krwi, u których automatyczne liczniki nie działają dobrze.
  • Liczba plemników
  • Hodowla komórkowa: podczas subkultury lub rejestrowania wzrostu komórek w czasie.
  • Warzenie piwa : do przygotowania drożdży.
  • Liczenie komórek fitoplanktonu
  • Przetwarzanie komórek do dalszej analizy: w wielu testach ( PCR , cytometria przepływowa ) wymagana jest dokładna liczba komórek , podczas gdy inne wymagają wysokiej żywotności komórek.
  • Pomiar rozmiaru komórki: na mikrofotografii rzeczywisty rozmiar komórki można wywnioskować, skalując go do szerokości kwadratu hemocytometru, który jest znany.

Bibliografia

Zewnętrzne linki