Lucyferaza - Luciferase
| Bakteryjna rodzina monooksygenazy lucyferazy | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Identyfikatory | |||||||||||
| Symbol | Bac_lucyferase | ||||||||||
| Pfam | PF00296 | ||||||||||
| InterPro | IPR016048 | ||||||||||
| PROSITE | PDOC00397 | ||||||||||
| SCOP2 | 1nfp / zakres / SUPFAM | ||||||||||
| |||||||||||
| Domena katalityczna lucyferazy Dinoflagellata | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 struktura krystaliczna domeny lucyferazy z bruzdnicy Lingulodinium polyedrum
| |||||||||
| Identyfikatory | |||||||||
| Symbol | Luciferase_cat | ||||||||
| Pfam | PF10285 | ||||||||
| InterPro | IPR018804 | ||||||||
| |||||||||
| Dinofflagellate lucyferaza/LBP N-końcowa domena | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Identyfikatory | |||||||||
| Symbol | Lucyferaza_N | ||||||||
| Pfam | PF05295 | ||||||||
| InterPro | IPR007959 | ||||||||
| |||||||||
| Domena helikalnej wiązki lucyferazy Dinoflagellata | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Identyfikatory | |||||||||
| Symbol | Lucyferaza_3H | ||||||||
| Pfam | PF10284 | ||||||||
| InterPro | IPR018475 | ||||||||
| |||||||||
Lucyferaza to ogólny termin określający klasę enzymów oksydacyjnych , które wytwarzają bioluminescencję i zwykle odróżnia się go od fotoproteiny . Nazwa została po raz pierwszy użyta przez Raphaëla Dubois, który wynalazł słowa lucyferyna i lucyferaza, odpowiednio dla i enzym . Oba słowa wywodzą się od łacińskiego słowa lucifer , co oznacza „nosiciel światła”, które z kolei pochodzi od łacińskich słów oznaczających „światło” ( lux) i „przynosić lub nieść” ( ferre) .
| Lucyferaza świetlika | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Struktura lucyferazy świetlika Photinus pyralis .
| |||||||
| Identyfikatory | |||||||
| Organizm | |||||||
| Symbol | Lucyferaza świetlika | ||||||
| WPB | 1LCI Więcej struktur | ||||||
| UniProt | P08659 | ||||||
| Inne dane | |||||||
| Numer WE | 1.13.12.7 | ||||||
| |||||||
Lucyferazy są szeroko stosowane w biotechnologii , w mikroskopii i jako geny reporterowe , do wielu takich samych zastosowań jak białka fluorescencyjne . Jednakże, w przeciwieństwie do białek fluorescencyjnych, lucyferazy nie wymagają zewnętrznego źródła światła , ale wymagają dodania lucyferyny , zużywalnego substratu.
Przykłady
Różnorodne organizmy regulują produkcję światła za pomocą różnych lucyferaz w różnych reakcjach emitujących światło. Większość badanych lucyferaz znaleziono u zwierząt, w tym u świetlików i wielu zwierząt morskich, takich jak widłonogi , meduzy i bratek morski . Jednak lucyferazy badano w świecących grzybach, takich jak grzyb Jack-O-Lantern , a także przykłady w innych królestwach, w tym świecące bakterie i bruzdnice .
Świetlik i chrząszcz trzask
W lucyferazy świetlików - od którego istnieje ponad 2000 gatunków - a z drugiej Elateroidea (kliknij chrząszcze i krewnych w ogóle) są zróżnicowane wystarczy być użyteczne w filogenezy molekularnej . U świetlików wymagany tlen jest dostarczany przez rurkę w jamie brzusznej, zwaną tchawicą brzuszną . Jeden z dobrze poznanych lucyferazy, który w Photinini świetlika Photinus pyralis , który ma optymalne pH 7,8.
Bratek morski
Również dobrze zbadany jest bratek morze , Renilla reniformis . W tym organizmie lucyferaza ( 2monooksygenaza Renilla-lucyferyna ) jest ściśle związana z białkiem wiążącym lucyferynę, jak również z białkiem zielonej fluorescencji ( GFP ). Wapń wyzwala uwalnianie lucyferyny ( koelenterazyny ) z białka wiążącego lucyferynę. Substrat jest następnie dostępny do utlenienia przez lucyferazę, gdzie ulega degradacji do koelenteramidu z uwolnieniem energii. W przypadku braku GFP energia ta byłaby uwalniana jako foton światła niebieskiego (długość fali emisji szczytowej 482 nm). Jednak ze względu na blisko związany GFP, energia uwalniana przez lucyferazę jest zamiast tego sprzężona poprzez transfer energii rezonansowej do fluoroforu GFP, a następnie jest uwalniana jako foton światła zielonego (długość fali szczytowej 510 nm). Katalizowana reakcja to:
- koelenterazyna + O 2 → koelenteramid + CO 2 + foton światła
Widłonóg
Ostatnio zidentyfikowano nowsze lucyferazy, które w przeciwieństwie do innych lucyferaz są naturalnie wydzielanymi cząsteczkami. Jednym z takich przykładów jest Metridia Coelenterazine -zależną lucyferazy (MetLuc, A0A1L6CBM1 ), pochodzący z morskich widłonogów Metridia longa . Metridia longa sekrecji genu lucyferazy koduje białko 24 kDa, zawierający N-końcowy sygnał wydzielniczy peptyd o 17 aminokwasu w pozostałości. Czułość i wysoka intensywność sygnału tej cząsteczki lucyferazy okazuje się korzystna w wielu badaniach reporterowych. Niektóre z korzyści wynikających ze stosowania wydzielanej cząsteczki reporterowej, takiej jak MetLuc, to jej protokół braku lizy, który umożliwia przeprowadzenie testów na żywych komórkach i wielu testów na tej samej komórce.
Bakteryjny
Bioluminescencję bakteryjną obserwuje się u gatunków Photobacterium, Vibrio fischeri , Vibrio haweyi i Vibrio harveyi . Emisja światła w niektórych bakteriach bioluminescencyjnych wykorzystuje „antenę”, taką jak białko lumazyny, do przyjmowania energii z pierwotnego stanu wzbudzonego na lucyferazie, co skutkuje wzbudzonym chromoforem lulnazyny, który emituje światło o krótszej długości fali (bardziej niebieskie), podczas gdy w innych użyj żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) z FMN jako chromoforem i emituje światło, które jest przesunięte ku czerwieni w stosunku do światła z lucyferazy.
Dinoflagellate
Bruzdnice lucyferazy multi- domeny eukariotyczny białko, składające się z N-końcowej domeny, i trzy domeny katalitycznej , z których każdy poprzedzony śrubowej domeny pakietu. Rozwiązano strukturę domeny katalitycznej lucyferazy Dinoflagellata . Rdzeń domeny to 10-niciowa beczka beta, która jest strukturalnie podobna do lipokalin i FABP . Domena N-końcowa jest konserwowana między lucyferazą bruzdnicową a białkami wiążącymi lucyferynę (LBP). Sugerowano, że region ten może pośredniczyć w interakcji między LBP i lucyferazą lub ich związku z błoną wakuolarną . Domena helikalnej wiązki ma strukturę trzech helis , która zawiera cztery ważne histydyny, które, jak się uważa, odgrywają rolę w regulacji pH enzymu . W β-beczce lucyferazy dinoflagellate przy pH 8 znajduje się duża kieszeń, aby pomieścić substrat tetrapirolowy, ale nie ma otworu umożliwiającego wejście substratu. Dlatego musi nastąpić znacząca zmiana konformacyjna, aby zapewnić dostęp i miejsce dla liganda w miejscu aktywnym, a źródłem tej zmiany są cztery N-końcowe reszty histydyny. Przy pH 8 można zauważyć, że nieprotonowane reszty histydyny są zaangażowane w sieć wiązań wodorowych na granicy helis w wiązce, które blokują dostęp substratu do miejsca aktywnego i zakłócenie tego oddziaływania przez protonowanie (przy pH 6,3) lub zastąpienie reszt histydyny przez alaninę powoduje duży ruch molekularny wiązki, rozdzielając helisy o 11 Å i otwierając miejsce katalityczne. Logicznie rzecz biorąc, reszty histydyny nie mogą być zastąpione przez alaninę w naturze, ale to eksperymentalne zastąpienie dodatkowo potwierdza, że większe reszty histydyny blokują miejsce aktywne. Dodatkowo, trzy sekwencje Gly-Gly, jedna w N-końcowej helisie i dwie w motywie helisa-pętla-helisa, mogą służyć jako zawiasy, wokół których obracają się łańcuchy w celu dalszego otwarcia ścieżki do miejsca katalitycznego i powiększenia aktywnego Strona.
Lucyferaza bruzdnicowa jest zdolna do emitowania światła dzięki interakcji ze swoim substratem ( lucyferyną ) i białkiem wiążącym lucyferynę (LBP) w organelli scintillonowych występujących we wiciowcach. Lucyferaza działa zgodnie z lucyferyną i LBP, aby emitować światło, ale każdy składnik działa w innym pH. Lucyferaza i jej domeny nie są aktywne przy pH 8, ale są niezwykle aktywne przy optymalnym pH 6,3, podczas gdy LBP wiąże lucyferynę przy pH 8 i uwalnia ją przy pH 6,3. W konsekwencji lucyferyna jest uwalniana do reakcji z aktywną lucyferazą tylko wtedy, gdy scyntyl jest zakwaszony do pH 6,3. Dlatego, w celu obniżenia pH, w błonie scyntylowej otwierane są bramkowane napięciem kanały, aby umożliwić wejście protonów z wakuoli o potencjale czynnościowym wytworzonym w wyniku mechanicznej stymulacji. W związku z tym można zauważyć, że potencjał czynnościowy w błonie wakuolarnej prowadzi do zakwaszenia, a to z kolei pozwala na uwolnienie lucyferyny, aby reagowała z lucyferazą w scyntylonie, wytwarzając błysk niebieskiego światła.
Mechanizm reakcji
Wszystkie lucyferazy są klasyfikowane jako oksydoreduktazy ( EC 1.13.12.- ), co oznacza, że działają na pojedynczych dawców z włączeniem tlenu cząsteczkowego. Ponieważ lucyferazy pochodzą z wielu różnych rodzin białek , które nie są spokrewnione, nie ma mechanizmu ujednolicającego, ponieważ każdy mechanizm zależy od kombinacji lucyferazy i lucyferyny. Wykazano jednak, że wszystkie dotychczas scharakteryzowane reakcje lucyferaza-lucyferyna wymagają na pewnym etapie tlenu cząsteczkowego .
Lucyferaza bakteryjna
Reakcja katalizowana przez bakteryjną lucyferazę jest również procesem utleniania:
- FMNH 2 + O 2 + RCHO → FMN + RCOOH + H 2 O + światło
W reakcji tlen cząsteczkowy utlenia mononukleotyd flawiny i długołańcuchowy aldehyd alifatyczny do alifatycznego kwasu karboksylowego . W wyniku reakcji powstaje wzbudzony związek pośredni hydroksyflawiny, który jest odwadniany do produktu FMN, aby wyemitować niebiesko-zielone światło.
Prawie cała energia włożona w reakcję jest przekształcana w światło. Reakcja jest wydajna od 80% do 90%. Dla porównania żarówka zamienia tylko około 10% swojej energii na światło, a dioda LED o mocy 150 lumenów na wat (lm/W) zamienia 20% energii wejściowej na światło widzialne.
Aplikacje
Lucyferazy można wytwarzać w laboratorium za pomocą inżynierii genetycznej do wielu celów. Geny lucyferazy mogą być syntetyzowane i wstawiane do organizmów lub transfekowane do komórek. Od 2002 roku myszy , jedwabniki i ziemniaki to tylko kilka organizmów, które zostały już zaprojektowane do produkcji białka.
W reakcji lucyferazy światło jest emitowane, gdy lucyferaza działa na odpowiedni substrat lucyferyny . Emisję fotonów można wykryć za pomocą aparatury światłoczułej, takiej jak luminometr lub zmodyfikowane mikroskopy optyczne . Pozwala to na obserwację procesów biologicznych. Ponieważ wzbudzenie światłem nie jest potrzebne do bioluminescencji lucyferazy, autofluorescencja jest minimalna , a zatem fluorescencja praktycznie pozbawiona tła. W związku z tym przy użyciu standardowego licznika scyntylacyjnego można dokładnie zmierzyć zaledwie 0,02 pg .
W badaniach biologicznych lucyferaza jest powszechnie stosowana jako reporter do oceny aktywności transkrypcyjnej w komórkach transfekowanych konstruktem genetycznym zawierającym gen lucyferazy pod kontrolą promotora będącego przedmiotem zainteresowania. Dodatkowo, proluminescencyjne cząsteczki, które są przekształcane w lucyferynę pod wpływem aktywności konkretnego enzymu, mogą być stosowane do wykrywania aktywności enzymu w sprzężonych lub dwuetapowych testach lucyferazy. Takie substraty były wykorzystywane m.in. do wykrywania aktywności kaspazy i cytochromu P450 .
Lucyferazę można również stosować do wykrywania poziomu komórkowego ATP w testach żywotności komórek lub w testach aktywności kinazy. Lucyferaza może działać jako białko czujnika ATP poprzez biotynylację . Biotynylacja unieruchamia lucyferazę na powierzchni komórki poprzez wiązanie się z kompleksem streptawidyna - biotyna . Pozwala to lucyferazie na wykrycie wypływu ATP z komórki i skutecznie pokaże uwalnianie ATP w czasie rzeczywistym poprzez bioluminescencję. Lucyferazę można dodatkowo uczynić bardziej czułą na wykrywanie ATP poprzez zwiększenie intensywności luminescencji poprzez zmianę pewnych reszt aminokwasowych w sekwencji białka.
Obrazowanie całego zwierzęcia (określane jako obrazowanie in vivo podczas życia lub inaczej zwane obrazowaniem ex vivo ) to potężna technika badania populacji komórek u żywych zwierząt, takich jak myszy. Różne typy komórek (np. komórki macierzyste szpiku kostnego, limfocyty T) można zaprojektować tak, aby wyrażały lucyferazę, umożliwiając ich nieinwazyjną wizualizację wewnątrz żywego zwierzęcia za pomocą czułej kamery z parą ładunków ( kamera CCD ). Ta technika została wykorzystana do śledzenia nowotworzenia i odpowiedzi guzów na leczenie w modelach zwierzęcych. Jednak czynniki środowiskowe i ingerencje terapeutyczne mogą powodować pewne rozbieżności między obciążeniem guzem a intensywnością bioluminescencji w odniesieniu do zmian aktywności proliferacyjnej. Intensywność sygnału mierzona za pomocą obrazowania in vivo może zależeć od różnych czynników, takich jak wchłanianie D-lucyferyny przez otrzewną, przepływ krwi, przepuszczalność błony komórkowej, dostępność kofaktorów, wewnątrzkomórkowe pH i przezroczystość leżącej powyżej tkanki, oprócz ilość lucyferazy.
Lucyferaza jest białkiem wrażliwym na ciepło , które jest wykorzystywane w badaniach nad denaturacją białek , testując zdolności ochronne białek szoku cieplnego . Możliwości wykorzystania lucyferazy wciąż się rozszerzają.
Zobacz też
Bibliografia
Zewnętrzne linki
-
Multimedia związane z Lucyferazą w Wikimedia Commons - Przegląd wszystkich informacji strukturalnych dostępnych w PDB dla UniProt : P08659 (4-monooksygenaza lucyferyny) w PDBe-KB .
- Trymer B, Zayas R, Qazi S, Lewis S, Michel T, Dudzinski D, Aprille J, Lagace C (2001-06-28). „Świetliki błyskowe i tlenek azotu” . Uniwersytet Tufts . Źródło 2008-10-02 .
- „Trendy w rozwoju genów reporterowych” . reportergene.com . Źródło 2009-03-07 .
- „BL Web: typy lucyferyny” . Strona internetowa dotycząca bioluminescencji . Uniwersytet Kalifornijski, Santa Barbara . Źródło 2009-03-07 .
- "Przewodnik po protokołach i zastosowaniach bioluminescencji reporterów" . Protokoły i aplikacje . Korporacja Promega. Zarchiwizowane od oryginału w dniu 2010-08-08 . Źródło 2009-03-07 .
- „BL Web: typy lucyferyny” . Encyklopedia Nauki i Filozofii ISCID . ISCID. Zarchiwizowane od oryginału w dniu 21.09.2012 . Źródło 2010-04-20 .
- Goodsell D. "Lucyferaza" . Cząsteczka miesiąca . Bank danych białkowych . Pobrano 15.01.2013 .
