NASBA (biologia molekularna) - NASBA (molecular biology)
Amplifikacja oparta na sekwencji kwasu nukleinowego, powszechnie określana jako NASBA , jest metodą biologii molekularnej, która jest stosowana do wytwarzania wielu kopii jednoniciowego RNA. NASBA to dwuetapowy proces, w którym RNA i wyżarzają specjalnie zaprojektowane startery, a następnie wykorzystuje koktajl enzymów do jego amplifikacji.
tło
Amplifikacja kwasu nukleinowego to technika stosowana do wytwarzania kilku kopii określonego segmentu RNA/DNA. Zamplifikowane RNA i DNA mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań, takich jak genotypowanie, sekwencjonowanie i wykrywanie bakterii lub wirusów. Istnieją dwa różne typy wzmocnienia, nieizotermiczne i izotermiczne. Amplifikacja nieizotermiczna wytwarza wiele kopii RNA/DNA poprzez powtarzane cykle pomiędzy różnymi temperaturami. Amplifikacja izotermiczna wytwarza wiele kopii RNA/DNA w stałej temperaturze reakcji. NASBA pobiera jednoniciowy RNA, przyłącza do niego startery w temperaturze 65 ℃, a następnie amplifikuje go w temperaturze 41 ℃, aby wytworzyć wiele kopii jednoniciowego RNA. Aby zaszła pomyślna amplifikacja, stosuje się koktajl enzymatyczny zawierający odwrotną transkryptazę ptasiej mieloblastozy (AMV-RT), RNazę H i polimerazę RNA. AMV-RT syntetyzuje komplementarną nić DNA (cDNA) z matrycy RNA po przyłączeniu startera. RNaza H następnie degraduje matrycę RNA, a drugi starter wiąże się z cDNA, tworząc dwuniciowy DNA, który polimeraza RNA wykorzystuje do syntezy kopii RNA. Jednym z kluczowych aspektów NASBA jest to, że materiał wyjściowy i produkt końcowy to zawsze jednoniciowy RNA. Biorąc to pod uwagę, można go użyć do amplifikacji DNA, ale DNA musi zostać przetłumaczone na RNA, aby zaszła pomyślna amplifikacja.
Inną techniką amplifikacji izotermicznej jest amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP).
Historia
NASBA została opracowana przez J Comptona w 1991 roku, który zdefiniował ją jako „technologię zależną od startera, która może być stosowana do ciągłej amplifikacji kwasów nukleinowych w jednej mieszaninie w jednej temperaturze”. Natychmiast po wynalezieniu NASBA zastosowano go do szybkiej diagnozy i ilościowego oznaczenia HIV-1 w surowicach pacjentów. Chociaż RNA można również amplifikować metodą PCR przy użyciu odwrotnej transkryptazy (w celu zsyntetyzowania komplementarnej nici DNA jako matrycy), główną zaletą NASBA jest to, że działa w warunkach izotermicznych – zwykle w stałej temperaturze 41 °C lub w dwóch różnych temperaturach , w zależności od użytych starterów i enzymów. Nawet gdy stosuje się dwie różne temperatury, nadal jest uważany za izotermiczny, ponieważ nie zmienia się między tymi temperaturami. NASBA może być stosowana w diagnostyce medycznej jako alternatywa dla PCR, która w pewnych okolicznościach jest szybsza i bardziej czuła.
Procedura
Wyjaśnione pokrótce, NASBA działa w następujący sposób:
- Matryca RNA dodana do mieszaniny reakcyjnej, pierwszy starter z regionem promotora T7 na końcu 5' przyłącza się do swojego miejsca komplementarnego na końcu 3' matrycy.
- Odwrotna transkryptaza syntetyzuje przeciwną komplementarną nić DNA rozciągającą się na końcu 3' startera, przesuwając się w górę wzdłuż matrycy RNA.
- RNAza H niszczy matrycę RNA ze związku DNA-RNA (RNAza H niszczy tylko RNA w hybrydach RNA-DNA, ale nie jednoniciowy RNA).
- Drugi starter przyłącza się do końca 5' (antysensownej) nici DNA.
- Odwrotna transkryptaza ponownie syntetyzuje inną nić DNA z dołączonego startera, w wyniku czego powstaje dwuniciowy DNA.
- Polimeraza RNA T7 wiąże się z regionem promotora na podwójnej nici. Ponieważ polimeraza RNA T7 może dokonywać transkrypcji tylko w kierunku od 3' do 5', sensowny DNA ulega transkrypcji i wytwarzany jest antysensowny RNA. Powtarza się to, a polimeraza w sposób ciągły wytwarza komplementarne nici RNA tej matrycy, co powoduje amplifikację.
- Teraz faza cykliczna może rozpocząć się podobnie jak w poprzednich krokach. Tutaj jednak drugi starter najpierw wiąże się z (-)RNA
- Odwrotna transkryptaza wytwarza teraz dupleks (+)cDNA/(-)RNA.
- RNAza H ponownie degraduje RNA i pierwszy starter wiąże się z teraz jednoniciowym +(cDNA)
- Odwrotna transkryptaza wytwarza teraz komplementarny (-)DNA, tworząc dupleks dsDNA
- Dokładnie tak jak w kroku 6, polimeraza T7 wiąże się z regionem promotora, aby wytworzyć (-)RNA i cykl jest zakończony.
Zastosowania kliniczne
Technika NASBA zostały wykorzystane do opracowania szybkich testów diagnostycznych dla wielu patogennych wirusów o pojedynczej nici RNA, na przykład genomu wirusa grypy A Zika wirusa pryszczycy pryszczycy wirusa, zespół ostrej ciężkiej niewydolności oddechowej ( SARS antigen) koronawirusa , ludzki bocavirus (HBoV), a także pasożyty takie jak Trypanosoma brucei .