Przeciwciała poliklonalne - Polyclonal antibodies

Ten artykuł dotyczy wytwarzania przeciwciał in vivo. Aby zapoznać się z jego medycznymi i biologicznymi zastosowaniami, zobacz Antiserum .

Przeciwciała poliklonalne (pAb) to przeciwciała wydzielane przez różne linie komórek B w organizmie (podczas gdy przeciwciała monoklonalne pochodzą z pojedynczej linii komórkowej). Stanowią zbiór cząsteczek immunoglobulin , które reagują na określony antygen , z których każda identyfikuje inny epitop .

Produkcja

Ogólna procedura wytwarzania przeciwciał poliklonalnych jest następująca:

  1. Przygotowanie antygenu
  2. Dobór i przygotowanie adiuwantów
  3. Wybór zwierząt
  4. Proces wtrysku
  5. Ekstrakcja surowicy krwi

Koniugat antygen/adiuwant wstrzykuje się wybranemu zwierzęciu w celu zainicjowania wzmocnionej odpowiedzi immunologicznej. Oczekuje się, że po serii zastrzyków przez określony czas zwierzę wytworzyło przeciwciała przeciwko koniugatowi. Krew jest następnie pobierana ze zwierzęcia, a następnie oczyszczana w celu uzyskania przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania.

Inokulację przeprowadza się na odpowiednim ssaku , takim jak mysz, królik lub koza. Często preferowane są większe ssaki, ponieważ ilość surowicy, którą można zebrać, jest większa. Antygen jest wprowadzany do ssaka. To indukuje limfocyty B do wytwarzania immunoglobulin IgG specyficznych dla antygenu. Ta poliklonalna IgG jest oczyszczana z surowicy ssaka .

Przeciwnie, przeciwciała monoklonalne pochodzą z pojedynczej linii komórkowej.

Istnieje wiele metodologii wytwarzania przeciwciał poliklonalnych u zwierząt laboratoryjnych. Wytyczne instytucjonalne regulujące wykorzystywanie zwierząt i procedury odnoszące się do tych metodologii są ogólnie zorientowane na względy humanitarne i odpowiednie postępowanie w przypadku stosowania adiuwantów (środków, które modyfikują działanie innych środków, a jednocześnie wywierają niewielki lub jakikolwiek bezpośredni wpływ, gdy są podawane samodzielnie). Obejmuje to wybór adiuwanta, drogi i miejsca podania, objętości wstrzyknięć na miejsce i liczbę miejsc na zwierzę. Zasady instytucji ogólnie obejmują dopuszczalne objętości krwi na pobranie i środki ostrożności, w tym odpowiednie unieruchomienie i uspokojenie lub znieczulenie zwierząt w celu zapobiegania urazom zwierząt lub personelu.

Podstawowym celem produkcji przeciwciał u zwierząt laboratoryjnych jest uzyskanie antysurowic o wysokim mianie i wysokim powinowactwie do stosowania w testach doświadczalnych lub diagnostycznych. Adiuwanty stosuje się w celu poprawy lub wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej na antygeny. Większość adiuwantów zapewnia miejsce wstrzyknięcia, magazyn antygenu, który pozwala na powolne uwalnianie antygenu do drenujących węzłów chłonnych.

Wiele adiuwantów zawiera również lub działa bezpośrednio jako:

  1. surfaktanty promujące koncentrację cząsteczek antygenów białkowych na dużej powierzchni oraz
  2. cząsteczki lub właściwości immunostymulujące. Adiuwanty są na ogół stosowane z rozpuszczalnymi antygenami białkowymi w celu zwiększenia miana przeciwciał i wywołania przedłużonej odpowiedzi z towarzyszącą pamięcią.

Takie antygeny same w sobie są ogólnie słabymi immunogenami. Większość złożonych antygenów białkowych indukuje wiele klonów komórek B podczas odpowiedzi immunologicznej, a zatem odpowiedź jest poliklonalna. Odpowiedzi immunologiczne na antygeny niebiałkowe są na ogół słabo lub wzmacniane przez adiuwanty i nie ma pamięci systemowej.

Przeciwciała są obecnie również produkowane przez izolację ludzkich limfocytów B w celu wytworzenia specyficznych mieszanin rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych. Firma biotechnologiczna Symphogen opracowuje tego typu przeciwciała do zastosowań terapeutycznych. Są pierwszą firmą badawczą, która osiągnęła fazę drugiej prób z mieszaninami przeciwciał monoklonalnych, które naśladują różnorodność leków zawierających przeciwciała poliklonalne. Ta produkcja zapobiega przenoszeniu wirusów i prionów i jest to prosty proces.

Wybór zwierząt

Zwierzęta często wykorzystywane do wytwarzania przeciwciał poliklonalnych obejmują kurczęta, kozy, świnki morskie, chomiki, konie, myszy, szczury i owce. Najczęściej wykorzystywanym do tego celu zwierzęciem laboratoryjnym jest jednak królik. Wybór zwierząt powinien opierać się na:

  1. potrzebna ilość przeciwciała,
  2. związek między dawcą antygenu a producentem przeciwciała biorcą (ogólnie im bardziej odległa relacja filogenetyczna, tym większy potencjał odpowiedzi przeciwciał o wysokim mianie) oraz
  3. niezbędne właściwości [np. klasa, podklasa (izotyp), charakter wiążący dopełniacz] wytwarzanych przeciwciał. Immunizacja i upuszczanie krwi są związane ze stresem i przynajmniej w przypadku stosowania królików i gryzoni preferowane są zwierzęta wolne od specyficznych patogenów (SPF). Wykorzystanie takich zwierząt może radykalnie zmniejszyć zachorowalność i śmiertelność z powodu patogennych organizmów, zwłaszcza Pasteurella multocida u królików.

Kozy lub konie są zwykle używane, gdy wymagane są duże ilości antysurowic. Wielu badaczy preferuje kurczaki ze względu na ich odległość filogenetyczną od ssaków. Kurczaki przenoszą duże ilości IgY (IgG) do żółtka jaja, a zbieranie przeciwciał z jaj eliminuje potrzebę inwazyjnego zabiegu krwawienia. Jednotygodniowe jaja mogą zawierać 10 razy więcej przeciwciał niż objętość krwi królika pobrana z jednego tygodniowego krwawienia. Istnieją jednak pewne wady stosowania niektórych przeciwciał pochodzących od kurcząt w testach immunologicznych. Kurcza IgY nie wiąże ssaczego składnika dopełniacza C1 i nie działa jako wytrącające przeciwciało przy użyciu standardowych roztworów.

Chociaż myszy są najczęściej wykorzystywane do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych, ich mały rozmiar zwykle uniemożliwia ich wykorzystanie do wystarczającej ilości przeciwciał poliklonalnych w surowicy. Jednak przeciwciała poliklonalne u myszy można zebrać z płynu puchlinowego przy użyciu dowolnej z wielu metodologii wytwarzania puchliny brzusznej.

W przypadku stosowania królików do pierwotnej immunizacji należy użyć młodych dorosłych zwierząt (2,5–3,0 kg lub 5,5–6,5 funta) ze względu na silną reakcję przeciwciał. Szczytowe działanie układu immunologicznego następuje w okresie dojrzewania, a pierwotne odpowiedzi na nowe antygeny zmniejszają się wraz z wiekiem. Generalnie preferowane są samice królików, ponieważ są one bardziej uległe i wykazują silniejszą odpowiedź immunologiczną niż samce. W przypadku wykorzystywania zwierząt niekrewniaczych należy użyć co najmniej dwóch zwierząt na antygen. Zasada ta zmniejsza potencjalną całkowitą niewydolność wynikającą z braku odpowiedzi na antygeny poszczególnych zwierząt.

Przygotowanie antygenu

Wielkość, zakres agregacji i względna natywność antygenów białkowych mogą dramatycznie wpłynąć na jakość i ilość wytwarzanego przeciwciała. Małe polipeptydy (<10 ku ) i antygeny niebiałkowe na ogół wymagają sprzężenia lub usieciowania z większymi, immunogennymi białkami nośnikowymi w celu zwiększenia immunogenności i dostarczenia epitopów komórek T. Ogólnie rzecz biorąc, im większe białko immunogenne, tym lepiej. Większe białka, nawet w mniejszych ilościach, zwykle skutkują lepszym zaangażowaniem komórek przetwarzających antygen prezentujących antygen w celu uzyskania zadowalającej odpowiedzi immunologicznej. Wstrzyknięcie rozpuszczalnych, niezgregowanych białek ma większe prawdopodobieństwo wywołania tolerancji niż zadowalającej odpowiedzi przeciwciał.

Hemocyjanina skałoczepa (KLH) i albumina surowicy bydlęcej to dwa szeroko stosowane białka nośnikowe. Poli-L-lizyna została również z powodzeniem wykorzystana jako szkielet dla peptydów. Chociaż stosowanie Poli-L-lizyny zmniejsza lub eliminuje wytwarzanie przeciwciał przeciwko obcym białkom, może skutkować niepowodzeniem wytwarzania przeciwciał indukowanego przez peptydy. Ostatnio liposomy są również z powodzeniem stosowane do dostarczania małych peptydów i ta technika jest alternatywą dla dostarczania z adiuwantami w postaci emulsji olejowych.

Ilość antygenu

Wybór ilości antygenu do immunizacji różni się w zależności od właściwości antygenu i wybranego adiuwantu. Ogólnie rzecz biorąc, mikrogramy do miligramów białka w adiuwancie są niezbędne do wywołania przeciwciał o wysokim mianie. Dawka antygenu jest ogólnie związana z gatunkiem, a nie z masą ciała. Tak zwane „okno” immunogenności u każdego gatunku jest szerokie, ale zbyt duża lub zbyt mała ilość antygenu może raczej wywołać tolerancję, supresję lub odchylenia immunologiczne w kierunku odporności komórkowej niż zadowalającą odpowiedź humoralną. Optymalne i zwykłe poziomy antygenów białkowych do immunizacji określonych gatunków podano w następujących zakresach:

  1. królik, 50–1000 µg;
  2. mysz, 10-50 µg;
  3. świnka morska, 50–500 µg; i
  4. koza, 250–5000 µg.

Podaje się, że optymalne dawki „podstawowe” znajdują się na dolnym końcu każdego zakresu.

Powinowactwo przeciwciał w surowicy wzrasta wraz z upływem czasu (miesiące) po wstrzyknięciu mieszanin antygen-adiuwant i wraz ze spadkiem antygenu w układzie. Powszechnie stosowane dawki antygenu do immunizacji „wspomagającej” lub wtórnej są zwykle o połowę równe dawkom podstawowym. Antygeny powinny być wolne od preparatów ubocznych i chemikaliów, takich jak żel poliakrylamidowy, SDS, mocznik, endotoksyny, cząstki stałe i skrajne pH.

Przeciwciała peptydowe

Kiedy peptyd jest używany do generowania przeciwciała, niezwykle ważne jest prawidłowe zaprojektowanie antygenów. Istnieje kilka zasobów, które mogą pomóc w projektowaniu, a także firmy oferujące tę usługę. Expasy zgromadził zestaw narzędzi publicznych na swojej stronie ProtScale, które wymagają pewnej wiedzy użytkownika, aby się poruszać. Dla prostszego narzędzia do oceny peptydów dostępne jest narzędzie Antigen Profiler , które umożliwi ocenę poszczególnych sekwencji peptydowych w oparciu o relacyjną bazę danych mapowania epitopów poprzednich immunogenów użytych do wygenerowania przeciwciał. Wreszcie, co do zasady, peptydy powinny spełniać kilka podstawowych kryteriów.

Podczas badania peptydów pod kątem syntezy i immunizacji zaleca się unikanie pewnych reszt i sekwencji ze względu na potencjalne problemy z syntezą. Obejmuje to niektóre z bardziej typowych cech:

  • Ekstremalnie długie powtórzenia tego samego aminokwasu (np. RRRR)
  • Dublety seryny (S), treoniny (T), alaniny (A) i waliny (V)
  • Zakończenie lub rozpoczęcie sekwencji proliną (P)
  • Glutamina (Q) lub asparagina (N) na końcu n
  • Peptydy przeciążone resztami hydrofobowymi (np. V, A, L, I, itd....)

Reaktywność

Badacze powinni również wziąć pod uwagę status natywnych antygenów białkowych stosowanych jako immunogeny i reakcję z wytworzonymi przeciwciałami. Przeciwciała na białka natywne najlepiej reagują z białkami natywnymi, a przeciwciała na białka zdenaturowane najlepiej reagują na białka zdenaturowane. Jeśli wywołane przeciwciała mają być użyte na blotach błonowych (białka poddane warunkom denaturującym), należy wytworzyć przeciwciała przeciwko zdenaturowanym białkom. Z drugiej strony, jeśli przeciwciała mają być stosowane do reagowania z białkiem natywnym lub blokowania miejsca aktywnego białka, należy wytworzyć przeciwciała przeciwko białku natywnemu. Adiuwanty mogą często zmieniać natywność białka. Ogólnie, zaabsorbowane antygeny białkowe we wstępnie uformowanym adiuwancie emulsyjnym typu olej w wodzie zachowują większą natywną strukturę białka niż te w emulsjach typu woda w oleju.

Aseptyka

Antygeny należy zawsze przygotowywać przy użyciu technik, które zapewniają, że są wolne od zanieczyszczenia mikrobiologicznego. Większość preparatów antygenów białkowych można wyjaławiać przez przepuszczenie przez filtr 0,22 μm. Ropnie septyczne często pojawiają się w miejscach inokulacji zwierząt, gdy stosuje się skażone preparaty. Może to skutkować niepowodzeniem immunizacji przeciwko docelowemu antygenowi.

Adiuwanty

Istnieje wiele dostępnych na rynku adiuwantów immunologicznych . Wybór konkretnych adiuwantów lub typów różni się w zależności od tego, czy mają być stosowane do badań i produkcji przeciwciał, czy do opracowywania szczepionek. Adiuwanty do stosowania w szczepionkach muszą jedynie wytwarzać przeciwciała ochronne i dobrą pamięć ogólnoustrojową, podczas gdy te do produkcji surowicy odpornościowej muszą szybko indukować przeciwciała o wysokim mianie i wysokiej awidności. Żaden pojedynczy adiuwant nie jest idealny do wszystkich celów i wszystkie mają zalety i wady. Stosowaniu adiuwanta na ogół towarzyszą niepożądane skutki uboczne o różnym nasileniu i czasie trwania. Badania nad nowymi adiuwantami koncentrują się na substancjach, które wykazują minimalną toksyczność przy zachowaniu maksymalnej immunostymulacji. Badacze powinni zawsze być świadomi potencjalnego bólu i stresu związanego ze stosowaniem adiuwanta u zwierząt laboratoryjnych.

Najczęściej stosowanymi adiuwantami do produkcji przeciwciał są Freund's, Alum, Ribi Adjuvant System i Titermax.

Adiuwanty Freunda

Istnieją dwa podstawowe typy adiuwantów Freunda: kompletny adiuwant Freunda (FCA) i niekompletny adiuwant Freunda (FIA). FCA to emulsja typu woda w oleju, która lokalizuje antygen na okres uwalniania do 6 miesięcy. Zawiera olej mineralny, surfaktant monooleinian mannidu i zabite termicznie Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium butyricum lub ich ekstrakty (w celu agregacji makrofagów w miejscu inokulacji). Ten silny adiuwant stymuluje zarówno odporność komórkową, jak i humoralną z preferencyjną indukcją przeciwciał przeciwko epitopom zdenaturowanych białek. Chociaż FCA był historycznie najszerzej stosowanym adiuwantem, jest jednym z bardziej toksycznych środków ze względu na niemetabolizowany olej mineralny i wywołuje reakcje ziarniniakowe. Jego użycie jest ograniczone do zwierząt laboratoryjnych i powinno być stosowane tylko ze słabymi antygenami. Nie należy go stosować więcej niż raz na jedno zwierzę, ponieważ wielokrotne wstrzyknięcia FCA mogą powodować ciężkie reakcje ogólnoustrojowe i osłabioną odpowiedź immunologiczną. Niekompletny Adjuwant Freunda ma taki sam skład jak FCA, ale nie zawiera prątków ani ich składników. FIA zwykle ogranicza się do dawek przypominających antygenu, ponieważ zwykle jest znacznie mniej skuteczny niż FCA w indukcji przeciwciałem pierwotnym. Adiuwanty Freunda są zwykle mieszane z równymi częściami preparatów antygenowych w celu wytworzenia trwałych emulsji.

System adiuwantowy Ribi

Adiuwanty Ribi są emulsjami typu olej w wodzie, w których antygeny są mieszane z małymi objętościami metabolizowanego oleju (skwalen), które są następnie emulgowane solą fizjologiczną zawierającą środek powierzchniowo czynny Polysorbate 80. System ten zawiera również rafinowane produkty prątków (czynnik sznurowy, szkielet ściany komórkowej) jako immunostymulanty i bakteryjny monofosforylolipid A. Dostępne są trzy różne gatunkowe preparaty układu adiuwantowego. Te adiuwanty oddziałują z błonami komórek odpornościowych, powodując indukcję cytokin, co zwiększa wychwyt, przetwarzanie i prezentację antygenu. Ten system adiuwantowy jest znacznie mniej toksyczny i słabszy niż FCA, ale ogólnie indukuje zadowalające ilości przeciwciał o wysokiej awidności przeciwko antygenom białkowym.

Titermax

Titermax reprezentuje nowszą generację adiuwantów, które są mniej toksyczne i nie zawierają materiałów pochodzenia biologicznego. Oparta jest na mieszaninach działających surfaktantów, liniowych, bloków lub łańcuchów niejonowych kopolimerów polioksypropylenu (POP) i polioksyetylenu (POE). Kopolimery te są mniej toksyczne niż wiele innych materiałów powierzchniowo czynnych i mają silne właściwości wspomagające, które sprzyjają chemotaksji, aktywacji dopełniacza i wytwarzaniu przeciwciał. Adiuwant Titermax tworzy mikrocząstkową emulsję typu woda w oleju z kopolimerem i metabolizowanym olejem skwalenowym. Kopolimer pokryty jest emulsją stabilizującą cząsteczki krzemionki, co pozwala na wprowadzenie dużej ilości szerokiej gamy materiałów antygenowych. Aktywny kopolimer adiuwantowy tworzy hydrofilowe powierzchnie, które aktywują dopełniacz, komórki odpornościowe i zwiększają ekspresję głównych cząsteczek zgodności tkankowej klasy II na makrofagach. Titermax prezentuje układowi odpornościowemu antygen w wysoce stężonej postaci, co często skutkuje mianami przeciwciał porównywalnymi lub wyższymi niż FCA.

Specol : Specol jest adiuwantem typu woda w oleju, wykonanym z oczyszczonego oleju mineralnego . Doniesiono, że indukuje odpowiedź immunologiczną porównywalną z adiuwantem Freunda u królików i innych zwierząt badawczych, wytwarzając jednocześnie mniej zmian histologicznych.

Zastosowania farmaceutyczne

Digoxin Immune Fab jest fragmentem wiążącym antygen przeciwciał poliklonalnych wytworzonych przeciwko pochodnej Digitalis jako hapten związany z białkiem i jest stosowany do odwracania zagrażającej życiu toksyczności digoksyny lub digitoksyny .

Immunoglobulina Rho(D) jest wytwarzana z zebranego osocza ludzkiego dostarczanego przez dawców Rh-ujemnych z przeciwciałami przeciwko antygenowi D. Jest on stosowany w celu zapewnienia biernego wiązania immunologicznego antygenu, zapobiegając aktywnej odpowiedzi immunologicznej matki, która może potencjalnie skutkować chorobą hemolityczną noworodka .

Rozrolimupab jest rekombinowanym ludzkim przeciwciałem poliklonalnym anty- RhD złożonym z 25 unikalnych przeciwciał IgG1 i jest stosowany w leczeniu immunologicznej plamicy małopłytkowej i zapobieganiu izoimmunizacji u kobiet w ciąży Rh-ujemnych .

REGN-COV2 ( Regeneron Pharmaceuticals ) - potencjalne leczenie osób z COVID-19 i zapobieganie zakażeniu koronawirusem SARS-CoV-2 .

Zalety

Zastosowanie przeciwciał poliklonalnych (PAb) w porównaniu z przeciwciałami monoklonalnymi ma swoje zalety. Umiejętności techniczne potrzebne do wytworzenia przeciwciał poliklonalnych nie są tak wymagające. Są niedrogie w produkcji i można je wygenerować dość szybko, a ich wyprodukowanie może zająć nawet kilka miesięcy. PAbs są heterogeniczne, co umożliwia im wiązanie się z szeroką gamą epitopów antygenowych. Ponieważ PAb są produkowane z dużej liczby klonów komórek B, istnieje większe prawdopodobieństwo, że z powodzeniem zwiążą się z określonym antygenem. PAb pozostają stabilne w różnych środowiskach, takich jak zmiana pH lub stężenie soli, co pozwala na ich większe zastosowanie w niektórych procedurach. Dodatkowo, w zależności od potrzebnej ilości, PAbs można wytwarzać w dużych ilościach w stosunku do wielkości użytego zwierzęcia.

Zobacz też

Bibliografia

Linki zewnętrzne