Kompleks przed replikacją - Pre-replication complex
Kompleks przed replikacją ( pre-RC ) to kompleks białkowy, który tworzy się w miejscu inicjacji replikacji na etapie inicjacji replikacji DNA . Utworzenie pre-RC jest wymagane, aby nastąpiła replikacja DNA. Pełna i wierna replikacja genomu gwarantuje, że każda komórka potomna będzie miała te same informacje genetyczne, co komórka rodzicielska. W związku z tym tworzenie się pre-RC jest bardzo ważną częścią cyklu komórkowego .
składniki
Gdy organizmy ewoluowały i stawały się coraz bardziej złożone, tak samo rozwijały się ich pre-RC. Poniżej znajduje się podsumowanie składników okresu sprzed RC w różnych dziedzinach życia.
U bakterii głównym składnikiem pre-RC jest DnaA . Pre-RC jest zakończone, gdy DnaA zajmuje wszystkie swoje miejsca wiązania w bakteryjnym miejscu inicjacji replikacji ( oriC ).
Archeowców pre-RC jest bardzo różni się od bakterii pre-RC i może służyć jako uproszczony model eukariotycznej pre-RC. Składa się z białka kompleksu rozpoznawania jednego miejsca pochodzenia (ORC), Cdc6 / ORC1 i homoheksameru białka podtrzymującego minichromosom (MCM). Sulfolobus islandicus wykorzystuje również homolog Cdt1 do rozpoznania jednego z miejsc jego replikacji.
Eukariotycznych wstępnie RC jest najbardziej skomplikowanym i silnie regulowanym wstępnie Rc. U większości eukariotów składa się z sześciu białek ORC (ORC1-6), Cdc6 , Cdt1 i heteroheksameru sześciu białek MCM (MCM2-7). Heteroheksamer MCM prawdopodobnie powstał w wyniku duplikacji genu MCM i późniejszej rozbieżnej ewolucji. Pre-RC Schizosaccharomyces pombe ( S. pombe ) różni się znacznie od innych eukariotów; Cdc6 zastąpiono homologicznym białkiem Cdc18. Sap1 jest również zawarty w S. pombe pre-RC, ponieważ jest wymagany do wiązania Cdc18. Pre-RC Xenopus laevis ( X. laevis ) ma również dodatkowe białko MCM9, które pomaga załadować heteroheksamer MCM na początek replikacji. Rozwiązano strukturę ORC, MCM, a także pośredniego kompleksu ORC-Cdc6-Cdt1-Mcm2-7 (OCCM).
Rozpoznanie źródła replikacji
Rozpoznanie początku replikacji jest krytycznym pierwszym krokiem w tworzeniu pre-RC. W różnych dziedzinach życia proces ten przebiega inaczej.
U prokariotów rozpoznanie pochodzenia jest wykonywane przez DnaA. DnaA wiąże się ściśle z konsensusową sekwencją 9-par zasad w oriC; 5 '- TTATCCACA - 3'. Istnieje 5 takich sekwencji 9-pz (R1-R5) i 4 sekwencje niezgodne (I1-I4) w obrębie oriC, w których DnaA wiąże się z różnym powinowactwem. DnaA wiąże R4, R1 i R2 z wysokim powinowactwem, a R5, I1, I2, I3 i R3 z mniejszym powinowactwem. Pre-RC jest zakończone, gdy DnaA zajmuje wszystkie miejsca wiązania 9 bp o wysokim i niskim powinowactwie.
Archaea mają od 1 do 3 początków replikacji. Początki to generalnie obszary bogate w AT, które różnią się w zależności od gatunku archeonów. Pojedyncze białko ORC archeonów rozpoznaje szlaki bogate w AT i wiąże DNA w sposób zależny od ATP.
Eukarionty mają zwykle wiele miejsc inicjacji replikacji; co najmniej jeden na chromosom. Saccharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae ) jest jedynym znanym eukariontem o określonej sekwencji inicjującej TTTTTATG / ATTTA / T. Ta sekwencja inicjacji jest rozpoznawana przez ORC1-5. Nie wiadomo, czy ORC6 wiąże DNA w S. cerevisiae . Sekwencje inicjacyjne u S. pombe i wyższych eukariontów nie są dobrze zdefiniowane. Jednak sekwencje inicjacyjne są na ogół albo bogate w AT, albo wykazują wygiętą lub zakrzywioną topologię DNA. Wiadomo, że białko ORC4 wiąże bogatą w AT część początku replikacji w S. pombe przy użyciu motywów haczyka AT. Mechanizm rozpoznawania pochodzenia u wyższych eukariontów nie jest dobrze poznany, ale uważa się, że wiązania białek ORC1-6 zależą od niezwykłej topologii DNA.
Ładowanie
Złożenie kompleksu przedreplikacyjnego następuje tylko w późnej fazie M i wczesnej fazie G1 cyklu komórkowego, gdy aktywność kinazy cyklinozależnej (CDK) jest niska. Ten czas i inne mechanizmy regulacyjne zapewniają, że replikacja DNA nastąpi tylko raz na cykl komórkowy. Montaż pre-RC polega na rozpoznaniu wcześniejszego pochodzenia, albo przez DnaA u prokariontów, albo przez ORC u archeonów i eukariontów.
Pre-RC prokariotów jest zakończone, gdy DnaA zajmuje wszystkie możliwe miejsca wiązania w oriC.
Pre-RC archeonów wymaga wiązania ORC pochodzenia. Następnie Cdc6 i kompleks homoheksameryczny MCM wiążą się sekwencyjnie.
Eukarionty mają najbardziej złożone pre-RC. Po związaniu ORC1-6 początku replikacji rekrutowany jest Cdc6. Cdc6 rekrutuje współczynnik licencji Cdt1 i MCM2-7. Wiązanie Cdt1 i hydroliza ATP przez ORC i Cdc6 ładują MCM2-7 do DNA. Istnieje stechiometryczny nadmiar białek MCM w stosunku do białek ORC i Cdc6, co wskazuje, że może istnieć wiele heteroheksamerów MCM związanych z każdym miejscem inicjacji replikacji.
Rozpoczęcie replikacji
Po utworzeniu pre-RC należy go aktywować i złożyć replisom, aby nastąpiła replikacja DNA.
U prokariotów DnaA hydrolizuje ATP w celu rozwinięcia DNA w oriC. Ten zdenaturowany region jest dostępny dla helikazy DnaB i modułu ładującego helikazę DnaC . Pojedyncze nici wiążące białka stabilizowania nowo utworzonej bańki do replikacji i interakcji z DnaG Primase . DnaG rekrutuje replikacyjną polimerazę DNA III i rozpoczyna się replikacja.
U eukariontów heteroheksamer MCM jest fosforylowany przez CDC7 i CDK, co wypiera Cdc6 i rekrutuje MCM10 . MCM10 współpracuje z MCM2-7 przy rekrutacji Cdc45 . Cdc45 następnie rekrutuje kluczowe komponenty replisomu ; replikacyjna polimeraza DNA α i jej prymaza. Następnie można rozpocząć replikację DNA.
Zapobieganie złożonemu ponownemu montażowi przed replikacją
Podczas każdego cyklu komórkowego ważne jest, aby genom był całkowicie replikowany tylko raz. Do replikacji genomu wymagane jest utworzenie kompleksu pre-replikacyjnego podczas późnej fazy M i wczesnej fazy G1, ale po replikacji genomu pre-RC nie może ponownie utworzyć się do następnego cyklu komórkowego. W S. cerevisiae, CDK zapobiegają tworzeniu się kompleksu replikacyjnego podczas późnych faz G1, S i G2 poprzez wykluczenie MCM2-7 i Cdt1 z jądra, celowanie w Cdc6 w celu degradacji przez proteasom i dysocjację ORC1-6 od chromatyny poprzez fosforylację . Zapobieganie ponownej replikacji u S. pombe jest nieco inne; Cdt1 ulega degradacji przez proteasom, a nie jest po prostu wykluczone z jądra. Proteolityczna regulacja Cdt1 jest wspólna dla wyższych eukariontów, w tym Caenorhabditis elegans , Drosophila melanogaster , X. laevis i ssaków . Metazoans mają czwarty mechanizm zapobiegania ponownej replikacji ; podczas S i G2 geminina wiąże się z Cdt1 i hamuje Cdt1 przed ładowaniem MCM2-7 na początek replikacji.
Zespół Meiera-Gorlina
Wiadomo, że defekty składników eukariotycznego kompleksu replikacyjnego powodują zespół Meiera-Gorlina , który charakteryzuje się karłowatością , brakiem lub hipoplastycznymi rzepkami , małymi uszami, upośledzonym wzrostem przed- i poporodowym oraz małogłowiem . Znane mutacje występują w genach ORC1 , ORC4 , ORC6 , CDT1 i CDC6 . Fenotyp choroby prawdopodobnie wywodzi się ze zmniejszonej zdolności komórek do proliferacji , co prowadzi do liczby komórek i ogólnego braku wzrostu.