Pseudomonas syringae -Pseudomonas syringae

Pseudomonas syringae
Pseudomonas syringae cultures.jpg
Kultury Pseudomonas syringae
Klasyfikacja naukowa edytować
Domena: Bakteria
Gromada: Proteobakterie
Klasa: Gammaproteobakterie
Zamówienie: Pseudomonadale
Rodzina: Pseudomonadaceae
Rodzaj: Pseudomonas
Grupa gatunkowa : Grupa Pseudomonas syringae
Gatunek:
P. syringae
Nazwa dwumianowa
Pseudomonas syringae
Van Hall, 1904
Wpisz szczep
ATCC 19310

CCUG 14279
CFBP 1392
CIP 106698
ICMP 3023
LMG 1247
NCAIM B.01398
NCPPB 281
NRRL B-1631

Patowars

P. s. pv. aceris
P. s. pv. aptata
P. s. pv. atrofaciens
P. s. pv. dysoksylis
P. s. pv. japonica
P. s. pv. lapsa
P. s. pv. panici
P. s. pv. papułki
P. s. pv. pisi
P. s. pv. syringae
P. s. pv. morsprunorum

Pseudomonas syringae to Gram-ujemna bakteria w kształcie pręcikaz wiciami polarnymi. Jako patogen roślin może infekować wiele gatunków i istnieje jako ponad 50 różnych patovarów , z których wszystkie są dostępne dla badaczy z międzynarodowych kolekcji kultur, takich jak NCPPB , ICMP i inne.

Pseudomonas syringae należy do rodzaju Pseudomonas i na podstawie analizy 16S rRNA został umieszczony w grupie P. syringae . Jego nazwa pochodzi od drzewa bzu ( Syringa vulgaris ), z którego po raz pierwszy została wyizolowana.

Analiza filogenomiczna 494 kompletnych genomów z całego rodzaju Pseudomonas wykazała, że P. syringae nie tworzy gatunku monofiletycznego w ścisłym tego słowa znaczeniu, ale szerszą grupę ewolucyjną obejmującą również inne gatunki, takie jak Pseudomonas avellanae, Pseudomonas savastanoi, Pseudomonas ciało migdałowate i Pseudomonas cerasi .

Pseudomonas syringae wykazują ujemny wynik na aktywność dihydrolazy argininowej i oksydazy i tworzą lewan polimerowy na agarze odżywczym z sacharozą . Wiele, ale nie wszystkie szczepy roślin wydzielają lipodepsinonapeptide toksynę syringomycin , a zawdzięcza swój wygląd żółty fluorescencyjny kiedy hodować in vitro na pożywce B Kinga do produkcji siderofory pyoverdin.

Pseudomonas syringae wytwarza również aktywne białka zarodkowania lodu (INA), które powodują zamarzanie wody (w roślinach) w dość wysokich temperaturach (od -1,8 do -3,8°C (28,8 do 25,2°F)), co powoduje obrażenia. Od lat siedemdziesiątych P. syringae odgrywa rolę atmosferycznego „biologicznego zarodka zarodkowania lodu”, przy czym bakterie znajdujące się w powietrzu służą jako jądra kondensacji chmur . Ostatnie dowody sugerują, że gatunek ten odgrywa większą rolę niż wcześniej sądzono w wytwarzaniu deszczu i śniegu . Zostały również znalezione w rdzeniach gradu, pomagając w bioprecypitacji. Te białka INA są również wykorzystywane do produkcji sztucznego śniegu .

Patogeneza Pseudomonas syringae zależy od białek efektorowych wydzielanych do komórki roślinnej przez układ wydzielniczy bakterii typu III . W P. syringae zidentyfikowano prawie 60 różnych rodzin efektorów typu III kodowanych przez geny chmielowe . Efektory typu III przyczyniają się do patogenezy głównie poprzez swoją rolę w hamowaniu obrony roślin . Dzięki wczesnej dostępności sekwencji genomu trzech szczepów P. syringae i zdolności wybranych szczepów do wywoływania choroby na dobrze scharakteryzowanych roślinach żywicielskich, w tym Arabidopsis thaliana , Nicotiana benthamiana i pomidorze , P. syringae stała się ważnym system modelowy do eksperymentalnej charakteryzacji dynamiki molekularnej oddziaływań roślina-patogen .

Bakteryjna plamka na pomidorze w północnej części stanu Nowy Jork
Liść pomidora zakażony drobinami bakteryjnymi

Historia

W 1961 roku Paul Hoppe z Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych badał grzyby kukurydziane , rozdrabniając zainfekowane liście każdego sezonu, a następnie aplikując proszek do testowania kukurydzy na kolejny sezon, aby śledzić chorobę. W tym roku nastąpił niespodziewany mróz, który pozostawił dziwne wyniki. Tylko rośliny zakażone chorym proszkiem doznały uszkodzeń mrozowych, pozostawiając zdrowe rośliny niezamarznięte. Zjawisko to wprawiało naukowców w zakłopotanie, dopóki doktorant Steven E. Lindow z University of Wisconsin-Madison z DC Arny i C. Upper nie znaleźli bakterii w proszku z suszonych liści na początku lat siedemdziesiątych. Steven E. Lindow , obecnie patolog roślin z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Berkeley , odkrył, że gdy ta konkretna bakteria została wprowadzona do roślin, gdzie pierwotnie nie występowała, rośliny stały się bardzo podatne na uszkodzenia spowodowane mrozem. Następnie zidentyfikował bakterię jako P. syringae , zbadał rolę P. syringae w zarodkowaniu lodu, aw 1977 odkrył zmutowany szczep ice-minus . Później odniósł sukces w wytwarzaniu szczepu ice-minus P. syringae również za pomocą technologii rekombinacji DNA.

Genomika

Na podstawie porównawczej analizy genomicznej i filogenomicznej 494 kompletnych genomów z całego rodzaju Pseudomonas , P. syringae nie tworzy gatunku monofiletycznego w ścisłym tego słowa znaczeniu, ale szerszą grupę ewolucyjną (łącznie 34 genomy, podzielone na 3 podgrupy), która obejmuje również inne gatunki. Proteom rdzeniowy grupy P. syringae składał się z 2944 białek, natomiast liczba białek i zawartość GC szczepów tej grupy wahała się odpowiednio od 4973–6026 (średnia 5465) i 58–59,3% (średnia 58,6%) .

Cykl chorobowy

Pseudomonas syringae zimują na zainfekowanych tkankach roślinnych, takich jak obszary martwicy lub gummosis (sączące się soki z ran na drzewie), ale mogą również zimować w zdrowo wyglądających tkankach roślinnych. Wiosną woda z deszczu lub z innych źródeł wymyje bakterie na liście/kwiaty, gdzie będą rosły i przetrwały przez całe lato. Jest to faza epifitowa cyklu życiowego P. syringae, w której rozmnaża się i rozprzestrzenia, ale nie powoduje choroby. Gdy dostanie się do rośliny przez szparki liściowe lub nekrotyczne plamy na liściach lub zdrewniałych tkankach, wtedy zaczyna się choroba. Patogen będzie wtedy wykorzystywał i rósł w przestrzeni międzykomórkowej, powodując plamy na liściach i raki. P. syringae może również przetrwać w temperaturach nieco poniżej zera. Te temperatury poniżej zera zwiększają nasilenie infekcji w drzewach takich jak wiśnia, morela i brzoskwinia.

Epidemiologia

Chorobom wywoływanym przez P. syringae sprzyjają wilgotne i chłodne warunki — optymalna temperatura dla choroby wynosi zwykle około 12–25 °C (54–77 °F), chociaż może się to różnić w zależności od zaangażowanego patowaru. Bakterie mają tendencję do przenoszenia się z nasion i są przenoszone między roślinami przez rozbryzgi deszczu.

Chociaż jest patogenem roślinnym, może również żyć jako saprotrof w filosferze, gdy warunki nie sprzyjają chorobie. Niektóre saprotroficzne szczepy P. syringae zostały użyte jako środki do zwalczania gnicia pożniwnego.

Mechanizmy patogeniczności

Mechanizmy patogeniczności P. syringae można podzielić na kilka kategorii: zdolność do inwazji na roślinę, zdolność do przezwyciężania odporności gospodarza, tworzenie biofilmu i wytwarzanie białek o właściwościach zarodkowania lodu.

Możliwość inwazji roślin

Planktonic P. syringae jest w stanie wniknąć do roślin za pomocą wici i pilusów, aby płynąć w kierunku docelowego żywiciela. Dostaje się do rośliny przez rany w naturalnych miejscach otwarcia, ponieważ nie jest w stanie przebić się przez ścianę komórkową rośliny. Przykładem tego jest współpraca z muchą eksploatującą liście Scaptomyza flava , która podczas składania jaj tworzy dziury w liściach, z których może skorzystać patogen. Rola taksówek u P. syringae nie została dobrze zbadana, ale uważa się, że bakterie wykorzystują sygnały chemiczne uwalniane przez roślinę, aby znaleźć swojego żywiciela i wywołać infekcję.

Pokonywanie oporu gospodarza

Efektory

Izolaty Pseudomonas syringae zawierają szereg czynników wirulencji zwanych białkami efektorowymi układu wydzielniczego typu III (T3SS) . Białka te działają przede wszystkim w celu wywoływania objawów choroby i manipulowania odpowiedzią immunologiczną gospodarza w celu ułatwienia infekcji. Główną rodziną efektorów T3SS u P. syringae jest klaster genów hrp , kodujący aparat wydzielania Hrp.

Efektory chmielowe

HopZ1 są efektorami typu III, które interferują z dehydratazą 2-hydroksyizoflawanonu Glycine max ( GmHID1 ). HopZ1b degraduje daidzeinę po wytworzeniu, zmniejszając jej stężenie, a tym samym zmniejszając odporność, jaką zapewnia roślinie.

Fitotoksyny

Patogeny wytwarzają również fitotoksyny, które uszkadzają roślinę i mogą tłumić układ odpornościowy gospodarza. Jednym z takich phytotoxin jest koronatyna , znalezionych w pathovars Pto i PGL .

Tworzenie biofilmu

Pseudomonas syringae wytwarza polisacharydy, które umożliwiają jej przyleganie do powierzchni komórek roślinnych. Uwalnia również cząsteczki quorum sensing , które pozwalają wyczuć obecność innych komórek bakteryjnych w pobliżu. Jeśli cząsteczki te przekroczą poziom progowy, bakterie zmieniają swój wzorzec ekspresji genów, tworząc biofilm i rozpoczynając ekspresję genów związanych z wirulencją. Bakterie wydzielają bardzo lepkie związki, takie jak polisacharydy i DNA, aby stworzyć ochronne środowisko do wzrostu.

Właściwości zarodkowania lodu

Pseudomonas syringae – bardziej niż jakikolwiek minerał czy inny organizm – jest odpowiedzialny za uszkodzenia powierzchni przez mróz u roślin wystawionych na działanie środowiska. W przypadku roślin bez białek przeciw zamarzaniu uszkodzenia spowodowane mrozem zwykle występują między -4 a -12 ° C (25 i 10 ° F), ponieważ woda w tkance roślinnej może pozostać w stanie przechłodzonej cieczy. P. syringae może powodować zamarzanie wody w temperaturach do -1,8 ° C (28,8 ° F), ale szczepy powodujące zarodkowanie lodu w niższych temperaturach (do -8 ° C (18 ° F)) są bardziej powszechne. Zamrożenie powoduje uszkodzenia nabłonka i udostępnia bakteriom składniki odżywcze w leżących poniżej tkankach roślinnych.

Pseudomonas syringae ma geny ina (aktywne zarodkowanie lodu), które wytwarzają białka INA, które przemieszczają się do zewnętrznej błony bakteryjnej na powierzchni bakterii, gdzie białka działają jako jądra tworzące lód. Sztuczne szczepy P. syringae znane jako bakterie ice-minus zostały stworzone w celu zmniejszenia szkód spowodowanych mrozem.

Pseudomonas syringae znaleziono w środku gradu, co sugeruje, że bakteria może odgrywać rolę w cyklu hydrologicznym Ziemi.

Kierownictwo

Obecnie nie ma 100% skutecznego sposobu na wyeliminowanie P. syringae z pola. Najczęstszym sposobem kontrolowania tego patogenu jest spryskiwanie środków bakteriobójczych związkami miedzi lub innych metali ciężkich, które można łączyć z fungicydami lub innymi chemikaliami do zwalczania szkodników. Zabiegi chemiczne z utrwaloną miedzią, taką jak Bordeaux , wodorotlenek miedzi i siarczan miedzi, są stosowane w celu powstrzymania rozprzestrzeniania się P. syringae poprzez zabijanie bakterii w fazie epifitu na liściach lub zdrewniałych częściach drzew - jednakże odporne P. syringae szczepy istnieją. Rozpylanie antybiotyków, takich jak streptomycyna i organiczne środki bakteriobójcze, to kolejny sposób zwalczania P. syringae, ale jest on mniej powszechny niż metody wymienione powyżej.  

Nowe badania wykazały, że dodanie pożywienia amonowego (NH 4 + ) do roślin pomidora może spowodować zmianę metaboliczną prowadzącą do odporności na Pseudomonas syringae. Ten „syndrom amonowy” powoduje zaburzenia równowagi składników odżywczych w roślinie, a zatem wyzwala odpowiedź obronną przeciwko patogenowi.

Udowodniono, że ścisłe praktyki higieniczne stosowane w sadach wraz z przycinaniem wczesną wiosną i latem zwiększają odporność drzew na P. syringae. Raki kauteryzujące znalezione na drzewach sadowniczych mogą uratować życie drzew, powstrzymując rozprzestrzenianie się infekcji.

Hodowla roślin pod kątem odporności to kolejny dość skuteczny sposób na uniknięcie P. syringae. Odniósł sukces w podkładce czereśni z Pseudomonas syringae pv. syringae , ale jak dotąd żaden inny gatunek nie jest w 100% odporny na ten patogen. Hodowla odpornościowa jest procesem powolnym, zwłaszcza u drzew. Niestety bakterie P. syringae potrafią przystosować się genetycznie do infekowania odpornych roślin, a proces hodowli odporności musi rozpocząć się od nowa.

Leczenie skojarzone bakteriofagów i karwakrolu daje nadzieję na kontrolę zarówno form planktonowych, jak i biofilmu .

Patowars

Po analizie rybotypu zaproponowano włączenie kilku patowarów P. syringae do innych gatunków ( patrz P. amygdali , P. tomato , P. coronafaciens , P. avellanae , 'P. helianthi ' , P. tremae , P. cannabina . , i P. viridiflava ). Zgodnie z tym schematem pozostałe patowary to:

Jednak wiele szczepów, dla których zaproponowano nowe zgrupowania gatunków, nadal jest określanych w literaturze naukowej jako patowary P. syringae , w tym patowary pomidora , Phaseolicola i maculicola . Pseudomonas savastanoi był kiedyś uważany za patowar lub podgatunek P. syringae i w wielu miejscach nadal określany jest jako P. s. pv. savastanoi , chociaż w wyniku badań pokrewieństwa DNA, został wprowadzony jako nowy gatunek. Ma trzy specyficzne dla gospodarza patowary: P. s. fraxini (która powoduje raka jesionowego ), P. s. nerii (który atakuje oleander ) i P. s. oleae (co powoduje sęk oliwny ).

Determinanty specyficzności gospodarza

Uważa się, że połączenie genów efektorowych patogenu i genów odporności rośliny określa, który gatunek może zainfekować dany patowar. Rośliny mogą rozwinąć odporność na patovar, rozpoznając wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP) i wywołując odpowiedź immunologiczną. Te PAMP są niezbędne do funkcjonowania drobnoustroju, więc nie można ich zgubić, ale patogen może znaleźć sposób na stłumienie tej odpowiedzi immunologicznej, prowadząc do ewolucyjnego wyścigu zbrojeń między patogenem a gospodarzem.

Pseudomonas syringae jako układ modelowy

Dzięki wczesnej dostępności sekwencji genomu dla P. syringae pv, szczepu pomidora DC3000, P. syringae pv. syringae szczep B728a i P. syringae pv. szczep phaseolicola 1448A, wraz ze zdolnością wybranych szczepów do wywoływania choroby na dobrze scharakteryzowanych roślinach żywicielskich, takich jak Arabidopsis thaliana , Nicotiana benthamiana i pomidor, P. syringae, stał się ważnym układem modelowym do eksperymentalnej charakterystyki dynamiki molekularnej interakcje roślina-patogen . System doświadczalny P. syringae był źródłem pionierskich dowodów na ważną rolę produktów genów patogenów w tłumieniu obrony roślin. System nomenklatury opracowany dla efektorów P. syringae został zaadoptowany przez badaczy charakteryzujących repertuary efektorowe innych bakterii, a metody stosowane do bioinformatycznej identyfikacji efektorów zostały zaadaptowane dla innych organizmów. Ponadto badacze pracujący z P. syringae odegrali integralną rolę w grupie roboczej Plant-Associated Microbe Gene Ontology, której celem było opracowanie terminów ontologii genów, które wychwytują procesy biologiczne zachodzące podczas interakcji między organizmami, oraz wykorzystanie terminów do adnotacji genu produkty.

Pseudomonas syringae pv. szczep pomidora DC3000 i Arabidopsis thaliana

Jak wspomniano powyżej, genom P. syringae pv. pomidor DC3000 został zsekwencjonowany i około 40 chmielu (białko Hrp zewnętrzna) efektory - chorobotwórczych białek tłumienia komórek gospodarza - zostały zidentyfikowane. Tych 40 efektorów nie jest rozpoznawanych przez A. thaliana, co sprawia, że P. syringae pv. pomidor DC3000 zjadliwy przeciwko niemu - czyli P. syringae pv. pomidor DC3000 jest w stanie zarażać A. thaliana - tym samym A. thaliana jest podatny na ten patogen.

Wiele zależności między genami zostało zidentyfikowanych przy użyciu dwóch organizmów modelowych, P. syringae pv. szczep pomidora DC3000 i Arabidopsis . Relacja gen za gen opisuje rozpoznawanie genów patogennej awirulencji ( avr ) przez geny odporności gospodarza ( geny R). P. syringae pv. pomidor DC3000 jest użytecznym narzędziem do badania avr wzajemne oddziaływanie genu R w A. thaliana , ponieważ może on być przekształcony w avr genów z innych patogenów bakteryjnych, a ponadto, ponieważ żaden z endogennych chmielu genów rozpoznawane przez A. thaliana , każdy obserwowana Rozpoznanie avr zidentyfikowane za pomocą tego modelu można przypisać rozpoznaniu wprowadzonego avr przez A. thaliana . Transformacja pomidora P. syringae DC3000 z efektorami z innych patogenów doprowadziła do identyfikacji wielu genów R u Arabidopsis w celu dalszego poszerzenia wiedzy na temat interakcji patogenów roślinnych .

Przykłady genów avr w genach R P. syringae DC3000 i A. thaliana, które je rozpoznają
Avr gen A. thaliana R-gen
AvrB RPM1
ŚrRpm1 RPM1
ŚrRpt2 RPS2
AvrRps4 RPS4
AvrRps6 RPS6
ŚrPphB RPS5/ ODPORNOŚĆ NA PSEUDOMONAS SYRINGAE 5 (patrz również Arabidopsis thaliana § RPS5 )

Dynaminy związane białko 2b / drp2b genu A. thaliana nie jest bezpośrednio gen odporności, lecz pomaga ruch materiału zewnętrznego do sieci wewnątrzkomórkowego pośrednio związane, a niektóre mutanty zwiększenia wrażliwości.

Pseudomonas syringae pv. szczep pomidora DC3000, jego pochodne i gospodarz pomidora

Jak sama nazwa wskazuje, P. syringae pv. pomidor DC3000 ( Pst DC3000) jest zjadliwy dla pomidora ( Solanum lycopersicum ). Jednak odmiana pomidora Rio Grande-PtoR (RG-PtoR), niosąca gen odporności Pto , rozpoznaje kluczowe efektory wydzielane przez Pst DC3000, czyniąc go odpornym na bakterie. Badanie interakcji między liniami pomidorów, w których zachodzi ekspresja Pto , a Pst DC3000 i jego patowarami jest potężnym systemem do zrozumienia interakcji między roślinami a mikroorganizmami.

Podobnie jak inne rośliny, pomidor ma dwupoziomowy system obrony przed patogenami. Pierwsza i bardziej uniwersalna linia obrony roślin, odporność wyzwalana przez wzorce (PTI) , jest aktywowana, gdy receptory rozpoznające wzorce roślinne (PRR) na powierzchni komórki wiążą się z wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP) . Inna gałąź odporności roślin, odporność wywołana efektorem (ETI) , jest wyzwalana, gdy wewnątrzkomórkowe (miejsce wiązania nukleotydów, powtórzenia bogate w leucynę) białka NB-LRR wiążą się z efektorem, cząsteczką specyficzną dla konkretnego patogenu. ETI jest na ogół cięższe niż PTI, a po osiągnięciu progu aktywacji obronnej może wywołać reakcję nadwrażliwości (HR) , która jest celową śmiercią tkanki gospodarza w celu zapobieżenia rozprzestrzenianiu się infekcji. Dwoma kluczowymi efektorami wydzielanymi przez Pst DC3000 są AvrPto i AvrPtoB, które inicjują ETI poprzez wiązanie kompleksu receptora Pto/Prf w liniach pomidora z ekspresją Pto , takich jak RG-PtoR.

Pst DC3000 został zmodyfikowany w celu wytworzenia zmutowanego szczepu Pst DC3000 ∆avrPto∆avrPtoB ( Pst DC3000∆∆), który nie wyraża ani AvrPto ani AvrPtoB. Przy zakażeniu RG-PtoR Pst DC3000∆∆, ETI patogenu nie jest wyzwalane z powodu braku głównych efektorów rozpoznawanych przez kompleks Pto/Prf. W laboratorium jest to bardzo cenne, ponieważ użycie Pst DC3000∆∆ umożliwia naukowcom badanie funkcji genów kandydujących do PTI w RG-PtoR, które w przeciwnym razie byłyby maskowane przez ETI.

Inną przydatną pochodną DC3000 jest Pst DC3000 ∆avrPto∆avrPtoB∆fliC ( Pst DC3000∆∆∆). Podobnie jak Pst DC3000∆∆, ten szczep nie eksprymuje AvrPto i AvrPtoB, ale ma również dodatkowy nokaut dla fliC , genu kodującego flagellinę , którego fragmenty służą jako główne PAMP wymagane dla PTI pomidora. Porównując rośliny z tej samej linii, które zostały zakażone Pst DC3000∆∆ lub Pst DC3000∆∆∆, naukowcy mogą określić, czy geny będące przedmiotem zainteresowania są ważne dla szlaku rozpoznawania flageliny w PTI.

Traktowanie mutantów z nokautem pomidora indukowanych przez CRISPR (w tle RG-PtoR) za pomocą Pst DC3000, Pst DC3000 ∆avrPto∆avrPtoB lub Pst DC3000 ∆avrPto∆avrPtoB∆fliC doprowadziło do scharakteryzowania kluczowych składników układu odpornościowego pomidora i jest nadal wykorzystywany do dalszego rozwoju patologii pomidorów.

Znaczenie

Pseudomonas syringae swoimi różnymi patowarami wpłynął na wiele gałęzi przemysłu uprawnego i sadowniczego.

P. s. pv. aktynowce

Mesarich wsp 2017 zawiera kilka bibliotek dla transpozonu wstawiania sekwencjonowania z mutantów z P. sa

Przemysł owoców kiwi w Nowej Zelandii poniósł katastrofalne straty od czasu pierwszego znanego wybuchu epidemii w 2007 r. spowodowanego przez P. syringae pv. aktynowce . Nowa Zelandia zajmuje drugie miejsce po Włoszech pod względem całkowitego eksportu kiwi, osiągając roczny przychód w wysokości 1 miliarda dolarów nowozelandzkich, co czyni ją najbardziej wartościowym ekonomicznie eksportem w kraju. W 2014 r. utrata samego eksportu wyniosła aż 930 mln NZ. Hodowcy musieli płacić za zabiegi i usuwanie zainfekowanych winorośli, a także cierpieć z powodu utraty wartości kapitałowej w swoich sadach. Dla niektórych wartość sadów wzrosła z 450 000 NZ $/ha do 70 000 $/ha po wybuchu epidemii, co jest ceną gołej ziemi. Całkowita utrata kapitału przez kraj Nowej Zelandii wyniosła aż 2 miliardy NZ$.

W latach 2010-2012 ponad 2000 hektarów (4900 akrów) włoskich sadów kiwi zostało zabitych przez P. syringae pv. actinidiae lub zostały zabite w celu powstrzymania choroby. Konsekwencje finansowe dla plantatorów i ich dostawców były dotkliwe, podobnie jak konsekwencje ekonomiczne w szerszym zakresie.

Zobacz też

Bibliografia

Zewnętrzne linki