Tandemowa spektrometria masowa - Tandem mass spectrometry

Kwadrupolowy time-of-flight spektrometr masowy hybrydowy tandem.

Tandemowa spektrometria mas , znana również jako MS/MS lub MS ² , to technika analizy instrumentalnej, w której dwa lub więcej analizatorów mas jest łączonych ze sobą za pomocą dodatkowego etapu reakcji w celu zwiększenia ich zdolności do analizy próbek chemicznych. Powszechnym zastosowaniem tandemowego MS jest analiza biomolekuł , takich jak białka i peptydy .

Te cząsteczki z danej próbki zjonizowany i pierwszy spektrometr (oznaczony MS1 ) oddziela tych jonów przez ich stosunku masa-do-ładunku (często podane jako m / z lub m / Q). Jony o określonym stosunku m/z pochodzące z MS1 są wybierane, a następnie rozdzielane na mniejsze jony fragmentacyjne , np. przez dysocjację indukowaną zderzeniem , reakcję jon-cząsteczka lub fotodysocjację . Fragmenty te są następnie wprowadzane do drugiego spektrometru masowego ( MS2 ), który z kolei oddziela fragmenty według ich stosunku m/z i wykrywa je. Etap fragmentacji umożliwia identyfikację i oddzielenie jonów, które mają bardzo podobne stosunki m/z w zwykłych spektrometrach masowych.

Struktura

Tandemowa spektrometria mas obejmuje potrójny kwadrupolowy spektrometr masowy (QqQ), wielosektorowy spektrometr masowy , kwadrupolowy spektrometr masowy (Q-TOF) i hybrydowy spektrometr masowy.

Potrójny kwadrupolowy spektrometr mas

Potrójne kwadrupolowe spektrometry masowe wykorzystują pierwszy i trzeci kwadrupol jako filtry masowe. Kiedy anality przechodzą przez drugi kwadrupol, fragmentacja przebiega poprzez zderzenie z gazem.

Kwadrupol – czas lotu (Q-TOF)

Spektrometr mas Q-TOF łączy w sobie instrumenty TOF i kwadrupolowe, które zapewniają wysoką dokładność masową jonów produktu, możliwość dokładnej oceny ilościowej i zastosowanie eksperymentu fragmentacji. Jest to metoda spektrometrii masowej, w której stosunek fragmentacji jonów ( m / z ) jest określany poprzez pomiar czasu lotu.

Hybrydowy spektrometr mas

Hybrydowy spektrometr mas składa się z więcej niż dwóch analizatorów mas.

Oprzyrządowanie

Schemat tandemowej spektrometrii masowej

Wiele etapów rozdziału analizy mas można osiągnąć za pomocą pojedynczych elementów spektrometru mas rozdzielonych w przestrzeni lub za pomocą pojedynczego spektrometru masowego z etapami MS rozdzielonymi w czasie. W przypadku tandemowej spektrometrii mas w kosmosie różne elementy są często zapisywane w skrócie, podając rodzaj użytego selektora masy .

Tandem w kosmosie

Schemat potrójnego kwadrupola; i przykład tandemowej spektrometrii mas w kosmosie

W tandemowej spektrometrii mas w przestrzeni elementy rozdzielające są fizycznie oddzielone i odrębne, chociaż istnieje fizyczne połączenie między elementami w celu utrzymania wysokiej próżni . Elementami tymi mogą być sektory , kwadrupol transmisji lub czas przelotu. W przypadku stosowania wielu kwadrupoli mogą one działać zarówno jako analizatory masy, jak i komory kolizyjne.

Powszechną notacją dla analizatorów masy jest Q – kwadrupolowy analizator masy; q – kwadrupol kolizji częstotliwości radiowych ; TOF – analizator masy czasu przelotu ; B – sektor magnetyczny, a E – sektor elektryczny. Zapis można łączyć, aby wskazać różne instrumenty hybrydowe, na przykład QqQ' – potrójny kwadrupolowy spektrometr masowy ; QTOF – kwadrupolowy spektrometr masowy czasu przelotu (również QqTOF ); oraz BEBE – czterosektorowy (odwrócona geometria) spektrometr mas.

Tandem w czasie

Spektrometr masowy z pułapką jonową jest przykładem tandemowej spektrometrii masowej w czasie.

Wykonując tandemową spektrometrię mas w czasie , separacja odbywa się za pomocą jonów uwięzionych w tym samym miejscu, a wiele etapów separacji odbywa się w czasie. Pułapka jonowa kwadrupolowy lub transformaty Fouriera jonowego rezonansu cyklotronowego (FTICR) urządzenie może być wykorzystywane do takiej analizy. Przyrządy pułapkujące mogą wykonywać wiele etapów analizy, co jest czasami określane jako MS ⁿ (od MS do n ). Często liczba kroków, n , nie jest wskazana, ale czasami określana jest wartość; na przykład MS ³ wskazuje trzy etapy separacji. Tandem w czasie Przyrządy MS nie używają trybów opisanych dalej, ale zazwyczaj zbierają wszystkie informacje ze skanowania jonów prekursorowych i skanowania jonów macierzystych całego widma. Każda konfiguracja instrumentalna wykorzystuje unikalny tryb identyfikacji masy.

Tandem w kosmicznych trybach MS/MS

Gdy tandem MS jest wykonywany w projekcie w przestrzeni, instrument musi działać w jednym z wielu trybów. Istnieje wiele różnych eksperymentalnych konfiguracji tandemowych MS/MS, a każdy tryb ma swoje własne aplikacje i dostarcza różne informacje. Tandem MS w przestrzeni wykorzystuje sprzężenie dwóch elementów przyrządu, które mierzą ten sam zakres widma masowego, ale z kontrolowanym frakcjonowaniem między nimi w przestrzeni, podczas gdy tandem MS w czasie wykorzystuje pułapkę jonową .

Możliwe są cztery główne eksperymenty skanowania przy użyciu MS/MS: skanowanie jonów prekursorowych, skanowanie jonów potomnych, skanowanie strat obojętnych i monitorowanie wybranych reakcji.

W przypadku skanowania jonów prekursorowych, jon potomny jest wybierany w drugim analizatorze mas, a masy prekursorowe są skanowane w pierwszym analizatorze mas. Zauważ, że jon prekursorowy jest synonimem jonu macierzystego, a jon potomny z jonem potomnym; jednak odradza się stosowanie tych antropomorficznych terminów.

W skanowaniu jonów potomnych w pierwszym etapie wybierany jest jon prekursorowy, który ulega fragmentacji, a następnie wszystkie powstałe masy są skanowane w drugim analizatorze mas i wykrywane w detektorze umieszczonym za drugim analizatorem mas. Ten eksperyment jest powszechnie wykonywany w celu identyfikacji przejść wykorzystywanych do oceny ilościowej przez tandemowe MS.

W skanowaniu strat neutralnych pierwszy analizator mas skanuje wszystkie masy. Drugi analizator mas również skanuje, ale z ustawionym przesunięciem względem pierwszego analizatora masy. To przesunięcie odpowiada obojętnej utracie, która jest powszechnie obserwowana dla klasy związków. W skanowaniu ze stałą stratą neutralną monitorowane są wszystkie prekursory, które ulegają utracie określonego wspólnego neutralnego. Aby uzyskać te informacje, oba analizatory masy są skanowane jednocześnie, ale z przesunięciem masy, które koreluje z masą określonego neutralnego. Podobnie jak w przypadku skanowania jonów prekursorowych, technika ta jest również użyteczna w selektywnej identyfikacji blisko spokrewnionych klas związków w mieszaninie.

W monitorowaniu wybranych reakcji oba analizatory masy są ustawione na wybraną masę. Ten tryb jest analogiczny do monitorowania wybranych jonów w eksperymentach MS. Tryb analizy selektywnej, który może zwiększyć czułość.

Podział

Fragmentacja jonów fazy gazowej jest niezbędna w tandemowej spektrometrii mas i zachodzi między różnymi etapami analizy mas. Istnieje wiele metod fragmentacji jonów, które mogą skutkować różnymi rodzajami fragmentacji, a tym samym różnymi informacjami o strukturze i składzie cząsteczki.

Fragmentacja w źródle

Często proces jonizacji jest wystarczająco gwałtowny, aby powstałe jony miały wystarczającą energię wewnętrzną do rozdrobnienia w spektrometrze mas. Jeśli jony potomne utrzymują się w stanie nierównowagi przez umiarkowaną ilość czasu przed autodysocjacją, proces ten nazywa się fragmentacją metastabilną . Fragmentacja dyszowo-skimmerowa odnosi się do celowego wywoływania fragmentacji w źródle poprzez zwiększenie potencjału dyszowo-skimerowego w instrumentach zwykle opartych na elektrorozpylaniu . Chociaż fragmentacja w źródle umożliwia analizę fragmentacji, technicznie nie jest to tandemowa spektrometria masowa, chyba że jony metastabilne są analizowane masowo lub wybierane przed autodysocjacją, a na powstałych fragmentach przeprowadza się drugi etap analizy. Fragmentację w źródle można zastosować zamiast tandemowej spektrometrii mas dzięki wykorzystaniu technologii Enhanced in-Source Fragmentation Annotation (EISA), która generuje fragmentację, która bezpośrednio pasuje do danych tandemowej spektrometrii masowej. Fragmenty obserwowane przez EISA mają większą intensywność sygnału niż tradycyjne fragmenty, które ponoszą straty w komórkach zderzeniowych tandemowych spektrometrów masowych. EISA umożliwia akwizycję danych fragmentacji na analizatorach masy MS1, takich jak analizatory czasu przelotu i instrumenty z pojedynczym kwadrupolem. Fragmentacja w źródle jest często stosowana oprócz tandemowej spektrometrii mas (z fragmentacją po źródle), aby umożliwić dwa etapy fragmentacji w eksperymencie typu pseudo MS ³ .

Dysocjacja wywołana kolizją

Fragmentacja post-źródłowa jest najczęściej wykorzystywana w eksperymencie tandemowej spektrometrii masowej. Energię można również dodać do jonów, które zwykle są już wzbudzone wibracyjnie, poprzez zderzenia poźródłowe z neutralnymi atomami lub cząsteczkami, absorpcję promieniowania lub przenoszenie lub wychwytywanie elektronu przez wielokrotnie naładowany jon. Dysocjacja indukowana kolizjami (CID), zwana również dysocjacją aktywowaną kolizyjną (CAD), obejmuje zderzenie jonu z neutralnym atomem lub cząsteczką w fazie gazowej, a następnie dysocjację jonu. Rozważmy na przykład

${\ Displaystyle {\ ce {{AB+}+ M -> {A}+ {B+}+ M}}}$

gdzie jon AB ⁺ zderza się z neutralnym gatunkiem M, a następnie rozpada się. Szczegóły tego procesu opisuje teoria zderzeń . Ze względu na różne konfiguracje instrumentalne możliwe są dwa główne typy CID: (i) typu wiązkowego (w którym jony prekursorowe są fragmentowane w locie) oraz (ii) typu pułapki jonowej (w której jony prekursorowe są najpierw wyłapywane , a następnie pofragmentowane).

Trzecim i nowszym typem fragmentacji CID jest dysocjacja kolizyjna o wyższej energii (HCD). HCD to technika CID specyficzna dla spektrometrów masowych typu orbitrap, w której fragmentacja ma miejsce na zewnątrz pułapki jonowej, dzieje się to w komórce HCD (w niektórych instrumentach określanych jako „multipol routingu jonów”). HCD to fragmentacja typu pułapkowego, która, jak wykazano, ma właściwości typu wiązki. Istnieją ogólnodostępne, wielkoskalowe bazy danych tandemowej spektrometrii masowej o wysokiej rozdzielczości (np. METLIN z 850 000 wzorców molekularnych każdy z eksperymentalnymi danymi MS/MS CID) i są one zazwyczaj wykorzystywane do ułatwienia identyfikacji małych cząsteczek.

Metody wychwytywania i przenoszenia elektronów

Energia uwalniana, gdy elektron jest przenoszony lub przechwytywany przez wielokrotnie naładowany jon, może wywołać fragmentację.

Dysocjacja wychwytywania elektronów

Jeśli elektron zostanie dodany do wielokrotnie naładowanego jonu dodatniego, uwolniona zostanie energia kulombowska . Dodanie wolnego elektronu nazywa się dysocjacją wychwytywania elektronu (ECD) i jest reprezentowane przez

${\ Displaystyle [{\ ce {M}} + n {\ ce {H}}] ^ {n +} + {\ ce {e ^ {-} ->}} \ lewo [[{\ ce {M}} +(n-1){\ce {H}}]^{(n-1)+}\right]^{*}{\ce {->fragmenty}}}$

dla wielokrotnie protonowanej cząsteczki M.

Dysocjacja przeniesienia elektronu

Dodanie elektronu w reakcji jonowo-jonowej nazywa się dysocjacją z przeniesieniem elektronu (ETD). Podobnie do dysocjacji z wychwytem elektronów, ETD indukuje fragmentację kationów (np. peptydów lub białek ) poprzez przenoszenie do nich elektronów . Został wynaleziony przez Donalda F. Hunta , Joshua Coona , Johna EP Syka i Jarroda Marto z University of Virginia .

ETD nie wykorzystuje wolnych elektronów, ale wykorzystuje do tego celu aniony rodnikowe (np. antracen lub azobenzen ):

${\ Displaystyle [{\ ce {M}} + n {\ ce {H}}] ^ {n +} + {\ ce {A ^ {-} ->}} \ lewo [[{\ ce {M}} +(n-1){\ce {H}}]^{(n-1)+}\right]^{*}+{\ce {A->fragmenty}}}$

gdzie A jest anionem.

ETD rozcina losowo wzdłuż szkieletu peptydowego (jony c i z), podczas gdy łańcuchy boczne i modyfikacje, takie jak fosforylacja, pozostają nienaruszone. Technika działa dobrze tylko w przypadku jonów o wyższym ładunku (z>2), jednak w odniesieniu do dysocjacji indukowanej kolizjami (CID), ETD jest korzystna dla fragmentacji dłuższych peptydów lub nawet całych białek. To sprawia, że ​​technika jest ważna dla odgórnej proteomiki . Podobnie jak ECD, ETD jest skuteczny w przypadku peptydów z modyfikacjami, takimi jak fosforylacja.

Przeniesienie elektronów i dysocjacja kolizji wyższych energii (EThcD) to połączenie ETD i HCD, w którym prekursor peptydowy jest początkowo poddawany reakcji jon/jon z anionami fluorantenu w liniowej pułapce jonowej , która generuje jony c i z. W drugim etapie fragmentacja wszystkich jonów HCD jest stosowana do wszystkich jonów pochodzących z ETD w celu wygenerowania jonów b- i y- przed ostateczną analizą w analizatorze orbitrap. Metoda ta wykorzystuje podwójną fragmentację do generowania bogatych w jony, a zatem bogatych w dane widm MS/MS do sekwencjonowania peptydów i lokalizacji PTM .

Ujemna dysocjacja przeniesienia elektronu

Fragmentacja może również wystąpić w przypadku zdeprotonowanych form, w których elektron jest przenoszony z formy do odczynnika kationowego w dysocjacji ujemnego przeniesienia elektronu (NETD):

${\ Displaystyle [{\ ce {M}} -n {\ ce {H}}] ^ {n-} + {\ ce {A +->}} \ lewo [[{\ ce {M}} - n { \ce {H}}]^{(n+1)-}\right]^{*}+{\ce {A->fragmenty}}}$

Po tym transferze anion z niedoborem elektronów ulega wewnętrznej rearanżacji i fragmentacji . NETD jest jonowo-jonowym analogiem dysocjacji oderwania elektronów (EDD).

NETD jest kompatybilny z fragmentującym peptydem i białkami wzdłuż szkieletu przy wiązaniu _Cα- C. Powstałe fragmenty to zazwyczaj jony produktowe typu ^• i x.

Dysocjacja oderwania elektronów

Dysocjacja oderwania elektronów (EDD) to metoda fragmentacji związków anionowych w spektrometrii masowej. Służy jako tryb licznika ujemnego do dysocjacji wychwytywania elektronów. Jony naładowane ujemnie są aktywowane przez napromieniowanie elektronami o umiarkowanej energii kinetycznej. Rezultatem jest wyrzucenie elektronów z macierzystej cząsteczki jonowej , co powoduje dysocjację poprzez rekombinację.

Dysocjacja z przeniesieniem ładunku

Reakcja między dodatnio naładowanymi peptydami a odczynnikami kationowymi, znana również jako dysocjacja przeniesienia ładunku (CTD), została niedawno wykazana jako alternatywny szlak fragmentacji o wysokiej energii dla peptydów o niskim ładunku (1+ lub 2+). Proponowany mechanizm CTD z wykorzystaniem kationów helu jako odczynnika to:

${\ Displaystyle {\ ce {{[{M} + H] ^ {1}+} + He + ->}} \ lewo [{\ ce {[{M} + H] ^ {2} +}} \ prawej ]^{*}+{\ce {He^{0}->fragmenty}}}$

Wstępne doniesienia na to, że powoduje CTD szkielet C _α rozszczepienie wiązania C peptydów i zapewnia ^• - i jony produktów typu X.

Fotodysocjacja

Energia wymagana do dysocjacji może być dodana przez absorpcję fotonów , co powoduje fotodysocjację jonów i reprezentowane przez

${\displaystyle {\ce {{AB+}+{\mathit {h\nu}}-> {A}+B+}}}$

gdzie reprezentuje foton pochłonięty przez jon. Można stosować lasery ultrafioletowe, ale mogą one prowadzić do nadmiernej fragmentacji biomolekuł. ${\displaystyle h\nu}$

Dysocjacja multifotonowa w podczerwieni

Fotony podczerwone ogrzewają jony i powodują dysocjację, jeśli zostanie zaabsorbowana wystarczająca ich ilość. Proces ten nazywa się dysocjacją wielofotonową w podczerwieni (IRMPD) i jest często realizowany za pomocą lasera dwutlenku węgla i spektrometru masowego z wychwytywaniem jonów, takiego jak FTMS .

Dysocjacja radiacyjna ciała doskonale czarnego

Promieniowanie ciała doskonale czarnego można wykorzystać do fotodysocjacji w technice znanej jako dysocjacja promienista ciała doskonale czarnego (BIRD). W metodzie BIRD cała komora próżniowa spektrometru mas jest podgrzewana w celu wytworzenia światła podczerwonego . BIRD wykorzystuje to promieniowanie do wzbudzania coraz bardziej energetycznych wibracji jonów, aż do zerwania wiązania, tworząc fragmenty. Jest to podobne do podczerwonej dysocjacji multifotonowej, która również wykorzystuje światło podczerwone, ale z innego źródła. BIRD jest najczęściej używany w spektrometrii masowej rezonansu cyklotronowego z transformacją Fouriera .

Dysocjacja indukowana powierzchniowo

W przypadku dysocjacji indukowanej powierzchniowo (SID) fragmentacja jest wynikiem zderzenia jonu z powierzchnią w wysokiej próżni. Obecnie SID jest używany do fragmentacji szerokiej gamy jonów. Lata temu powszechne było stosowanie SID tylko na cząsteczkach o mniejszej masie, z pojedynczym ładunkiem, ponieważ metody jonizacji i technologie analizatorów masy nie były wystarczająco zaawansowane, aby prawidłowo formować, przesyłać lub charakteryzować jony o wysokim m/z. Z biegiem czasu, samoorganizujące się powierzchnie jednowarstwowe (SAM) złożone z CF3(CF2)10CH2CH2S na złocie były najczęściej używanymi powierzchniami zderzenia dla SID w spektrometrze tandemowym. SAM okazały się najbardziej pożądanymi celami zderzeń ze względu na ich charakterystycznie duże masy efektywne w zderzeniach nadchodzących jonów. Dodatkowo powierzchnie te składają się ze sztywnych łańcuchów fluorowęglowych, które nie tłumią znacząco energii jonów pocisku. Łańcuchy fluorowęglowe są również korzystne ze względu na ich zdolność do opierania się łatwemu przenoszeniu elektronów z powierzchni metalu do przychodzących jonów. Zdolność SID do tworzenia podkompleksów, które pozostają stabilne i dostarczają cennych informacji na temat łączności, nie ma sobie równych w żadnej innej technice dysocjacji. Ponieważ kompleksy wytworzone z SID są stabilne i zachowują rozkład ładunku na fragmencie, daje to unikalne widma, które kompleks skupiają się wokół węższego rozkładu m/z. Produkty SID i energia, przy której powstają, odzwierciedlają mocne strony i topologię kompleksu. Unikalne wzorce dysocjacji pomagają odkryć czwartorzędową strukturę kompleksu. Symetryczny rozkład ładunku i zależność dysocjacji są unikalne dla SID i sprawiają, że wytwarzane widma różnią się od innych technik dysocjacji.

Technika SID ma również zastosowanie w spektrometrii mas ruchliwości jonów (IM-MS). Trzy różne metody tej techniki obejmują analizę charakterystyki topologii, łączności międzypodjednostkowej i stopnia rozwinięcia struktury białka. Najczęściej stosowaną aplikacją techniki SID jest analiza rozłożenia struktury białek. W przypadku spektrometrii mas ruchliwości jonów (IM-MS) SID jest używany do dysocjacji aktywowanych u źródła prekursorów trzech różnych typów kompleksów białkowych: białka C-reaktywnego (CRP), transtyretyny (TTR) i konkanawaliny A (Con A) . Ta metoda służy do obserwowania stopnia rozwinięcia każdego z tych kompleksów. Na potrzeby tej obserwacji SID pokazał struktury jonów prekursorowych, które istniały przed zderzeniem z powierzchnią. IM-MS wykorzystuje SID jako bezpośrednią miarę konformacji każdej podjednostki białka.

Rezonans jonowo-cyklotronowy z transformacją Fouriera (FTICR) jest w stanie zapewnić ultrawysoką rozdzielczość i wysoką dokładność masy przyrządom, które wykonują pomiary masy. Cechy te sprawiają, że spektrometry masowe FTICR są użytecznym narzędziem dla szerokiej gamy zastosowań, takich jak kilka eksperymentów dysocjacji, takich jak dysocjacja indukowana zderzeniem (CID, dysocjacja z przeniesieniem elektronu (ETD) itp. Ponadto, dysocjacja indukowana powierzchniowo została zaimplementowana za pomocą ten instrument do badania podstawowej fragmentacji peptydów. W szczególności SID został zastosowany do badania energetyki i kinetyki fragmentacji w fazie gazowej w instrumencie ICR. Podejście to zastosowano do zrozumienia fragmentacji w fazie gazowej protonowanych peptydów, jony nieparzystych peptydów elektronowych, niekowalencyjne kompleksy ligand-peptyd i zligowane klastry metali.

Proteomika ilościowa

Proteomika ilościowa służy do określenia względnej lub bezwzględnej ilości białek w próbce. Kilka metod proteomiki ilościowej opiera się na tandemowej spektrometrii mas. MS/MS stała się wzorcową procedurą dla strukturalnego wyjaśniania złożonych biomolekuł.

Jedną z metod powszechnie stosowanych w proteomice ilościowej jest znakowanie znaczników izobarycznych. Znakowanie znaczników izobarycznych umożliwia jednoczesną identyfikację i oznaczenie ilościowe białek z wielu próbek w ramach jednej analizy. Aby określić ilościowo białka, peptydy są znakowane znacznikami chemicznymi, które mają taką samą strukturę i masę nominalną, ale różnią się rozmieszczeniem ciężkich izotopów w swojej strukturze. Te znaczniki, powszechnie określane jako tandemowe znaczniki masowe, są zaprojektowane tak, że znacznik masowy jest odcinany w określonym regionie łącznika w wyniku dysocjacji kolizyjnej o wyższej energii (HCD) podczas tandemowej spektrometrii masowej, dając jony reporterowe o różnych masach. Oznaczenie ilościowe białka przeprowadza się przez porównanie intensywności jonów reporterowych w widmach MS/MS. Dwa dostępne w handlu znaczniki izobaryczne to odczynniki iTRAQ i TMT.

Znaczniki izobaryczne do względnej i bezwzględnej oceny ilościowej (iTRAQ)

Znakowanie izobaryczne dla tandemowej spektrometrii masowej: białka są ekstrahowane z komórek, trawione i znakowane znacznikami o tej samej masie. Po fragmentacji podczas MS/MS jony reporterowe pokazują względną ilość peptydów w próbkach.

Izobaryczna znacznik względnej i bezwzględnej oceny ilościowej (iTRAQ) jest odczynnikiem tandemowej spektrometrii masowej, który jest stosowany w celu określenia ilości białek pochodzących z różnych źródeł w jednym eksperymencie. Wykorzystuje stabilne cząsteczki znakowane izotopami , które mogą tworzyć wiązanie kowalencyjne z aminami końca N i łańcucha bocznego białek. Odczynniki iTRAQ są używane do znakowania peptydów z różnych próbek, które są łączone i analizowane za pomocą chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii masowej. Fragmentacja dołączonego znacznika generuje jon reporterowy o małej masie cząsteczkowej, który można zastosować do względnej ilościowej oceny peptydów i białek, z których one pochodzą.

Tag masowy w tandemie (TMT)

Znacznik masy tandemowego (TMT) jest izobarycznie znacznik masy etykieta chemiczne stosowane do oznaczania ilościowego białek i identyfikacji. Znaczniki zawierają cztery regiony: reporter masy, linker rozszczepialny, normalizację masy i grupę reaktywną wobec białka. Odczynniki TMT można stosować do jednoczesnej analizy od 2 do 11 różnych próbek peptydów przygotowanych z komórek, tkanek lub płynów biologicznych. Dostępne są trzy rodzaje odczynników TMT o różnej reaktywności chemicznej: (1) reaktywna estrowa grupa funkcyjna NHS do znakowania amin pierwszorzędowych (TMTduplex, TMTsixplex, TMT10plex plus TMT11-131C), (2) reaktywna grupa funkcyjna jodoacetylu do znakowania wolnych sulfhydrylów ( jodoTMT) i (3) reaktywna alkoksyaminowa grupa funkcyjna do znakowania karbonylków (aminoksyTMT).

Aplikacje

Peptydy

Ślad chromatograficzny (góra) i tandemowe widmo masowe (dół) peptydu.

Tandemowa spektrometria mas może być stosowana do sekwencjonowania białek . Kiedy nienaruszone białka są wprowadzane do analizatora masy, nazywa się to „ proteomiką odgórną ”, a kiedy białka są trawione na mniejsze peptydy, a następnie wprowadzane do spektrometru mas, nazywa się to „ proteomiką oddolną ”. Proteomika shotgun jest odmianą proteomiki bottom-up, w której białka w mieszaninie są trawione przed rozdziałem i tandemową spektrometrią mas.

Tandemowa spektrometria masowa może wytworzyć znacznik sekwencji peptydowej, który można wykorzystać do identyfikacji peptydu w bazie danych białek. Opracowano notację do wskazywania fragmentów peptydów, które powstają z tandemowego widma masowego. Jony fragmentaryczne peptydu wskazano jako a, b lub c, jeśli ładunek jest utrzymywany na N-końcu i przez x, y lub z, jeśli ładunek jest utrzymywany na C-końcu . Indeks dolny wskazuje liczbę reszt aminokwasowych we fragmencie. Indeksy górne są czasami używane do wskazania strat neutralnych oprócz fragmentacji kręgosłupa, * dla utraty amoniaku i ° dla utraty wody. Chociaż cięcie szkieletu peptydowego jest najbardziej przydatne do sekwencjonowania i identyfikacji peptydów, w warunkach dysocjacji o wysokiej energii można zaobserwować inne jony fragmentacyjne. Obejmują one jony powodujące utratę łańcucha bocznego d, v, w i jony amonowe oraz dodatkowe jony fragmentacyjne specyficzne dla sekwencji związane z poszczególnymi resztami aminokwasowymi.

Oligosacharydy

Oligosacharydy można sekwencjonować za pomocą tandemowej spektrometrii masowej w podobny sposób do sekwencjonowania peptydów. Fragmentacja zwykle występuje po obu stronach wiązania glikozydowego (jony b, c, y i z), ale także w warunkach bardziej energetycznych poprzez strukturę pierścienia cukrowego w rozszczepieniu krzyżowym (jony x). Ponownie końcowe indeksy dolne są używane do wskazania pozycji cięcia wzdłuż łańcucha. W przypadku jonów rozszczepiających pierścień krzyżowy charakter rozszczepienia pierścienia krzyżowego jest wskazany przez poprzedzające indeksy górne.

Oligonukleotydy

Do sekwencjonowania DNA i RNA zastosowano tandemową spektrometrię mas . Zaproponowano zapis fragmentacji w fazie gazowej jonów oligonukleotydowych .

Badanie przesiewowe noworodka

Badanie przesiewowe noworodków to proces testowania noworodków pod kątem uleczalnych chorób genetycznych , endokrynologicznych , metabolicznych i hematologicznych . Rozwój tandemowych badań przesiewowych spektrometrii mas na początku lat 90. doprowadził do dużej ekspansji potencjalnie wykrywalnych wrodzonych chorób metabolicznych, które wpływają na poziom kwasów organicznych we krwi.

Ograniczenie

Tandemowa spektrometria mas nie może być stosowana do analiz pojedynczych komórek, ponieważ analiza tak małych ilości komórek jest nieczuła. Ograniczenia te wynikają przede wszystkim z połączenia nieefektywnej produkcji jonów i strat jonów w przyrządach z powodu chemicznych źródeł szumu rozpuszczalników.

Perspektywy na przyszłość

Tandemowa spektrometria mas będzie użytecznym narzędziem do charakteryzowania białek, kompleksów nukleoproteinowych i innych struktur biologicznych. Pozostały jednak pewne wyzwania, takie jak analiza ilościowej i jakościowej charakterystyki proteomu.

Zobacz też

• Akceleratorowa spektrometria masowa
• Przekrój (fizyka)
• Analiza masowa spektrometrii energii kinetycznej jonów
• Rozkład jonów jednocząsteczkowych

Bibliografia

Bibliografia

Zewnętrzne linki

• Wprowadzenie do spektrometrii mas autorstwa dr Alison E. Ashcroft