Zacisk napięciowy - Voltage clamp

Ogranicznik napięcia działa na zasadzie ujemnego sprzężenia zwrotnego . Potencjału błonowego wzmacniacz środki błony napięcia i wysyła wyjście do wzmacniacza ze sprzężeniem zwrotnym; to odejmuje napięcie membrany od napięcia polecenia, które otrzymuje z generatora sygnału. Sygnał ten jest wzmacniany i wysyłany do aksonu przez elektrodę przepuszczającą prąd .

Zacisk napięcia jest sposób doświadczalny przez elektrofizjologów do pomiaru jonów prądu poprzez na błonach komórek pobudliwych, takich jak neurony , trzymając membrany napięcia przy ustalonym poziomie. Podstawowy clamp napięciowy będzie iteracyjnie mierzył potencjał membrany , a następnie zmieni potencjał membrany (napięcie) do żądanej wartości przez dodanie niezbędnego prądu. To „zaciska” błonę komórkową przy pożądanym stałym napięciu, umożliwiając ograniczeniu napięcia rejestrowanie dostarczanych prądów. Ponieważ prądy przyłożone do ogniwa muszą być równe (i przeciwne do ładunku)to) prąd przepływający przez błonę komórkową przy ustalonym napięciu, zarejestrowane prądy wskazują, jak komórka reaguje na zmiany potencjału błony. Błony komórkowe komórek pobudliwych zawierają wiele różnych rodzajów kanałów jonowych , z których niektóre są bramkowane napięciem . Zacisk napięcia umożliwia manipulowanie napięciem membrany niezależnie od prądów jonowych, umożliwiając badanie zależności prąd-napięcie kanałów membrany.

Historia

Koncepcja zacisku napięcia została przypisana Kennethowi Cole'owi i George'owi Marmontowi wiosną 1947 roku. Włożyli wewnętrzną elektrodę do gigantycznego aksonu kałamarnicy i zaczęli przykładać prąd. Cole odkrył, że możliwe jest użycie dwóch elektrod i obwodu sprzężenia zwrotnego, aby utrzymać potencjał błonowy komórki na poziomie ustalonym przez eksperymentatora.

Cole opracował technikę clampowania przed erą mikroelektrod , więc jego dwie elektrody składały się z cienkich drutów skręconych wokół pręta izolacyjnego . Ponieważ tego typu elektrody można było włożyć tylko do największych komórek, wczesne eksperymenty elektrofizjologiczne prowadzono prawie wyłącznie na aksonach kałamarnic .

Osobiste zdjęcie Kennetha Cole'a, przekazane dr J. Walterowi Woodbury

Kałamarnice tryskają strumieniami wody, gdy muszą się szybko poruszać, na przykład podczas ucieczki przed drapieżnikiem. Aby ta ucieczka była jak najszybsza, mają akson, który może osiągnąć średnicę 1 mm (sygnały rozprzestrzeniają się szybciej w dół dużych aksonów). Kałamarnica olbrzymia Axon był pierwszy preparat, który można stosować do stabilizacji napięcia transbłonową prądu i było podstawą Hodgkina and Huxleya eksperymentów pionierskich na właściwości potencjału czynnościowego.

Alan Hodgkin zdał sobie sprawę, że aby zrozumieć przepływ jonów przez błonę, konieczne jest wyeliminowanie różnic w potencjale błony. Korzystając z eksperymentów z cęgami napięcia, Hodgkin i Andrew Huxley opublikowali latem 1952 5 artykułów opisujących, w jaki sposób prądy jonowe powodują wzrost potencjału czynnościowego . W ostatniej pracy zaproponowano model Hodgkina-Huxleya, który matematycznie opisuje potencjał czynnościowy. Użycie cęgów napięcia w ich eksperymentach do szczegółowego badania i modelowania potencjału czynnościowego położyło podwaliny pod elektrofizjologię ; za który podzielili nagrodę Nobla z 1963 roku w dziedzinie fizjologii lub medycyny .

Technika

Ogranicznik napięcia jest generatorem prądu. Napięcie transbłonowe jest rejestrowane przez „elektrodę napięciową” względem ziemi , a „elektroda prądowa” przekazuje prąd do ogniwa. Eksperymentator ustawia „napięcie podtrzymujące” lub „potencjał polecenia”, a ogranicznik napięcia wykorzystuje ujemne sprzężenie zwrotne, aby utrzymać ogniwo na tym napięciu. Elektrody są połączone ze wzmacniaczem, który mierzy potencjał membrany i podaje sygnał do wzmacniacza sprzężenia zwrotnego . Wzmacniacz ten otrzymuje również sygnał wejściowy z generatora sygnału, który określa potencjał polecenia i odejmuje potencjał membrany od potencjału polecenia ( _polecenie V – V _m ), powiększa każdą różnicę i wysyła sygnał wyjściowy do elektrody prądowej. Za każdym razem, gdy ogniwo odchyla się od napięcia podtrzymania, wzmacniacz operacyjny generuje „sygnał błędu”, czyli różnicę między potencjałem polecenia a rzeczywistym napięciem ogniwa. Obwód sprzężenia zwrotnego przechodzi prąd do komórki, aby zmniejszyć sygnał błędu do zera. W ten sposób obwód zaciskowy wytwarza prąd równy i przeciwny do prądu jonowego.

Odmiany techniki clampowania

Dwuelektrodowa regulacja napięcia z wykorzystaniem mikroelektrod

Dwuelektrodowy zacisk napięciowy

Do badania właściwości białek błonowych, zwłaszcza kanałów jonowych, wykorzystywana jest technika dwuelektrodowego clampowania (TEVC). Naukowcy wykorzystują tę metodę najczęściej do badania struktur błonowych ulegających ekspresji w oocytach Xenopus . Duży rozmiar tych oocytów pozwala na łatwą obsługę i manipulację.

Metoda TEVC wykorzystuje dwie pipety o niskiej rezystancji, jedną wykrywającą napięcie, a drugą wprowadzającą prąd. Mikroelektrody są wypełniane roztworem przewodzącym i wprowadzane do komórki w celu sztucznego kontrolowania potencjału błony. Membrana działa zarówno jako dielektryk, jak i rezystor , podczas gdy płyny po obu stronach membrany działają jak kondensatory . Mikroelektrody porównują potencjał membrany z napięciem sterującym, dając dokładną reprodukcję prądów przepływających przez membranę. Bieżące odczyty można wykorzystać do analizy odpowiedzi elektrycznej ogniwa na różne aplikacje.

Ta technika jest preferowana w stosunku do pojedynczej mikroelektrody clamp lub innych technik voltage clamp, gdy warunki wymagają rozwiązania dużych prądów. Wysoka zdolność przepuszczania prądu przez zaciski dwuelektrodowe umożliwia zaciskanie dużych prądów, których nie można kontrolować za pomocą technik jednoelektrodowych . System dwuelektrodowy jest również pożądany ze względu na szybki czas ustalania zacisku i niski poziom hałasu. Jednak zastosowanie TEVC jest ograniczone ze względu na rozmiar komórki. Jest skuteczny w oocytach o większej średnicy, ale trudniejszy w użyciu w przypadku małych komórek. Dodatkowo metoda TEVC jest ograniczona tym, że nadajnik prądu musi znajdować się w pipecie. Nie jest możliwe manipulowanie płynem wewnątrzkomórkowym podczas zaciskania, co jest możliwe przy użyciu technik zaciskania łat. Kolejną wadą są problemy z „zaciskiem przestrzennym”. Zacisk napięcia Cole'a wykorzystywał długi drut, który równomiernie zaciskał akson kałamarnicy na całej jego długości. Mikroelektrody TEVC mogą zapewnić jedynie przestrzenne punktowe źródło prądu, które może nie wpływać równomiernie na wszystkie części komórki o nieregularnym kształcie.

Dwuogniwowy zacisk napięciowy

Technika „dual-cell voltage clamp” jest specjalistyczną odmianą dwuelektrodowego clampowania i jest wykorzystywana tylko w badaniach kanałów złącza szczelinowego . Połączenia szczelinowe to pory, które bezpośrednio łączą dwie komórki, przez które swobodnie przepływają jony i małe cząsteczki. Gdy dwie komórki, w których białka połączenia szczelinowego, zazwyczaj koneksyny lub inneksyny , ulegają ekspresji, endogennie lub poprzez wstrzyknięcie mRNA , między komórkami utworzy się kanał połączenia. Ponieważ w systemie obecne są dwie komórki, stosuje się dwa zestawy elektrod. Elektroda rejestrująca i elektroda do wstrzykiwania prądu są umieszczane w każdym ogniwie, a każde ogniwo jest indywidualnie mocowane (każdy zestaw elektrod jest podłączony do oddzielnego aparatu, a integracja danych jest wykonywana przez komputer). Aby nagrać łącznikowych przewodności prąd zmienia się w pierwszej komórce, podczas gdy elektroda zapisu w drugiej komórce rejestruje zmiany wv _m wyłącznie w odniesieniu do drugiej komórki. (Proces można odwrócić za pomocą bodźca występującego w drugiej komórce i rejestracji występującej w pierwszej komórce.) Ponieważ żadna zmiana prądu nie jest indukowana przez elektrodę w zarejestrowanej komórce, każda zmiana napięcia musi być indukowana przez przejście prądu do rejestrowana komórka, przez kanały połączeń szczelinowych, z komórki, w której zmieniano prąd.

Zacisk napięcia jednoelektrodowego

Ta kategoria opisuje zestaw technik, w których jedna elektroda jest używana do stabilizacji napięcia. Technika ciągłego pomiaru jednoelektrodowego (SEVC-c) jest często wykorzystywana przy zapisie patch-clamp. W zapisie penetrującym wewnątrzkomórkowym stosowana jest technika nieciągłego jednoelektrodowego zacisku napięcia (SEVC-d). Ta pojedyncza elektroda spełnia funkcje zarówno wprowadzania prądu, jak i rejestracji napięcia.

Ciągły zacisk jednoelektrodowy (SEVC-c)

Technika „patch-clamp” umożliwia badanie poszczególnych kanałów jonowych. Wykorzystuje elektrodę ze stosunkowo dużą końcówką (> 1 mikrometr), która ma gładką powierzchnię (zamiast ostrej końcówki). Jest to „elektroda typu patch-clamp” (w odróżnieniu od „elektrody ostrej” używanej do nabijania ogniw). Elektroda ta jest dociskana do błony komórkowej i ssanie jest stosowane w celu wciągnięcia membrany komórki do wnętrza końcówki elektrody. Ssanie powoduje, że ogniwo tworzy szczelne uszczelnienie z elektrodą („uszczelnienie gigaomowe”, ponieważ rezystancja jest większa niż gigaomowa ).

SEV-c ma tę zaletę, że można nagrywać z małych komórek, których nie dałoby się nabić za pomocą dwóch elektrod. Jednakże:

Mikroelektrody są niedoskonałymi przewodnikami; ogólnie mają rezystancję ponad miliona omów . Prostują (tzn. zmieniają swoją rezystancję pod wpływem napięcia, często w sposób nieregularny), czasami mają niestabilną rezystancję, jeśli są zatkane zawartością ogniw. Dzięki temu nie będą wiernie rejestrować napięcia ogniwa, zwłaszcza gdy szybko się ono zmienia, ani nie przepuszczają wiernie prądu.
Błędy napięcia i prądu: Obwody SEV-c w rzeczywistości nie mierzą napięcia zaciskanego ogniwa (podobnie jak zacisk dwuelektrodowy). Wzmacniacz patch-clamp działa jak dwuelektrodowy docisk, z tą różnicą, że obwody pomiaru napięcia i przepuszczania prądu są połączone (w docisku dwuelektrodowym są one połączone przez ogniwo ). Elektroda jest przymocowana do przewodu, który styka się z pętlą prądowo-napięciową wewnątrz wzmacniacza. Zatem elektroda ma tylko pośredni wpływ na obwód sprzężenia zwrotnego. Wzmacniacz odczytuje tylko napięcie na górze elektrody i zwraca prąd w celu kompensacji. Ale jeśli elektroda jest niedoskonałym przewodnikiem, obwód zaciskowy ma tylko zniekształcony obraz potencjału membrany. Podobnie, gdy obwód przepuszcza prąd wsteczny, aby skompensować to (zniekształcone) napięcie, prąd zostanie zniekształcony przez elektrodę, zanim dotrze do ogniwa. Aby to zrekompensować, elektrofizjolog używa elektrody o najniższej możliwej rezystancji, upewnia się, że charakterystyka elektrody nie zmienia się podczas eksperymentu (więc błędy będą stałe) i unika rejestrowania prądów, których kinetyka może być zbyt szybka dla cęgów postępuj dokładnie. Dokładność SEV-c rośnie im wolniej i mniejsze są zmiany napięcia, które próbuje zwęzić.
Błędy rezystancji szeregowej: Prądy przekazywane do ogniwa muszą przejść do uziemienia, aby zakończyć obwód. Napięcia są rejestrowane przez wzmacniacz względem ziemi. Kiedy komórka jest zaciśnięta na swoim naturalnym potencjale spoczynkowym , nie ma problemu; cęgi nie przepuszczają prądu, a napięcie jest generowane tylko przez ogniwo. Ale przy zaciskaniu przy innym potencjale, błędy rezystancji szeregowej stają się problemem; komórka przepuszcza prąd przez błonę, próbując powrócić do swojego naturalnego potencjału spoczynkowego. Wzmacniacz cęgowy przeciwdziała temu, przepuszczając prąd, aby utrzymać potencjał trzymania. Problem pojawia się, ponieważ elektroda znajduje się między wzmacniaczem a ogniwem; tzn. elektroda jest połączona szeregowo z opornikiem, który jest membraną ogniwa. Tak więc, gdy prąd przepływa przez elektrodę i ogniwo, prawo Ohma mówi nam, że spowoduje to powstanie napięcia na oporności ogniwa i elektrody. Ponieważ te rezystory są połączone szeregowo, spadki napięcia będą się dodawały. Jeśli elektroda i błona komórkowa mają równe rezystancje (które zwykle nie mają), a eksperymentator nakaże zmianę potencjału spoczynkowego o 40 mV, wzmacniacz będzie przepuszczał wystarczający prąd, aż odczyta, że osiągnął tę zmianę o 40 mV. Jednak w tym przykładzie połowa tego spadku napięcia przypada na elektrodę. Eksperymentator myśli, że przesunął napięcie ogniwa o 40 mV, ale przesunął je tylko o 20 mV. Różnica polega na „błądzie rezystancji szeregowej”. Nowoczesne wzmacniacze patch-clamp mają obwody kompensujące ten błąd, ale kompensują je tylko w 70-80%. Elektrofizjolog może dodatkowo zredukować błąd, rejestrując na lub w pobliżu naturalnego potencjału spoczynkowego komórki i używając elektrody o jak najmniejszej rezystancji.
Błędy pojemności. Mikroelektrody są kondensatorami i są szczególnie kłopotliwe, ponieważ są nieliniowe. Pojemność powstaje, ponieważ elektrolit wewnątrz elektrody jest oddzielony izolatorem (szkłem) od roztworu na zewnątrz. Jest to z definicji i funkcji kondensator. Co gorsza, gdy grubość szkła zmienia się w miarę oddalania się od końcówki, stała czasowa kondensatora będzie się zmieniać. Daje to zniekształcony zapis napięcia lub prądu membrany za każdym razem, gdy się zmieniają. Wzmacniacze mogą to skompensować, ale nie do końca, ponieważ pojemność ma wiele stałych czasowych. Eksperymentator może zmniejszyć problem, utrzymując płytkę roztworu kąpielowego ogniwa (wystawiając mniejszą powierzchnię szkła na działanie cieczy) i pokrywając elektrodę silikonem, żywicą, farbą lub inną substancją, która zwiększy odległość między roztworami wewnętrznymi i zewnętrznymi.
Błędy zacisku przestrzeni. Pojedyncza elektroda jest punktowym źródłem prądu. W odległych częściach ogniwa prąd przepływający przez elektrodę będzie miał mniejszy wpływ niż w pobliskich częściach ogniwa. Jest to szczególnie problem podczas nagrywania z neuronów o rozbudowanych strukturach dendrytycznych. Z błędami cęgów przestrzennych nie można zrobić nic poza złagodzeniem wniosków eksperymentu.

Nieciągły jednoelektrodowy zacisk napięciowy (SEVC-d)

Jednoelektrodowe ograniczenie napięcia — nieciągłe lub SEVC-d, ma pewne zalety w porównaniu z SEVC-c w przypadku nagrywania całej komórki. W tym przypadku stosuje się inne podejście do przekazywania prądu i rejestrowania napięcia. Wzmacniacz SEVC-d działa na zasadzie „ podziału czasu ”, dzięki czemu elektroda regularnie i często przełącza się między przepływem prądu a napięciem pomiarowym. W efekcie są dwie elektrody, ale każda działa tylko przez połowę czasu, w którym jest włączona. Oscylacja pomiędzy dwiema funkcjami pojedynczej elektrody nazywana jest cyklem pracy. Podczas każdego cyklu wzmacniacz mierzy potencjał membrany i porównuje go z potencjałem trzymania. Wzmacniacz operacyjny mierzy różnicę i generuje sygnał błędu. Prąd ten jest lustrzanym odbiciem prądu generowanego przez komórkę. Wyjścia wzmacniacza wyposażone są w obwody próbkowania i podtrzymywania , więc każde krótko próbkowane napięcie jest następnie utrzymywane na wyjściu aż do następnego pomiaru w następnym cyklu. Mówiąc konkretnie, wzmacniacz mierzy napięcie w ciągu pierwszych kilku mikrosekund cyklu, generuje sygnał błędu i spędza resztę cyklu na przepuszczaniu prądu, aby zmniejszyć ten błąd. Na początku następnego cyklu ponownie mierzone jest napięcie, generowany jest nowy sygnał błędu, przepływ prądu itp. Eksperymentator ustawia długość cyklu i możliwe jest próbkowanie z okresami tak niskimi, jak około 15 mikrosekund, co odpowiada częstotliwości 67 kHz częstotliwość przełączania. Częstotliwości przełączania niższe niż około 10 kHz nie są wystarczające podczas pracy z potencjałami czynnościowymi o szerokości mniejszej niż 1 milisekunda. Należy zauważyć, że nie wszystkie nieciągłe wzmacniacze cęgów napięciowych obsługują częstotliwości przełączania wyższe niż 10 kHz.

Aby to zadziałało, pojemność ogniwa musi być wyższa niż pojemność elektrody co najmniej o rząd wielkości . Pojemność spowalnia kinetykę (czasy narastania i opadania) prądów. Jeśli pojemność elektrody jest znacznie mniejsza niż pojemność ogniwa, to gdy prąd przepływa przez elektrodę, napięcie elektrody będzie się zmieniać szybciej niż napięcie ogniwa. Tak więc, gdy prąd zostanie wstrzyknięty, a następnie wyłączony (pod koniec cyklu pracy), napięcie elektrody będzie zanikać szybciej niż napięcie ogniwa. Gdy tylko napięcie elektrody asymptoty z napięciem ogniwa, napięcie może być próbkowane (ponownie) i przyłożona następna ilość ładunku. Tak więc częstotliwość cyklu pracy jest ograniczona do prędkości, z jaką napięcie elektrody rośnie i zanika podczas przepływu prądu. Im niższa pojemność elektrody, tym szybciej można cykl.

SEVC-d ma dużą przewagę nad SEVC-c, ponieważ umożliwia eksperymentatorowi pomiar potencjału błonowego, a ponieważ pozwala uniknąć jednoczesnego przepływu prądu i pomiaru napięcia, nigdy nie występuje błąd rezystancji szeregowej. Główne wady to ograniczona rozdzielczość czasowa i niestabilność wzmacniacza. Jeśli przepuszcza zbyt dużo prądu, tak że napięcie docelowe jest przestrzelone, odwraca polaryzację prądu w następnym cyklu pracy. Powoduje to, że napięcie docelowe jest niższe, więc następny cykl ponownie odwraca polaryzację wstrzykiwanego prądu. Ten błąd może rosnąć z każdym cyklem, aż wzmacniacz wymyka się spod kontroli („dzwonienie”); zwykle prowadzi to do zniszczenia rejestrowanej komórki. Badacz chce krótkiego cyklu pracy, aby poprawić rozdzielczość czasową; wzmacniacz ma regulowane kompensatory, dzięki którym napięcie elektrody zanika szybciej, ale jeśli ustawione są zbyt wysoko, wzmacniacz będzie dzwonił, więc badacz zawsze stara się „dostroić” wzmacniacz jak najbliżej krawędzi niekontrolowanych oscylacji, w takim przypadku niewielkie zmiany warunków nagrywania mogą powodować dzwonienie. Istnieją dwa rozwiązania: „wycofać” ustawienia wzmacniacza do bezpiecznego zakresu lub uważać na oznaki, że wzmacniacz zaraz zadzwoni.

Modelowanie matematyczne

xZ punktu widzenia teorii sterowania eksperyment z ograniczeniem napięcia można opisać w kategoriach zastosowania prawa sterowania ze sprzężeniem zwrotnym o wysokim wzmocnieniu do błony neuronalnej. Matematycznie napięcie membrany można modelować za pomocą modelu opartego na przewodności z wejściem podanym przez przyłożony prąd i wyjściem podanym przez napięcie membrany . Oryginalny model Hodgkina i Huxley'a oparty na przewodności, który reprezentuje błonę neuronalną zawierającą prądy jonów sodu i potasu , a także prąd upływu , jest podany przez układ równań różniczkowych zwyczajnych ${\ Displaystyle I_ {aplikacja} (t)}$ ${\ Displaystyle V (t)}$

${\ Displaystyle C_ {m} {\ Frac {dV} {dt}} = - {\ bar {g}} _ {\ tekst {K}} n ^ {4}(V-V_ {\ tekst {K}} )-{\bar {g}}_{\text{Na}}m^{3}h(V-V_{\text{Na}})-{\bar {g}}_{\text{L} }(V-V_{L})+I_{aplikacja}}$

${\ Displaystyle {\ Frac {dp} {dt}} = \ alfa _ {p} (V) (1-p) - \ beta _ {p} (V) p \ quad p = m, n, h}$

gdzie jest pojemność membrana , i jest maksymalne, przewodnictwo , i są potencjały odwrócenie i są stałymi szybkości zależnych od napięcia kanałów jonowych, a zmienne stanu , i mają kanał jonowy bramkowania zmienne . ${\ Displaystyle C_ {m}}$ ${\ Displaystyle {\ bar {g}} _ {\ tekst {Na}}}$ ${\ Displaystyle {\ bar {g}} _ {\ tekst {K}}}$ ${\ Displaystyle {\ bar {g}} _ {\ tekst {L}}}$ ${\ Displaystyle V_ {\ tekst {Na}}}$ ${\ Displaystyle V_ {\ tekst {K}}}$ $V_{\tekst{L}}$ ${\ Displaystyle \ alfa _ {p}}$ ${\ Displaystyle \ beta _ {p}}$ ${\ Displaystyle m}$ ${\ Displaystyle h}$ ${\ Displaystyle n}$

Możliwe jest rygorystyczne wykazanie, że prawo sprzężenia zwrotnego

${\ Displaystyle I_ {aplikacja} (t) = k (V_ {\ tekst {ref}} -V (t))}$

przesuwa napięcie membrany arbitralnie blisko napięcia odniesienia, gdy wzmocnienie jest zwiększane do dowolnie dużej wartości. Ten fakt, który bynajmniej nie jest ogólną właściwością układów dynamicznych (duże wzmocnienie może generalnie prowadzić do niestabilności ), jest konsekwencją struktury i właściwości powyższego modelu opartego na przewodności. W szczególności dynamika każdej zmiennej bramkującej , która jest sterowana przez , weryfikuje właściwość silnej stabilności skrócenia wykładniczego. ${\ Displaystyle V (t)}$ $V_{\tekst{ref}}$ $k>0$ $p=m,h,n$ ${\ Displaystyle V}$

Bibliografia

Dalsza lektura

Sherman-Gold R, wyd. (1993). „Bioelektryczność” (PDF) . Przewodnik Axon dotyczący technik laboratoryjnych elektrofizjologii i biofizyki . Instrumenty Aksonowe. s. 1-16. OCLC 248830666 .

Languages

In other projects