Obrazowanie wapnia - Calcium imaging

Obrazowanie wapnia to technika mikroskopowa służąca do optycznego pomiaru stanu wapnia (Ca2 ⁺ ) izolowanej komórki , tkanki lub podłoża. Obrazowanie wapnia wykorzystuje wskaźniki wapnia, cząsteczki fluorescencyjne, które reagują na wiązanie jonów Ca ²⁺ poprzez właściwości fluorescencyjne. Istnieją dwie główne klasy wskaźników wapnia: wskaźniki chemiczne i genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI). Ta technika umożliwiła badania sygnalizacji wapniowej w wielu różnych typach komórek. W neuronach aktywności elektrycznej zawsze towarzyszy napływ jonów Ca ²⁺ . Tak więc obrazowanie wapnia może być wykorzystywane do monitorowania aktywności elektrycznej w setkach neuronów w hodowli komórkowej lub u żywych zwierząt, co umożliwiło analizę funkcji obwodów neuronalnych .

Wskaźniki chemiczne

Schemat typowej konfiguracji do obrazowania fluorescencji wapnia izolowanych miocytów sercowych

Wskaźniki chemiczne to małe cząsteczki, które mogą chelatować jony wapnia. Wszystkie te cząsteczki są oparte na homologu EGTA zwanym BAPTA , charakteryzującym się wysoką selektywnością dla jonów wapnia (Ca ²⁺ ) w porównaniu z jonami magnezu (Mg ²⁺ ).

Ta grupa wskaźników obejmuje fura-2 , indo-1 , fluo-3 , fluo-4 , Calcium Green-1.

Barwniki te są często stosowane z grupami karboksylowymi chelatora maskowanymi jako estry acetoksymetylowe , aby nadać cząsteczce lipofilność i umożliwić łatwe wejście do komórki. Gdy ta forma wskaźnika znajdzie się w komórce, esterazy komórkowe uwolnią grupy karboksylowe i wskaźnik będzie zdolny do wiązania wapnia. Barwniki w postaci wolnego kwasu (tj. bez modyfikacji estru acetoksymetylowego) można również bezpośrednio wstrzykiwać do komórek za pomocą mikroelektrody lub mikropipety, co usuwa niepewność co do przedziału komórkowego zawierającego barwnik (ester acetoksymetylowy może również przedostać się do retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów ). Wiązanie Ca ²⁺ jonem fluorescencyjny prowadzi cząsteczki wskaźnikiem albo zwiększenia wydajności kwantowej o fluorescencji lub emisji / długość fali wzbudzenia zmiany. Poszczególne chemiczne wskaźniki fluorescencyjne Ca2 ⁺ są wykorzystywane do pomiarów cytozolowych wapnia w szerokiej gamie preparatów komórkowych. Pierwsze obrazowanie w czasie rzeczywistym (szybkość wideo) Ca ²⁺ przeprowadzono w 1986 roku w komórkach serca przy użyciu kamer wideo zintensyfikowanych. Późniejszy rozwój techniki z wykorzystaniem skanowania laserowego mikroskopów konfokalnych ujawnił sub-komórkowej Ca ²⁺ sygnały w postaci Ca ²⁺ iskier i Ca ²⁺ blips. Względne odpowiedzi z kombinacji chemicznych wskaźników fluorescencyjnych Ca2 ⁺ wykorzystano również do ilościowego określenia przejściowych zmian wapnia w organellach wewnątrzkomórkowych, takich jak mitochondria .

Obrazowanie wapniowe, zwane również mapowaniem wapniowym, jest również wykorzystywane do prowadzenia badań na tkance mięśnia sercowego. Mapowanie wapnia jest wszechobecną techniką stosowaną na całych, izolowanych sercach, takich jak myszy, szczury i króliki.

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) są potężnymi narzędziami przydatnymi do obrazowania in vivo procesów komórkowych, rozwojowych i fizjologicznych. GECI nie muszą być ładowane do komórek; zamiast tego geny kodujące te białka można łatwo transfekować do linii komórkowych. Możliwe jest również stworzenie zwierząt transgenicznych wyrażających barwnik we wszystkich komórkach lub selektywnie w niektórych podtypach komórkowych. GECI stosowano w badaniach neuronów, komórek T , kardiomiocytów itp. Ogólnie mówiąc, GECI można podzielić na klasy, w których wykrywanie wapnia opiera się na fluorescencji lub luminescencji; jednak oba te nieuchronnie polegają na białkach fluorescencyjnych jako reporterach, w tym białku zielonej fluorescencji GFP i jego wariantach (eGFP, YFP, CFP).

Spośród wariantów fluorescencyjnych układy wskaźników wapnia można dalej podzielić na układy z pojedynczymi białkami fluorescencyjnymi (FP) i układy ze sparowanymi białkami fluorescencyjnymi. Camgaroos były jednym z pierwszych opracowanych wariantów obejmujących pojedynczy system białkowy. Camgaroos wykorzystują kalmodulinę (CaM), białko wiążące wapń. W tych strukturach CaM jest wstawiony w środku żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) w Y145. Wcześniejsze badania mutagenezy ujawniły, że mutacje w tej pozycji nadają stabilność pH przy zachowaniu właściwości fluorescencyjnych, co czyni Y145 interesującym punktem insercji. Dodatkowo, końce N i C YFP są połączone łącznikiem peptydowym (GGTGGS). Gdy CaM wiąże się z Ca2+, efektywne pKa jest obniżone, co pozwala na deprotonację chromoforu. Powoduje to zwiększoną fluorescencję po wiązaniu wapnia w sposób intensjometryczny. Taka detekcja jest w przeciwieństwie do systemów ratiometrycznych, w których następuje zmiana widm absorbancji/emisji w wyniku wiązania Ca2+. Później opracowany pojedynczy system FP, nazwany G-CaMP , również odwołuje się do GFP permutowanego kołowo. Jeden z końców jest połączony z CaM, a drugi koniec jest połączony z M13 (domena wiążąca kalmodulinę kinazy lekkiej miozyny). Białko zaprojektowano tak, aby końce znajdowały się blisko przestrzeni, co pozwala na wiązanie Ca2+ powodujące zmiany konformacyjne i modulację chromoforu, co pozwala na zwiększoną fluorescencję. G-CaMP i jego udoskonalone warianty mają wartości nanomolowe dla powinowactwa wiązania. Ostatnim wariantem pojedynczego białka jest CatchER, który jest ogólnie uważany za wskaźnik o niższym powinowactwie. Jego kieszeń wiążąca wapń jest dość ujemna; wiązanie kationu pomaga chronić duże stężenie ładunku ujemnego i umożliwia odzyskanie fluorescencji.

W przeciwieństwie do tych systemów są sparowane systemy białek fluorescencyjnych, do których należą prototypowe Cameleony . Kameleony składają się z dwóch różnych białek fluorescencyjnych, CaM, M13 i łącznika glicyloglicyny. W przypadku braku Ca2+, tylko białko fluorescencyjne przesunięte na niebiesko dawcy będzie fluorescencyjne. Jednak zmiana konformacyjna spowodowana wiązaniem wapnia repozycjonuje przesunięte ku czerwieni białko fluorescencyjne, umożliwiając zajście FRET (przenoszenie energii rezonansu Forstera). Wskaźniki Cameleona wytwarzają sygnał ratiometryczny (tj. zmierzona wydajność FRET zależy od stężenia wapnia). Oryginalne warianty kameleonów były pierwotnie bardziej wrażliwe na Ca2+ i były gaszone kwasem. Takie niedociągnięcia zostały zniesione przez mutacje Q69K i V68L. Obie te reszty były blisko zakopanego anionowego chromoforu i te mutacje prawdopodobnie utrudniają protonowanie, nadając większą odporność na pH.

Coraz większe znaczenie w wykrywaniu wapnia mają GECI bliskiej podczerwieni (NIR), które mogą otwierać możliwości multipleksowania różnych systemów wskaźników i umożliwiania głębszej penetracji tkanek. NIR opierają się na białkach fluorescencyjnych wiążących biliwerdynę, które w dużej mierze pochodzą z fitochromów bakteryjnych . Systemy NIR są podobne do perykamów inGCverse pod tym względem, że oba doświadczają spadku fluorescencji po związaniu Ca2+. RCaMP i RGECO działają przy 700+ nm, ale są dość słabe i mają duże rozpraszanie. Z powodzeniem skonstruowano również analog Cameleona wykorzystujący NIR FRET.

Specjalna klasa GECI została zaprojektowana w celu utworzenia trwałego znacznika fluorescencyjnego w aktywnych neuronach. Oparte są na fotoprzełączanym białku Eos, które poprzez fotokatalizowane (światłem fioletowym) rozszczepianie kręgosłupa zmienia kolor z zielonego na czerwony. W połączeniu z CaM, fioletowe światło fotokonwertuje tylko neurony, które mają podwyższony poziom wapnia. SynTagMA to ukierunkowana na synapsę wersja CaMPARI2.

Chociaż systemy fluorescencyjne są szeroko stosowane, bioluminescencyjne reportery Ca2+ mogą również mieć potencjał ze względu na ich zdolność do znoszenia autofluorescencji, fotowybielania [nie jest potrzebna długość fali wzbudzenia], biologicznej degradacji i toksyczności, a także wyższych stosunków sygnału do szumu. Takie systemy mogą opierać się na ekworynie i koelenterazynie z lucyferyną. Wiązanie Ca2+ powoduje zmianę konformacyjną, która ułatwia utlenianie koelenterazyny. Powstały fotoprodukt emituje niebieskie światło, gdy powraca do stanu podstawowego. Kolokalizacja ekworyny z GFP ułatwia BRET/CRET (Transfer energii rezonansu bioluminescencji lub chemiluminescencji), powodując wzrost jasności o 19-65. Takie struktury można wykorzystać do sondowania od milimolowych do nanomolarnych stężeń wapnia. Podobny system przywołuje obelinę i jej koelenteramid lucyferyny, który może mieć szybszy czas odpowiedzi na wapń i niewrażliwość na Mg2+ niż jego odpowiednik aqueorin. Takie systemy mogą również wykorzystywać samoorganizację komponentów lucyferazy. W systemie nazwanym „nano-lantern” lucyferaza RLuc8 jest dzielona i umieszczana na różnych końcach CaM. Wiązanie wapnia zbliża do siebie składniki RLuc8, reformując lucyferazę i umożliwiając jej przeniesienie do akceptorowego białka fluorescencyjnego.

Aby zminimalizować uszkodzenia wizualizowanych komórek, często stosuje się mikroskopię dwufotonową w celu wykrycia fluorescencji reporterów. Zastosowanie długości fal bliskiej podczerwieni i minimalizacja osiowego rozproszenia funkcji punktowej pozwala na rozdzielczość nanometrową i głęboką penetrację w tkankę. Na podstawie takich pomiarów często określa się zakres dynamiczny. Dla wskaźników nieratiometrycznych (zwykle wskaźników pojedynczego białka) jest to stosunek intensywności fluorescencji uzyskanych odpowiednio w warunkach nasycenia Ca2+ i zubożenia. Jednak dla wskaźników ratiometrycznych zakres dynamiczny jest stosunkiem maksymalnego współczynnika efektywności FRET (nasycenie wapniem) do minimalnego współczynnika efektywności FRET (zubożony w wapń). Jeszcze inną powszechną wielkością stosowaną do pomiaru sygnałów wytwarzanych przez strumienie stężenia wapnia jest stosunek sygnału do wartości podstawowej (SBR), który jest po prostu stosunkiem zmiany fluorescencji (F - F0) w stosunku do fluorescencji linii bazowej. Można to powiązać ze współczynnikiem SNR (stosunek sygnału do szumu) poprzez pomnożenie SBR przez pierwiastek kwadratowy liczby zliczonych fotonów.

Specjalna klasa genetycznie kodowanych wskaźników wapnia została zaprojektowana w celu utworzenia trwałego znacznika fluorescencyjnego w aktywnych neuronach. Oparte są na fotoprzełączanych białkach mEos, które pod wpływem światła fioletowego zmieniają kolor z zielonego na czerwony. W połączeniu z kalmoduliną , czujnikiem wapnia , światło fioletowe fotokonwertuje tylko te neurony, które mają podwyższony poziom wapnia. SynTagMA to ukierunkowana na synapsę wersja CaMPARI2.

Stosowanie

Bez względu na rodzaj użytego wskaźnika procedura obrazowania jest na ogół bardzo podobna. Komórki obciążone wskaźnikiem lub wyrażające go w przypadku GECI, mogą być oglądane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i rejestrowane przez kamerę Scientific CMOS (sCMOS) lub kamerę CCD . Mikroskopy konfokalne i dwufotonowe zapewniają zdolność do cięcia optycznego, dzięki czemu sygnały wapnia mogą być rozdzielone w mikrodomenach, takich jak kolce dendrytyczne lub guziczki synaptyczne , nawet w grubych próbkach, takich jak mózgi ssaków. Obrazy są analizowane poprzez pomiar zmian intensywności fluorescencji dla pojedynczej długości fali lub dwóch długości fali wyrażonych jako stosunek (wskaźniki proporcjonalne). W razie potrzeby uzyskane intensywności i stosunki fluorescencji można wykreślić w odniesieniu do wartości kalibrowanych dla znanych poziomów Ca ^{2+ w} celu pomiaru bezwzględnych stężeń Ca ²⁺ . Metody mikroskopii pola świetlnego rozszerzają funkcjonalny odczyt możliwości aktywności neuronowej w objętościach 3D.

Bibliografia

Dalsza lektura

• Nuccitelli, Richard, wyd. (1994). „Praktyczny przewodnik po badaniu wapnia w żywych komórkach” . Metody w biologii komórki. Boston: prasa akademicka. Numer ISBN 978-0-12-564141-8.