Immunoprecypitacja chromatyny - Chromatin immunoprecipitation

Przepływ pracy sekwencjonowania chipów

Immunoprecypitacja chromatyny ( ChIP ) to rodzaj eksperymentalnej techniki immunoprecypitacji stosowanej do badania interakcji między białkami a DNA w komórce. Ma on na celu ustalenie, czy określone białka są powiązane z określonymi regionami genomowymi, takimi jak czynniki transkrypcyjne na promotorach lub innych miejscach wiązania DNA , oraz być może definiują cistromy . ChIP ma również na celu określenie konkretnej lokalizacji w genomie, z którą związane są różne modyfikacje histonów , wskazując cel modyfikatorów histonów.

W skrócie, konwencjonalna metoda wygląda następująco:

DNA i związane z nim białka na chromatynie w żywych komórkach lub tkankach są usieciowane (ten etap jest pominięty w natywnym ChIP).
Kompleksy DNA-białko (chromatyna-białko) są następnie dzielone na fragmenty DNA o wielkości ~500 pz przez sonikację lub trawienie nukleazą.
Usieciowane fragmenty DNA związane z białkiem (białkami) będącymi przedmiotem zainteresowania są selektywnie immunoprecypitowane z resztek komórek przy użyciu odpowiedniego przeciwciała specyficznego dla białka.
Powiązane fragmenty DNA są oczyszczane i określana jest ich sekwencja. Wzbogacenie określonych sekwencji DNA reprezentuje regiony genomu, z którymi in vivo jest związane białko będące przedmiotem zainteresowania .

Typowy chip

Istnieją głównie dwa rodzaje ChIP, różniące się przede wszystkim początkowym przygotowaniem chromatyny. Pierwszy wykorzystuje odwracalnie usieciowaną chromatynę ścinaną przez sonikację zwaną usieciowanym ChIP (XChIP). Native chipa (NChIP) wykorzystuje natywne chromatyny strzyżoną przez micrococcal nukleazą trawienia.

Usieciowany chip (XChIP)

Sieciowany ChIP nadaje się głównie do mapowania docelowego DNA czynników transkrypcyjnych lub innych białek związanych z chromatyną i wykorzystuje odwracalnie usieciowaną chromatynę jako materiał wyjściowy. Środkiem do odwracalnego sieciowania może być formaldehyd lub światło UV . Następnie usieciowana chromatyna jest zwykle ścinana przez sonikację, dostarczając fragmenty o długości 300-1000 par zasad (pz). Do ścinania chromatyny zastosowano łagodne sieciowanie formaldehydem, a następnie trawienie nukleazą. Fragmenty chromatyny o wielkości 400-500 pz okazały się odpowiednie do testów ChIP, ponieważ obejmują od dwóch do trzech nukleosomów .

Resztki komórek w pociętym lizacie są następnie usuwane przez sedymentację, a kompleksy białko-DNA są selektywnie immunoprecypitowane przy użyciu swoistych przeciwciał przeciwko białku ( białkom będącym przedmiotem zainteresowania). Przeciwciała są zwykle sprzęgane z agarozą , sefarozą lub kulkami magnetycznymi. Alternatywnie, kompleksy chromatyna-przeciwciało mogą być selektywnie zatrzymywane i eluowane przez obojętne dyski polimerowe. Kompleksy poddane immunoprecypitacji (tj. kompleks kulka-przeciwciało-białko-docelowa sekwencja DNA) są następnie zbierane i przemywane w celu usunięcia niespecyficznie związanej chromatyny, wiązanie krzyżowe białko-DNA jest odwracane, a białka usuwane przez trawienie proteinazą K . Epitopów -tagged wersję białka będącego przedmiotem zainteresowania, lub in vivo biotynylacji może być stosowany zamiast przeciwciał do natywnego białka.

DNA związane z kompleksem jest następnie oczyszczane i identyfikowane za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), mikromacierzy ( ChIP-on-chip ), klonowania i sekwencjonowania molekularnego lub bezpośredniego wysokoprzepustowego sekwencjonowania ( ChIP-Seq ).

Natywny chip (NChIP)

Natywny ChIP nadaje się głównie do mapowania docelowego DNA modyfikatorów histonów . Na ogół jako chromatynę wyjściową stosuje się chromatynę natywną. Gdy histony owijają się wokół DNA, tworząc nukleosomy, są one naturalnie połączone. Następnie chromatyna jest ścinana przez trawienie nukleazą mikrokokową, która tnie DNA na długości łącznika, pozostawiając nienaruszone nukleosomy i dostarczając fragmenty DNA jednego nukleosomu (200 pz) do pięciu nukleosomów (1000 pz) długości. Następnie stosuje się metody podobne do XChIP do usuwania resztek komórek, immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania, usuwania białka z immunoprecypitowanego kompleksu oraz oczyszczania i analizy DNA związanego z kompleksem.

Porównanie XChIP i NChIP

Główną zaletą NChIP jest swoistość przeciwciał . Należy zauważyć, że większość przeciwciał przeciwko zmodyfikowanym histonom powstaje przeciwko nieutrwalonym, syntetycznym antygenom peptydowym i że epitopy, które muszą rozpoznawać w XChIP, mogą zostać zakłócone lub zniszczone przez sieciowanie formaldehydem , zwłaszcza że wiązania krzyżowe mogą angażują grupy e-aminowe lizyny na końcach N, rozrywając epitopy. To prawdopodobnie wyjaśnia niezmiennie niską wydajność protokołów XChIP w porównaniu z NChIP.

Ale XChIP i NChIP mają różne cele i zalety w stosunku do siebie. XChIP służy do mapowania miejsc docelowych czynników transkrypcyjnych i innych białek związanych z chromatyną; NChIP służy do mapowania miejsc docelowych modyfikatorów histonów (patrz Tabela 1).

Tabela 1 Zalety i wady NChIP i XChIP

	XChIP	NChIP
Zalety	Odpowiednie dla czynników transkrypcyjnych lub innych słabo wiążących białek związanych z chromatyną. Możliwość zastosowania we wszystkich organizmach, w których trudno jest przygotować natywne białko	Testowana swoistość przeciwciał Lepsza swoistość przeciwciał jako naturalnie nienaruszone białko docelowe Lepsza wydajność odzyskiwania chromatyny i białka dzięki lepszej swoistości przeciwciał
Niedogodności	Niewydajny odzysk chromatyny z powodu rozerwania epitopu białka docelowego przeciwciała Może powodować fałszywie dodatni wynik z powodu wiązania białek przejściowych do chromatyny Szeroki zakres wielkości ścinania chromatyny z powodu losowego cięcia przez sonikację.	Zwykle nie nadaje się do białek niehistonowych Nukleosomy mogą zmieniać się podczas trawienia

Historia i nowe metody ChIP

W 1984 roku John T. Lis i David Gilmour, wówczas doktorant w laboratorium Lis, zastosowali promieniowanie UV, środek sieciujący białko-kwas nukleinowy o zerowej długości, aby kowalencyjnie usieciować białka związane z DNA w żywych komórkach bakteryjnych. Po lizie usieciowanych komórek i immunoprecypitacji bakteryjnej polimerazy RNA, DNA związany ze wzbogaconą polimerazą RNA poddano hybrydyzacji z sondami odpowiadającymi różnym regionom znanych genów w celu określenia rozmieszczenia in vivo i gęstości polimerazy RNA w tych genach. Rok później wykorzystali tę samą metodologię do zbadania dystrybucji eukariotycznej polimerazy RNA II w genach szoku cieplnego muszek owocowych. Doniesienia te uważane są za pionierskie badania w dziedzinie immunoprecypitacji chromatyny. XChIP był dalej modyfikowany i rozwijany przez Alexandra Varshavsky'ego i współpracowników, którzy badali dystrybucję histonu H4 na genach szoku cieplnego za pomocą sieciowania formaldehydem. Technika ta była następnie intensywnie rozwijana i udoskonalana. Podejście NChIP zostało po raz pierwszy opisane przez Hebbesa i in ., 1988, a także zostało szybko opracowane i udoskonalone. Typowy test ChIP zazwyczaj 4-5 dni i wymagają 10 ⁶ ~ 10 ⁷ komórek, co najmniej. Teraz nowe techniki na ChIP mogą być osiągnięte w zaledwie 100~1000 komórek i ukończone w ciągu jednego dnia.

ChIP bez kulek : Ta nowatorska metoda ChIP wykorzystuje krążki z obojętnego, porowatego polimeru funkcjonalizowanego białkiem A lub G w kolumnach wirowych lub mikropłytkach. Kompleks chromatyna-przeciwciało jest selektywnie zatrzymywany przez dysk i eluowany w celu uzyskania wzbogaconego DNA do dalszych zastosowań, takich jak qPCR i sekwencjonowanie. Porowate środowisko zostało specjalnie zaprojektowane, aby zmaksymalizować wydajność wychwytywania i zmniejszyć niespecyficzne wiązanie. Ze względu na mniej ręcznej obsługi i zoptymalizowane protokoły, ChIP można wykonać w 5 godzin.
Carrier ChIP (CChIP): W tym podejściu można wykorzystać zaledwie 100 komórek przez dodanie komórek Drosophila jako chromatyny nośnika w celu zmniejszenia strat i ułatwienia wytrącania docelowej chromatyny. Wymaga to jednak wysoce specyficznych starterów do wykrywania chromatyny komórki docelowej na tle chromatyny obcego nośnika i zajmuje to od dwóch do trzech dni.
Fast ChIP (qChIP): Szybki test ChIP skrócił czas, skracając dwa etapy typowego testu ChIP: (i) kąpiel ultradźwiękowa przyspiesza szybkość wiązania przeciwciała z białkami docelowymi — a tym samym skraca czas immunoprecypitacji (ii) żywica- procedura izolacji DNA oparta na (Chelex-100) skraca czas odwrócenia usieciowania i izolacji DNA. Jednak szybki protokół jest odpowiedni tylko dla dużych próbek komórek (w zakresie ¹⁰⁶ ~ ¹⁰⁷ ). W ciągu 5 godzin można przetworzyć do 24 pociętych próbek chromatyny w celu uzyskania DNA gotowego do reakcji PCR, co pozwala na jednoczesne sondowanie wielu czynników chromatyny i/lub przyglądanie się zdarzeniom genomowym w kilku punktach czasowych.

Szybkie i chip ilościowej (Q ² ChIP) Test wykorzystuje 100000 komórek jako materiał wyjściowy i nadaje się do 1000 CHiPs histonowych albo 100 żetonów czynników transkrypcji. W ten sposób wiele próbek chromatyny można wytwarzać równolegle i przechowywane i Q ² układ może być przeprowadzona w ciągu dnia.
MicroChIP (µChIP): chromatyna jest zwykle przygotowywana z 1000 komórek, a do 8 ChIP można wykonać równolegle bez nośników. Test może również rozpocząć się od 100 komórek, ale pasuje tylko do jednego ChIP. Może również wykorzystywać biopsje małych (1 mm ³ ) tkanek, a microChIP można wykonać w ciągu jednego dnia.
Matrix ChIP : Jest to test ChIP oparty na mikropłytkach o zwiększonej wydajności i uproszczonej procedurze. Wszystkie etapy są wykonywane w studzienkach mikropłytek bez przenoszenia próbek, co umożliwia automatyzację. Umożliwia wykonanie 96 testów ChIP dla histonów i różnych białek związanych z DNA w ciągu jednego dnia.
Pathology-ChIP (PAT-ChIP): Ta technika umożliwia ChIP z tkanek patologicznych utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie, a tym samym na wykorzystanie archiwów patologicznych (nawet tych, które mają kilka lat) do analiz epigenetycznych i identyfikacji potencjalnych biomarkerów epigenetycznych lub cele.

ChIP został również zastosowany do analizy całego genomu poprzez połączenie z technologią mikromacierzy ( ChIP-on-chip ) lub technologią sekwencjonowania DNA drugiej generacji ( Chip-Sequencing ). ChIP może również łączyć się z sekwencjonowaniem paired-end tags w analizie interakcji chromatyny przy użyciu sekwencjonowania Paired End Tag (ChIA-PET), techniki opracowanej do wielkoskalowej analizy de novo struktur chromatyny wyższego rzędu.

Ograniczenia

Testy na dużą skalę z wykorzystaniem ChIP są trudne przy użyciu nienaruszonych organizmów modelowych. Dzieje się tak dlatego, że przeciwciała muszą być wytworzone dla każdego TF lub, alternatywnie, muszą być wytworzone transgeniczne organizmy modelowe eksprymujące TF znakowane epitopem.
Naukowcy badający zróżnicowane wzorce ekspresji genów w małych organizmach również napotykają problemy, ponieważ geny ulegają ekspresji na niskim poziomie, w niewielkiej liczbie komórek, w wąskim oknie czasowym.
Eksperymenty z ChIP nie mogą rozróżniać różnych izoform TF ( izoformy białka ).

Zobacz też

ChIP-exo , technika, która dodaje obróbkę egzonukleazą do procesu ChIP w celu uzyskania rozdzielczości miejsc wiązania do pojedynczej pary zasad
ChIP-on-chip , łączy ChIP z technologią mikromacierzy
DamID , alternatywna technika mapowania lokalizacji, która nie wymaga specyficznych przeciwciał
RIP-Chip , podobna technika do analizy interakcji RNA-białko

Languages

In other projects