Agaroza - Agarose
.jpg)
Agaroza jest polisacharydem , na ogół ekstrahowanym z niektórych czerwonych wodorostów . Jest to liniowy polimer składający się z powtarzającej się jednostki agarobiozy, która jest disacharydem złożonym z D- galaktozy i 3,6-anhydro- L -galaktopiranozy . Agaroza jest jednym z dwóch głównych składników agaru i jest oczyszczana z agaru poprzez usunięcie drugiego składnika agaropektyny .
Agaroza jest często stosowana w biologii molekularnej do rozdzielania dużych cząsteczek, zwłaszcza DNA , metodą elektroforezy . Płytki żeli agarozowych (zwykle 0,7 - 2%) do elektroforezy można łatwo przygotować przez wlanie ciepłego, płynnego roztworu do formy. W tym celu komercyjnie dostępny jest szeroki zakres różnych agaroz o różnych masach cząsteczkowych i właściwościach. Agarozę można również formować w kulki i stosować w wielu metodach chromatograficznych do oczyszczania białek .
Struktura
Agaroza jest liniowym polimerem o masie cząsteczkowej około 120 000, składającym się naprzemiennie z D - galaktozy i 3,6-anhydro- L -galaktopiranozy połączonych wiązaniami glikozydowymi α-(1→3) i β-(1→4). 3,6-anhydro- L -galaktopiranoza jest L- galaktozą z mostkiem bezwodnym między pozycjami 3 i 6, chociaż niektóre jednostki L- galaktozy w polimerze mogą nie zawierać mostka. Niektóre jednostki D- galaktozy i L- galaktozy mogą być metylowane , aw niewielkich ilościach występują również pirogronian i siarczan .
Każdy łańcuch agarozowy zawiera ~800 cząsteczek galaktozy, a łańcuchy polimeru agarozowego tworzą spiralne włókna, które agregują w superskręconą strukturę o promieniu 20-30 nm . Włókna są quasi-sztywne i mają szeroki zakres długości w zależności od stężenia agarozy. Po zestaleniu włókna tworzą trójwymiarową siatkę kanalików o średnicy od 50 nm do >200 nm w zależności od stężenia użytej agarozy - wyższe stężenia dają mniejsze średnie średnice porów. Struktura 3-D jest utrzymywana razem z wiązaniami wodorowymi i dlatego może zostać przerwana przez ponowne ogrzanie do stanu ciekłego.
Nieruchomości
Agaroza jest dostępna w postaci białego proszku, który rozpuszcza się w prawie wrzącej wodzie i po ostygnięciu tworzy żel. Agaroza wykazuje zjawisko histerezy termicznej w przejściu ciecz-żel, tj. żeluje i topi się w różnych temperaturach. Temperatury żelowania i topnienia różnią się w zależności od rodzaju agarozy. Standardowe agarozy pochodzące z Gelidium mają temperaturę żelowania 34–38 °C (93–100 °F) i temperaturę topnienia 90–95 °C (194–203 °F), podczas gdy te pochodzące z Gracilaria , ze względu na wyższą podstawniki metoksy , ma temperaturę żelowania 40-52 °C (104-126 °F) i temperaturę topnienia 85-90 °C (185-194 °F). Temperatury topnienia i żelowania mogą zależeć od stężenia żelu, szczególnie przy niskim stężeniu żelu, mniejszym niż 1%. Temperatury żelowania i topnienia są zatem podane przy określonym stężeniu agarozy.
Naturalna agaroza zawiera nienaładowane grupy metylowe, a stopień metylacji jest wprost proporcjonalny do temperatury żelowania. Syntetyczna metylacja ma jednak odwrotny skutek, przez co zwiększona metylacja obniża temperaturę żelowania. Różne chemicznie modyfikowane agarozy o różnych temperaturach topnienia i żelowania są dostępne poprzez modyfikacje chemiczne.
Agaroza w żelu tworzy siatkę zawierającą pory, a wielkość porów zależy od stężenia dodanej agarozy. Po odstawieniu żele agarozowe są podatne na synerezę (wytłaczanie wody przez powierzchnię żelu), ale proces ten jest na tyle powolny, że nie przeszkadza w stosowaniu żelu.
Żel agarozowy może mieć wysoką siłę żelowania przy niskim stężeniu, dzięki czemu nadaje się jako środek antykonwekcyjny do elektroforezy żelowej . Żele agarozowe tak rozcieńczone jak 0,15% mogą tworzyć płytki do elektroforezy żelowej. Polimer agarozowy zawiera naładowane grupy, w szczególności pirogronian i siarczan . Te ujemnie naładowane grupy mogą spowolnić ruch cząsteczek DNA w procesie zwanym elektroendosmozą (EEO), dlatego agaroza o niskim EEO jest ogólnie preferowana do stosowania w elektroforezie kwasów nukleinowych w żelu agarozowym . Dostępne są również agarozy zero EEO, ale mogą one być niepożądane w niektórych zastosowaniach, ponieważ mogą być wytwarzane przez dodanie dodatnio naładowanych grup, które mogą wpływać na późniejsze reakcje enzymatyczne. Elektroendosmoza jest powodem, dla którego agaroza jest stosowana preferencyjnie w stosunku do agaru, ponieważ agaropektyna w agarze zawiera znaczną ilość ujemnie naładowanych grup siarczanowych i karboksylowych. Usunięcie agaropektyny z agarozy znacznie zmniejsza EEO, a także zmniejsza niespecyficzną adsorpcję biocząsteczek na matrycy żelowej. Jednak w przypadku niektórych zastosowań, takich jak elektroforeza białka surowicy, może być pożądany wysoki EEO i do stosowanego żelu może być dodana agaropektyna.
Agarozy o niskiej temperaturze topnienia i żelowania
Temperatury topnienia i żelowania agarozy mogą być modyfikowane przez modyfikacje chemiczne, najczęściej przez hydroksyetylowanie, co zmniejsza liczbę wewnątrzniciowych wiązań wodorowych, co skutkuje niższymi temperaturami topnienia i wiązania niż w przypadku standardowych agaroz. Dokładna temperatura zależy od stopnia podstawienia, a wiele dostępnych agar o niskiej temperaturze topnienia (LMP) może pozostawać w stanie płynnym w zakresie 30–35 °C (86–95 °F). Ta właściwość umożliwia przeprowadzenie manipulacji enzymatycznych bezpośrednio po elektroforezie na żelu DNA przez dodanie do mieszaniny reakcyjnej skrawków stopionego żelu zawierającego interesujący fragment DNA. Agaroza LMP zawiera mniej siarczanów, które mogą wpływać na niektóre reakcje enzymatyczne i dlatego jest korzystnie używana do niektórych zastosowań. Hydroksyetylacja może zmniejszyć wielkość porów poprzez zmniejszenie gęstości upakowania wiązek agarozowych, dlatego żel LMP może mieć również wpływ na czas i rozdział podczas elektroforezy. Agarozy o bardzo niskiej temperaturze topnienia lub żelowania mogą żelować tylko w temperaturze 8–15°C (46–59°F).
Aplikacje
Agaroza jest preferowaną matrycą do pracy z białkami i kwasami nukleinowymi, ponieważ ma szeroki zakres stabilności fizycznej, chemicznej i termicznej, a jej niższy stopień złożoności chemicznej sprawia, że jest mniej podatna na interakcje z biocząsteczkami . Agaroza jest najczęściej używana jako podłoże do rozdziału elektroforetycznego w skali analitycznej w elektroforezie w żelu agarozowym . Żele wytworzone z oczyszczonej agarozy mają stosunkowo duże rozmiary porów, co czyni je przydatnymi do rozdzielania dużych cząsteczek, takich jak białka i kompleksy białkowe >200 kilodaltonów, a także fragmentów DNA >100 par zasad. Agaroza jest również szeroko stosowana w wielu innych zastosowaniach, na przykład w immunodyfuzji i immunoelektroforezie , ponieważ włókna agarozy działają jako kotwica dla kompleksów immunologicznych .
Elektroforeza w żelu agarozowym
Elektroforeza w żelu agarozowym to rutynowa metoda rozdzielania DNA w laboratorium. Żele agarozowe zostały niższy rozdzielcza dla DNA niż żelach akrylamidowych, ale mają większy zakres rozdzielania, a w związku z tym zazwyczaj stosuje się do fragmentów DNA o długości 50-20,000 bp ( par zasad ), chociaż rozdzielczość ponad 6 Mb jest możliwe impulsowo polowa elektroforeza żelowa (PFGE). Może być również stosowany do rozdzielania dużych cząsteczek białka i jest preferowaną matrycą do elektroforezy żelowej cząstek o efektywnych promieniach większych niż 5-10 nm.
Wielkość porów żelu wpływa na wielkość DNA, które można przesiać. Im niższe stężenie żelu, tym większy rozmiar porów i większe DNA, które można przesiać. Jednak żele o niskim stężeniu (0,1 - 0,2%) są kruche i dlatego trudne w obsłudze, a elektroforeza dużych cząsteczek DNA może zająć kilka dni. Granica rozdzielczości dla standardowej elektroforezy w żelu agarozowym wynosi około 750 kb. Ograniczenie to można pokonać dzięki PFGE, w którym do żelu przykładane są naprzemienne ortogonalne pola elektryczne. Fragmenty DNA zmieniają orientację, gdy przyłożone pole zmienia kierunek, ale większe cząsteczki DNA potrzebują więcej czasu, aby wyrównać się, gdy zmienia się pole elektryczne, podczas gdy w przypadku mniejszych jest to szybsze, a zatem DNA można frakcjonować zgodnie z rozmiarem.
Żele agarozowe są odlewane w formie, a po zestaleniu zwykle są zanurzane poziomo w roztworze buforowym. Powszechnie stosowane są bufory Tris-octan-EDTA i Tris-boran-EDTA , ale inne bufory, takie jak Tris-fosforan, kwas barbiturowy-barbituran sodu lub Tris- barbituran mogą być używane w innych zastosowaniach. DNA jest zwykle wizualizowane przez barwienie bromkiem etydyny, a następnie oglądane w świetle UV , ale dostępne są inne metody barwienia, takie jak SYBR Green , GelRed , błękit metylenowy i fiolet krystaliczny . Jeśli oddzielone fragmenty DNA są potrzebne do dalszych eksperymentów, można je wyciąć z żelu na plasterki do dalszej manipulacji.
Oczyszczanie białek
Matryca z żelu agarozowego jest często używana do oczyszczania białek , na przykład, w preparatywnej separacji na skalę kolumnową , jak w chromatografii żelowej, chromatografii powinowactwa i chromatografii jonowymiennej . Nie jest jednak stosowany jako ciągły żel, lecz jest formowany w porowate kulki lub żywice o różnym stopniu rozdrobnienia. Kulki są bardzo porowate, dzięki czemu białko może swobodnie przepływać przez kulki. Te kulki na bazie agarozy są na ogół miękkie i łatwo się kruszą, dlatego należy je stosować w procedurach grawitacyjnych, wirowania z małą prędkością lub pod niskim ciśnieniem. Wytrzymałość żywic można poprawić poprzez zwiększone sieciowanie i chemiczne utwardzanie żywic agarozowych, jednak takie zmiany mogą również skutkować niższą zdolnością wiązania białka w niektórych procedurach rozdzielania, takich jak chromatografia powinowactwa .
Agaroza jest użytecznym materiałem do chromatografii, ponieważ nie absorbuje w znaczącym stopniu biocząsteczek, ma dobre właściwości płynięcia i może tolerować ekstremalne pH i siłę jonową, a także wysokie stężenie denaturantów, takich jak 8M mocznik lub 6M chlorowodorek guanidyny . Przykładami matrycy na bazie agarozy do chromatografii żelowej są Sepharose i WorkBeads 40 SEC (usieciowana agaroza z perełkami), Praesto i Superose (wysoce usieciowane agarozy z perełkami) oraz Superdex ( dekstran kowalencyjnie związany z agarozą).
Do chromatografii powinowactwa, agaroza z perełkami jest najczęściej stosowaną żywicą matrycową do przyłączania ligandów wiążących białko. Ligandy są połączone kowalencyjnie przez odstępnik z aktywowanymi grupami hydroksylowymi polimeru perełek agarozowych. Białka będące przedmiotem zainteresowania można następnie selektywnie wiązać z ligandami w celu oddzielenia ich od innych białek, po czym można je eluować. Stosowane kulki agarozowe mają zazwyczaj gęstość 4% i 6% z wysoką zdolnością wiązania białka.
Stałe podłoża hodowlane
Płytka agarozowa może czasami być używana zamiast agaru do hodowli organizmów, ponieważ agar może zawierać zanieczyszczenia, które mogą wpływać na wzrost organizmu lub niektóre późniejsze procedury, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR). Agaroza jest również twardsza niż agar i dlatego może być preferowana tam, gdzie konieczna jest większa siła żelowania, a jej niższa temperatura żelowania może zapobiegać wywołaniu szoku termicznego w organizmie, gdy komórki są zawieszone w płynie przed żelowaniem. Może być stosowany do hodowli bakterii ściśle autotroficznych, protoplastów roślinnych , Caenorhabditis elegans , innych organizmów oraz różnych linii komórkowych.
Kultura komórkowa 3D
Agaroza jest często używany jako podpora dla trójwymiarowej hodowli ludzkich i zwierzęcych komórek . Ponieważ agaroza tworzy hydrożele niecytotoksyczne , może być wykorzystana do odtworzenia naturalnego środowiska komórek w ludzkim ciele, macierzy zewnątrzkomórkowej . Jednak agaroza tworzy sztywny obojętny hydrożel , który nie zawiera żadnych informacji biologicznych, przez co komórki ludzkie i zwierzęce nie mogą przylegać do polisacharydu . Ze względu na te specyficzne właściwości hydrożel agarozowy naśladuje naturalne środowisko komórek chrząstki i wykazano, że wspomaga różnicowanie chondrocytów w chrząstkę . W celu zmodyfikowania właściwości mechanicznych agarozy w celu odtworzenia naturalnego środowiska innych komórek ludzkich, agaroza może być modyfikowana chemicznie poprzez precyzyjne utlenianie pierwszorzędowego alkoholu D- galaktozy do kwasu karboksylowego . Ta chemiczna modyfikacja zapewnia nową klasę materiałów o nazwie karboksylowana agaroza. Poprzez kontrolę liczby karboksylowanej D-galaktozy na szkielecie polisacharydowym można precyzyjnie kontrolować właściwości mechaniczne powstałego hydrożelu. Te karboksylowane hydrożele agarozowe można następnie wiązać kowalencyjnie z peptydami, tworząc hydrożel, do którego mogą przylegać komórki. Wykazano, że te karboksylowane hydrożele agarozowe kierują organizacją ludzkich komórek śródbłonka w spolaryzowane światła. Mieszanie w pełni karboksylowanej agarozy z naturalną agarozą może być wykorzystane do wytworzenia hydrożeli o szerokim zakresie właściwości mechanicznych.
Testy ruchliwości
Agaroza jest czasami używana zamiast agaru do pomiaru ruchliwości i mobilności mikroorganizmów. Gatunki ruchliwe będą w stanie migrować, aczkolwiek powoli, przez porowaty żel, co umożliwi wizualizację szybkości infiltracji. Porowatość żelu jest bezpośrednio związana ze stężeniem agaru lub agarozy w pożywce, dlatego żele o różnym stężeniu mogą być używane do oceny pływania , rojenia , poślizgu i drgania komórek . Do pomiaru chemotaksji i chemokinezy można zastosować test migracji komórek pod agarozą. Warstwę żelu agarozowego umieszcza się pomiędzy populacją komórek a chemoatraktantem . Ponieważ gradient stężenia rozwija się z dyfuzji chemoatraktantu do żelu, różne populacje komórek wymagające różnych poziomów stymulacji do migracji mogą być następnie wizualizowane w czasie za pomocą mikrofotografii, gdy przechodzą one w górę przez żel przeciw grawitacji wzdłuż gradientu.