Jednostka tworząca kolonie - Colony-forming unit

Dla ludzkiej komórki krwiotwórczej, patrz Hematopoetyczna komórka macierzysta .

Jednostka tworząca kolonie ( CFU, cfu, Cfu ) to jednostka stosowana w mikrobiologii do oszacowania liczby żywotnych bakterii lub komórek grzybów w próbce. Żywotność definiuje się jako zdolność do namnażania się poprzez rozszczepienie binarne w kontrolowanych warunkach. Liczenie za pomocą jednostek tworzących kolonie wymaga hodowli drobnoustrojów i liczenia tylko żywych komórek, w przeciwieństwie do badania mikroskopowego, które zlicza wszystkie komórki, żywe lub martwe. Wizualny wygląd kolonii w hodowli komórkowej wymaga znacznego wzrostu, a przy liczeniu kolonii nie ma pewności, czy kolonia powstała z jednej komórki, czy z grupy komórek. Wyrażanie wyników jako jednostek tworzących kolonie odzwierciedla tę niepewność.

Teoria

Rozcieńczenie wykonane z bakterii peptoned wody jest umieszczony w płytce agarowej ( pożywką agarową do próbki żywności lub Trypticase agarze sojowym dla próbek klinicznych) i rozmieszczonych w płytce poprzez przechylenie w pokazanej.

Celem zliczania płytek jest oszacowanie liczby obecnych komórek na podstawie ich zdolności do tworzenia kolonii w określonych warunkach pożywki, temperatury i czasu. Teoretycznie jedna żywotna komórka może dać początek kolonii poprzez replikację. Jednak pojedyncze komórki są z natury wyjątkiem i najprawdopodobniej przodkiem kolonii była masa komórek zdeponowanych razem. Ponadto wiele bakterii rozwija się w łańcuchach (np. Streptococcus ) lub w skupiskach (np. Staphylococcus ). Szacowanie liczby drobnoustrojów za pomocą CFU w większości przypadków zaniża liczbę żywych komórek obecnych w próbce z tych powodów. Dzieje się tak, ponieważ liczenie CFU zakłada, że ​​każda kolonia jest oddzielna i założona przez pojedynczą żywotną komórkę drobnoustroju.

Liczba płytek jest liniowa dla E. coli w zakresie od 30 do 300 CFU na szalce Petriego o standardowej wielkości . Dlatego, aby mieć pewność, że próbka da CFU w tym zakresie, konieczne jest rozcieńczenie próbki i kilkakrotne wysianie na płytce. Zazwyczaj stosuje się dziesięciokrotne rozcieńczenia, a serie rozcieńczeń wysiewa się w powtórzeniach po 2 lub 3 w wybranym zakresie rozcieńczeń. Często powleka się 100 µl, ale stosuje się również większe ilości do 1 ml. Większe objętości powlekania wydłużają czas suszenia, ale często nie zapewniają większej dokładności, ponieważ mogą być potrzebne dodatkowe etapy rozcieńczania. CFU/płytkę odczytuje się z płytki w zakresie liniowym, a następnie oblicza się matematycznie CFU/g (lub CFU/ml) oryginału, biorąc pod uwagę ilość na płytce i jej współczynnik rozcieńczenia (np. CLSI VET01S ).

Roztwór bakterii o nieznanym stężeniu jest często seryjnie rozcieńczany w celu uzyskania co najmniej jednej płytki z policzalną liczbą bakterii. Na tym rysunku płytka „x10” nadaje się do liczenia.

Zaletą tej metody jest to, że różne gatunki drobnoustrojów mogą powodować powstawanie kolonii, które wyraźnie różnią się od siebie, zarówno mikroskopowo , jak i makroskopowo . Morfologia kolonii mogą być bardzo przydatne w identyfikacji obecnych mikroorganizmów.

Wcześniejsze zrozumienie mikroskopowej anatomii organizmu może dać lepsze zrozumienie, w jaki sposób obserwowane CFU/ml odnosi się do liczby żywych komórek na mililitr. Alternatywnie możliwe jest w niektórych przypadkach zmniejszenie średniej liczby komórek na CFU przez worteksowanie próbki przed przeprowadzeniem rozcieńczenia. Jednak wiele drobnoustrojów jest delikatnych i po umieszczeniu ich w wirze zmniejszy się proporcja żywych komórek.

Notacja dziennika

Stężenia jednostek tworzących kolonie można wyrazić za pomocą notacji logarytmicznej, gdzie pokazana wartość jest logarytmem o podstawie 10 stężenia. Pozwala to na zmniejszenie dziennika z procesu dekontaminacji być obliczana jako prostego odejmowania.

Zastosowania

Jednostki tworzące kolonie są używane do ilościowego określania wyników w wielu mikrobiologicznych metodach posiewu i liczenia, w tym:

  • Metoda Pour Plate, w której próbkę zawiesza się na szalce Petriego przy użyciu stopionego agaru schłodzonego do około 40-45°C (tuż powyżej punktu zestalenia, aby zminimalizować śmierć komórek wywołaną ciepłem). Po zestaleniu się agaru odżywczego płytkę inkubuje się.
  • Metoda Spread Plate, w której próbkę (w małej objętości) rozprowadza się na powierzchni płytki z agarem odżywczym i pozostawia do wyschnięcia przed inkubacją w celu zliczenia.
  • Metoda filtra membranowego, w której próbka jest filtrowana przez filtr membranowy, a następnie filtr umieszczany na powierzchni płytki z agarem odżywczym (stroną bakteryjną do góry). Podczas inkubacji składniki odżywcze wypłukują się przez filtr, wspierając rosnące komórki. Ponieważ powierzchnia większości filtrów jest mniejsza niż standardowej szalki Petriego, liniowy zakres liczby płytek będzie mniejszy.
  • Metody Milesa i Misra lub metoda płytki kroplowej, w której bardzo małą porcję (zwykle około 10 mikrolitrów) próbki z każdego rozcieńczenia w serii wkrapla się na szalkę Petriego. Szalka z kroplami musi być odczytana, gdy kolonie są bardzo małe, aby zapobiec utracie CFU podczas ich wspólnego wzrostu.

Jednak w przypadku technik, które wymagają użycia płytki agarowej, nie można użyć roztworu płynu, ponieważ czystość próbki nie może być niezidentyfikowana i nie jest możliwe zliczenie komórek w płynie jedna po drugiej.

Narzędzia do liczenia kolonii

Tradycyjny sposób wyliczania CFU za pomocą „licznika kliknięć” i długopisu. Gdy kolonie są zbyt liczne, powszechną praktyką jest liczenie CFU tylko na ułamku naczynia.

Liczenie kolonii jest tradycyjnie wykonywane ręcznie za pomocą pisaka i licznika kliknięć. Jest to na ogół proste zadanie, ale może stać się bardzo pracochłonne i czasochłonne, gdy trzeba wyliczyć wiele tabliczek. Alternatywnie można zastosować rozwiązania półautomatyczne (oprogramowanie) i automatyczne (sprzęt + oprogramowanie).

Oprogramowanie do liczenia CFU

Kolonie można policzyć na podstawie zdjęć płytek za pomocą narzędzi programowych. Eksperymentatorzy zazwyczaj robili zdjęcie każdej płytki, którą muszą policzyć, a następnie analizowali wszystkie zdjęcia (można to zrobić prostym aparatem cyfrowym lub nawet kamerą internetową). Ponieważ wykonanie pojedynczego zdjęcia zajmuje mniej niż 10 sekund, w przeciwieństwie do kilku minut na ręczne zliczenie CFU, to podejście generalnie oszczędza dużo czasu. Ponadto jest bardziej obiektywny i umożliwia ekstrakcję innych zmiennych, takich jak wielkość i kolor kolonii.

  • OpenCFU [1] to darmowy program o otwartym kodzie źródłowym zaprojektowany w celu optymalizacji przyjazności dla użytkownika, szybkości i niezawodności. Oferuje szeroką gamę filtrów i kontroli oraz nowoczesny interfejs użytkownika. OpenCFU jest napisany w C++ i używa OpenCV do analizy obrazu.
  • NICE to program napisany w MATLAB, który zapewnia łatwy sposób zliczania kolonii z obrazów.
  • ImageJ i CellProfiler : Niektóre makra i wtyczki ImageJ oraz niektóre potoki CellProfiler mogą być używane do zliczania kolonii. Często wymaga to od użytkownika zmiany kodu w celu osiągnięcia wydajnego przepływu pracy, ale może okazać się przydatne i elastyczne. Jednym z głównych problemów jest brak konkretnego GUI, który może utrudniać interakcję z algorytmami przetwarzania.

Oprócz oprogramowania opartego na tradycyjnych komputerach stacjonarnych, dostępne są aplikacje na urządzenia z systemem Android i iOS do półautomatycznego i automatycznego liczenia kolonii. Zintegrowana kamera służy do robienia zdjęć płytki agarowej, a wewnętrzny lub zewnętrzny algorytm jest używany do przetwarzania danych obrazu i oszacowania liczby kolonii.

Systemy zautomatyzowane

Wiele zautomatyzowanych systemów służy do przeciwdziałania błędom ludzkim, ponieważ wiele technik badawczych wykonywanych przez ludzi liczących poszczególne komórki wiąże się z dużym prawdopodobieństwem wystąpienia błędu. Ze względu na to, że badacze regularnie ręcznie liczą komórki za pomocą światła przechodzącego, ta podatna na błędy technika może mieć znaczący wpływ na obliczone stężenie w głównym płynnym ośrodku, gdy komórek jest mało.

Automatyczny licznik kolonii wykorzystujący przetwarzanie obrazu.

Całkowicie zautomatyzowane systemy są również dostępne u niektórych producentów biotechnologicznych. Są one na ogół drogie i nie tak elastyczne jak samodzielne oprogramowanie, ponieważ sprzęt i oprogramowanie są zaprojektowane do współpracy w określonej konfiguracji. Alternatywnie, niektóre systemy automatyczne wykorzystują paradygmat powlekania spiralnego .

Niektóre z zautomatyzowanych systemów, takie jak systemy firmy MATLAB, umożliwiają zliczanie komórek bez konieczności ich barwienia. Pozwala to na ponowne wykorzystanie kolonii do innych eksperymentów bez ryzyka zabicia mikroorganizmów plamami. Jednak wadą tych zautomatyzowanych systemów jest to, że niezwykle trudno jest odróżnić mikroorganizmy z kurzem lub zadrapaniami na płytkach z agarem z krwią, ponieważ zarówno kurz, jak i zadrapania mogą tworzyć bardzo zróżnicowaną kombinację kształtów i wyglądu.

Jednostki alternatywne

Zamiast jednostek tworzących kolonie można użyć parametrów Najbardziej prawdopodobna liczba (MPN) i Zmodyfikowane jednostki rybomana (MFU). Metoda najbardziej prawdopodobnej liczby zlicza żywe komórki i jest przydatna podczas zliczania niskich stężeń komórek lub zliczania drobnoustrojów w produktach, w których cząstki stałe sprawiają, że liczenie na płytkach jest niepraktyczne. Zmodyfikowane jednostki Fishman uwzględniają bakterie, które są żywotne, ale nie nadają się do hodowli.

Zobacz też

Bibliografia

Dalsza lektura