Kierowanie na geny - Gene targeting

Chimeryczny gen myszy skierowane do agouti genu koloru płaszcz z jej potomstwo

Kierowanie do genu (także strategia zastępowania oparta na rekombinacji homologicznej ) to technika genetyczna , która wykorzystuje rekombinację homologiczną do modyfikacji genu endogennego . Metodę można wykorzystać do usunięcia genu, usunięcia eksonów , dodania genu i modyfikacji poszczególnych par zasad (wprowadzania mutacji punktowych ). Kierowanie na gen może być stałe lub warunkowe. Warunkiem może być np. określony czas rozwoju /życia organizmu lub ograniczenie do określonej tkanki . Kierowanie genowe wymaga stworzenia specyficznego wektora dla każdego interesującego genu. Można go jednak stosować do dowolnego genu, niezależnie od aktywności transkrypcyjnej lub wielkości genu.

Metody

Ogólnie, w bakteriach składa się DNA zawierający część genu będącego celem, gen reporterowy i (dominujący) marker selekcyjny .

Metody celowania w geny są ustalone dla kilku organizmów modelowych i mogą się różnić w zależności od użytego gatunku . Aby celować w geny myszy , DNA wstawia się do hodowli zarodkowych komórek macierzystych myszy . Komórki z insercją mogą przyczynić się do tkanki myszy poprzez wstrzyknięcie zarodka . Wreszcie, hodowane są myszy chimeryczne, w których zmodyfikowane komórki tworzą narządy rozrodcze . Po tym etapie całe ciało myszy jest oparte na wybranej embrionalnej komórce macierzystej.

Physcomitrella typu dzikiego i mchy z nokautem : Odmienne fenotypy indukowane w transformantach z zaburzoną biblioteką genów. Physcomitrella typu dzikiego i rośliny transformowane hodowano na pożywce minimalnej Knopa w celu indukowania różnicowania i rozwoju gametoforów . Dla każdej rośliny pokazany jest przegląd (górny rząd, podziałka odpowiada 1 mm) i zbliżenie (dolny rząd, podziałka odpowiada 0,5 mm). A, Haploidalna roślina mchu typu dzikiego całkowicie pokryta ulistnionymi gametoforami i zbliżeniem liścia typu dzikiego. BD, różne mutanty.

Aby ukierunkować geny w mchu , DNA inkubuje się razem ze świeżo wyizolowanymi protoplastami iz glikolem polietylenowym . Ponieważ mchy są organizmami haploidalnymi , włókna mchu ( splątek ) można bezpośrednio przeszukiwać pod kątem celu za pomocą leczenia antybiotykami lub PCR . Ta unikalna wśród roślin procedura odwrotnej genetyki jest tak samo wydajna jak w przypadku drożdży . Celowanie genowe zostało z powodzeniem zastosowane w przypadku bydła, owiec, świń i wielu grzybów.

Częstość celowania w gen można znacznie zwiększyć poprzez zastosowanie zmodyfikowanych endonukleaz , takich jak nukleazy palca cynkowego , zmodyfikowane endonukleazy zasiedlające oraz nukleazy oparte na zmodyfikowanych efektorach TAL . Metoda ta została zastosowana do gatunków takich jak Drosophila melanogaster , tytoń , kukurydza , komórki ludzkie , myszy i szczury .

Porównanie z pułapkowaniem genów

Pułapkowanie genów opiera się na losowym wstawieniu kasety, podczas gdy celowanie genowe manipuluje określonym genem. Kasety mogą być używane do wielu różnych rzeczy, podczas gdy flankujące regiony homologii kaset ukierunkowujących geny muszą być przystosowane do każdego genu. To sprawia, że ​​pułapkowanie genów jest łatwiejsze w przypadku projektów na dużą skalę niż ukierunkowanie. Z drugiej strony, celowanie genowe może być stosowane w przypadku genów o niskiej transkrypcji, które nie zostałyby wykryte w przeszukiwaniu pułapek. Prawdopodobieństwo schwytania wzrasta wraz z rozmiarem intronu , podczas gdy w przypadku kierowania genów małe geny są równie łatwo zmieniane.

Aplikacje

Celowanie genowe jest szeroko stosowane do badania ludzkich chorób genetycznych poprzez usuwanie („ knock out ”) lub dodawanie („knock in”) określonych mutacji będących przedmiotem zainteresowania. Postępy w technologiach celowania genowego, wykorzystywane wcześniej do projektowania modeli komórek szczura, umożliwiają powstanie nowej fali modeli izogenicznych chorób ludzkich . Modele te są najdokładniejszymi modelami in vitro dostępnymi dla naukowców i ułatwiają opracowywanie spersonalizowanych leków i diagnostyki, zwłaszcza w onkologii .

Nagroda Nobla 2007

Mario R. Capecchi , Martin J. Evans i Oliver Smithies otrzymali w 2007 r. Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny za pracę nad „zasadami wprowadzania określonych modyfikacji genów u myszy za pomocą embrionalnych komórek macierzystych” lub ukierunkowania genów.

Zobacz też

Bibliografia

Zewnętrzne linki