Immunoelektroforeza - Immunoelectrophoresis

Krzyżowana immunoelektroforeza 2 mikrolitrów normalnej ludzkiej surowicy. Elektroforezę przeprowadzono w cienkich warstwach agarozy, na zdjęciu żel ma wymiary około 7x7 cm. Dolna część to żel pierwszego wymiaru bez przeciwciał, gdzie surowica została nałożona do szczeliny w lewym dolnym rogu. Górna część to żel drugiego wymiaru z przeciwciałami Dako przeciwko ludzkim białkom surowicy. Można wymienić ponad 50 głównych białek surowicy.
Fuzyjna immunoelektroforeza rakietowa polegająca na rozdzielaniu chromatograficznym powinowactwa białek surowicy ludzkiej na con A . Nanosi się 15 mikrolitrową próbkę z każdej frakcji (zaczynając od lewej) i pozostawia do dyfuzji przez około godzinę, następnie elektroforezę przeprowadza się przez noc. Pik „a” jest niezatrzymany, pik „b” jest zachowany i eluowany metylomannozą, strzałka wskazuje nieco zatrzymane białka.

Immunoelektroforeza to ogólna nazwa szeregu biochemicznych metod rozdziału i charakteryzacji białek opartych na elektroforezie i reakcji z przeciwciałami . Wszystkie warianty immunoelektroforezy wymagają immunoglobulin , zwanych również przeciwciałami , reagujących z białkami, które mają być oddzielone lub scharakteryzowane. Metody zostały opracowane i szeroko stosowane w drugiej połowie XX wieku. W porządku chronologicznym: analiza immunoelektroforetyczna (jednowymiarowa immunoelektroforeza ad modum Grabar), immunoelektroforeza krzyżowa (dwuwymiarowa immunoelektroforeza ilościowa ad modum Clarke i Freeman lub ad modum Laurell), immunoelektroforeza rakietowa (jednowymiarowa immunoelektroforeza ilościowa ad modum Laurell), fuzyjna immunoelektroforeza rakietowa ad modum Svendsen i Harboe, immunoelektroforeza powinowactwa ad modum Bøg-Hansen.

metoda

Elektroforeza analizuje białko M w surowicy i moczu. Dwie główne zasady immunoelektroforezy to elektroforeza strefowa i immunodyfuzja. Agaroza w postaci 1% płyt żelowych o grubości około 1 mm, zbuforowana przy wysokim pH (około 8,6) jest tradycyjnie preferowana do elektroforezy i reakcji z przeciwciałami. Agaroza została wybrana jako macierz żelowa, ponieważ ma duże pory umożliwiające swobodne przejście i rozdzielanie białek, ale stanowi kotwicę dla immunoprecypitatów białek i swoistych przeciwciał. Wybrano wysokie pH, ponieważ przeciwciała są praktycznie nieruchome w wysokim pH. Zwykle do elektroforezy zalecany jest sprzęt do elektroforezy z poziomą płytą chłodzącą.

Immunoprecypitaty mogą być widoczne w mokrym żelu agarozowym, ale są wybarwione barwnikami białkowymi, takimi jak Coomassie Brilliant Blue w wysuszonym żelu. W przeciwieństwie do elektroforezy w żelu SDS , elektroforeza w agarozie pozwala na zachowanie natywnych warunków, zachowując natywną strukturę i aktywność badanych białek, dlatego immunoelektroforeza umożliwia scharakteryzowanie aktywności enzymów i wiązania ligandów itp. oprócz rozdziału elektroforetycznego.

Immunoelectrophoretic analizy ad modum Grabar jest klasyczną metodą immunoelektroforezy. Białka są rozdzielane przez elektroforezę, następnie przeciwciała są nakładane w rynnie obok rozdzielonych białek i powstają immunoprecypitaty po okresie dyfuzji rozdzielonych białek i przeciwciał przeciwko sobie. Wprowadzenie analizy immunoelektroforetycznej dało ogromny impuls do chemii białek, jednymi z pierwszych wyników było rozdzielenie białek w płynach biologicznych i ekstraktach biologicznych. Wśród ważnych obserwacji poczyniono dużą liczbę różnych białek w surowicy, istnienie kilku klas immunoglobulin i ich heterogeniczność elektroforetyczną.

Plasmodium dehydrogenaza glutaminianowa (pGluDH) oddzielone Counterimmunoelectrophoresis

Immunoelektroforeza krzyżowa nazywana jest również dwuwymiarową immunoelektroforezą ilościową ad modum Clarke'a i Freemana lub ad modum Laurell. W tej metodzie białka są najpierw rozdzielane podczas elektroforezy pierwszego wymiaru, a następnie zamiast dyfuzji w kierunku przeciwciał, białka są poddawane elektroforezie w żelu zawierającym przeciwciała w drugim wymiarze. Immunoprecypitacja będzie miała miejsce podczas elektrofory w drugim wymiarze, a immunoprecypitaty mają charakterystyczny kształt dzwonu, każdy osad reprezentuje jeden antygen, a pozycja osadu zależy od ilości białka, a także ilości specyficznego przeciwciała w żelu, więc można przeprowadzić względną kwantyfikację. Czułość i zdolność rozdzielcza krzyżowej immunoelektroforezy jest taka, jak w klasycznej analizie immunoelektroforetycznej i istnieje wiele odmian tej techniki przydatnej do różnych celów. Krzyżowa immunoelektroforeza została wykorzystana do badań białek w płynach biologicznych, zwłaszcza ludzkiej surowicy i ekstraktach biologicznych.

Immunoelektroforeza rakietowa to jednowymiarowa immunoelektroforeza ilościowa. Metodę stosowano do ilościowego oznaczania białek surowicy ludzkiej, zanim stały się dostępne metody automatyczne.

Fuzowana immunoelektroforeza rakietowa jest modyfikacją jednowymiarowej immunoelektroforezy ilościowej stosowanej do szczegółowego pomiaru białek we frakcjach z eksperymentów separacji białek.

Immunoelektroforeza powinowactwa opiera się na zmianach wzoru elektroforetycznego białek poprzez specyficzne oddziaływanie lub tworzenie kompleksów z innymi makrocząsteczkami lub ligandami. Immunoelektroforeza powinowactwa została wykorzystana do oszacowania stałych wiązania , jak na przykład z lektynami lub do scharakteryzowania białek o specyficznych cechach, takich jak zawartość glikanów lub wiązanie ligandów . Niektóre warianty immunoelektroforezy powinowactwa są podobne do chromatografii powinowactwa z zastosowaniem unieruchomionych ligandów .

Otwarta struktura immunoprecypitatu w żelu agarozowym umożliwi dodatkowe wiązanie znakowanych radioaktywnie przeciwciał w celu ujawnienia specyficznych białek. Ta odmiana została wykorzystana do identyfikacji alergenów poprzez reakcję z immunoglobuliną E (IgE).

Dwa czynniki decydują o tym, że metody immunoelektroforetyczne nie są powszechnie stosowane. Po pierwsze są dość pracochłonne i wymagają pewnej wiedzy manualnej. Po drugie wymagają dość dużych ilości przeciwciał poliklonalnych. Obecnie elektroforeza żelowa, po której następuje elektroblotting, jest preferowaną metodą charakteryzowania białek ze względu na łatwość jej działania, wysoką czułość i niskie zapotrzebowanie na specyficzne przeciwciała. Ponadto białka są rozdzielane przez elektroforezę żelową na podstawie ich pozornej masy cząsteczkowej, czego nie osiąga się przez immunoelektroforezę, niemniej jednak metody immunoelektroforetyczne są nadal przydatne, gdy potrzebne są warunki nieredukujące.

Bibliografia

Zewnętrzne linki