Pyrosequencing - Pyrosequencing

Pirosekwencjonowanie jest metodą sekwencjonowania DNA (określania kolejności nukleotydów w DNA) opartą na zasadzie „sekwencjonowania przez syntezę”, w której sekwencjonowanie przeprowadza się poprzez wykrycie nukleotydu włączonego przez polimerazę DNA . Pirosekwencjonowanie polega na wykrywaniu światła w oparciu o reakcję łańcuchową, w której uwalnia się pirofosforan . Stąd nazwa pyrosequencing.

Zasada pirosekwencjonowania została po raz pierwszy opisana w 1993 roku przez Bertila Petterssona , Mathiasa Uhlena i Pål Nyrena poprzez połączenie metody sekwencjonowania w fazie stałej z użyciem kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną z rekombinowaną polimerazą DNA pozbawioną aktywności 3–5 „eksonukleazy (odczyt dowodowy) i detekcją luminescencji przy użyciu enzymu lucyferazy świetlika . Mieszanina trzech enzymów ( polimerazy DNA , sulfurylazy ATP i lucyferazy świetlika ) i nukleotydu ( dNTP ) dodaje się do jednoniciowego DNA, który ma być zsekwencjonowany, a po włączeniu nukleotydu mierzy się emitowane światło. Intensywność światła określa, czy włączono 0, 1 lub więcej nukleotydów, pokazując w ten sposób, ile komplementarnych nukleotydów jest obecnych na nici matrycowej. Mieszaninę nukleotydów usuwa się przed dodaniem następnej mieszaniny nukleotydów. Proces ten powtarza się dla każdego z czterech nukleotydów, aż do określenia sekwencji DNA jednoniciowej matrycy.

Druga metoda pirosekwencjonowania oparta na rozwiązaniach została opisana w 1998 roku przez Mostafę Ronaghi , Mathiasa Uhlena i Påla Nyrena . W tej alternatywnej metodzie wprowadza się dodatkowy enzym apyrazę w celu usunięcia nukleotydów, które nie są włączone przez polimerazę DNA. Umożliwiło to dodanie mieszaniny enzymów zawierającej polimerazę DNA , lucyferazę i apyrazę na początku i utrzymanie jej przez całą procedurę, zapewniając w ten sposób prostą konfigurację odpowiednią do automatyzacji. Zautomatyzowany instrument oparty na tej zasadzie został wprowadzony na rynek w następnym roku przez firmę Pyrosequencing.

Trzeci wariant mikrofluidyczny metody Pyrosequencing został opisany w 2005 roku przez Jonathana Rothberga i współpracowników z firmy 454 Life Sciences . To alternatywne podejście do pirosekwencjonowania oparto na oryginalnym zasadę mocowania do sekwencjonowania DNA do stałego nośnika, i wykazano, że kolejność działań może być przeprowadzane w sposób bardzo równolegle stosując mikroukład mikromacierzy . Pozwoliło to na wysokoprzepustowe sekwencjonowanie DNA i zautomatyzowany instrument został wprowadzony na rynek. Stało się to pierwszym instrumentem do sekwencjonowania nowej generacji, rozpoczynającym nową erę w badaniach genomiki , z szybko spadającymi cenami sekwencjonowania DNA, umożliwiającymi sekwencjonowanie całego genomu po przystępnych cenach.

Procedura

Jak działa pirosekwencjonowanie
Wykres pokazuje, jak działa pirosekwencjonowanie.

„Sekwencjonowanie przez syntezę” obejmuje pobranie pojedynczej nici DNA do sekwencjonowania, a następnie enzymatyczną syntezę jej komplementarnej nici. Metoda pirosekwencjonowania polega na wykrywaniu aktywności polimerazy DNA (enzymu syntetyzującego DNA) z innym enzymem chemoluminescencyjnym . Zasadniczo metoda ta umożliwia sekwencjonowanie pojedynczej nici DNA poprzez syntezę komplementarnej nici wzdłuż niej, po jednej parze zasad na raz i wykrywanie, która zasada została faktycznie dodana na każdym etapie. Matrycowy DNA jest nieruchomy, a roztwory nukleotydów A, C, G i T są kolejno dodawane i usuwane z reakcji. Światło jest wytwarzane tylko wtedy, gdy roztwór nukleotydów uzupełnia pierwszą niesparowaną zasadę szablonu. Sekwencja roztworów, które wytwarzają sygnały chemiluminescencyjne, pozwala na określenie sekwencji matrycy.

W przypadku wersji Pyrosequencing opartej na roztworze, matryca jednoniciowego DNA ( ssDNA ) jest hybrydyzowana ze starterem do sekwencjonowania i inkubowana z enzymami polimerazą DNA , sulfurylazą ATP , lucyferazą i apyrazą oraz z substratami fosfosiarczanu adenozyny 5´ (APS) i lucyferyna .

  1. Dodanie jednego z czterech trifosforanów deoksynukleotydów ( dNTP ) (dATPαS, który nie jest substratem dla lucyferazy, dodaje się zamiast dATP, aby uniknąć szumu) inicjuje drugi etap. Polimeraza DNA wprowadza do matrycy prawidłowe, komplementarne dNTP. Ta inkorporacja uwalnia pirofosforan (PPi).
  2. Sulfurylaza ATP przekształca PPi w ATP w obecności fosfosiarczanu adenozyny 5 '. Ten ATP działa jako substrat do konwersji lucyferyny do oksylucyferyny, w której pośredniczy lucyferaza, która generuje światło widzialne w ilościach, które są proporcjonalne do ilości. Światło wytwarzane w reakcji katalizowanej lucyferazą jest wykrywane przez kamerę i analizowane w programie.
  3. Niewłączone nukleotydy i ATP są degradowane przez apyrazę i reakcja może zostać wznowiona z innym nukleotydem.

Proces można przedstawić za pomocą następujących równań:

  • PPi + APS → ATP + siarczan (katalizowany przez ATP-sulfurylazę);
  • ATP + lucyferyna + O2 → AMP + PPi + oksylucyferyna + CO2 + hv (katalizowana przez lucyferazę);

gdzie:

  • PPi to pirofosforan
  • APS oznacza 5-fosfosiarczan adenozyny;
  • ATP to trifosforan adenozyny;
  • O2 to cząsteczka tlenu;
  • AMP to monofosforan adenozyny;
  • CO2 to dwutlenek węgla;
  • hv jest lekki.

Ograniczenia

Obecnie ograniczeniem metody jest to, że długości poszczególnych odczytów sekwencji DNA są bliskie 300-500 nukleotydów, czyli mniej niż 800-1000 możliwych do uzyskania metodami terminacji łańcucha (np. Sekwencjonowanie Sangera). Może to utrudnić proces składania genomu , szczególnie w przypadku sekwencji zawierających dużą ilość powtarzalnego DNA . Brak czynności korektorskich ogranicza dokładność tej metody.

Komercjalizacja

Firma Pyrosequencing AB w Uppsali w Szwecji została założona dzięki kapitałowi wysokiego ryzyka dostarczonemu przez HealthCap w celu komercjalizacji maszyn i odczynników do sekwencjonowania krótkich odcinków DNA przy użyciu techniki pirosekwencjonowania. Pyrosequencing AB została notowana na Sztokholmskiej Giełdzie Papierów Wartościowych w 1999 roku . W 2003 roku została przemianowana na Biotage . Linia biznesowa pyrosequencing została przejęta przez Qiagen w 2008 roku. Ponadto licencję na technologię Pyrosequencing otrzymało 454 Life Sciences . 454 opracował technologię pirosekwencjonowania opartą na macierzach, która wyłoniła się jako platforma do sekwencjonowania DNA na dużą skalę , w tym sekwencjonowania genomu i metagenomiki .

Roche ogłosił zaprzestanie produkcji platformy sekwencjonowania 454 w 2013 roku, kiedy jej technologia stała się niekonkurencyjna.

Bibliografia

Dalsza lektura