Przeprogramowanie - Reprogramming
W biologii przeprogramowanie odnosi się do wymazywania i przebudowy znaczników epigenetycznych , takich jak metylacja DNA , podczas rozwoju ssaków lub w hodowli komórkowej. Taka kontrola jest również często związana z alternatywnymi kowalencyjnymi modyfikacjami histonów .
Przeprogramowania, które są zarówno na dużą skalę (10% do 100% znaczników epigenetycznych), jak i szybkie (godziny do kilku dni) występują w trzech stadiach życia ssaków. Prawie 100% znaków epigenetyczne są przeprogramowane w dwóch krótkich okresów wczesnego rozwoju po zapłodnieniu wystąpienia komórki jajowej przez plemnik . Ponadto prawie 10% metylacji DNA w neuronach hipokampa może ulec gwałtownej zmianie podczas tworzenia silnej pamięci strachu.
Po zapłodnieniu u ssaków, wzorce metylacji DNA są w dużej mierze usuwane, a następnie przywracane podczas wczesnego rozwoju embrionalnego. Prawie wszystkie metylacje rodziców są usuwane, najpierw we wczesnej embriogenezie , a następnie w gametogenezie , przy czym za każdym razem dochodzi do demetylacji i remetylacji. Demetylacja we wczesnej embriogenezie następuje w okresie przedimplantacyjnym. Po zapłodnieniu komórki jajowej przez plemnik w celu utworzenia zygoty , następuje szybka demetylacja DNA ojcowskiego i wolniejsza demetylacja DNA matki, aż do powstania moruli, która prawie nie ulega metylacji. Po utworzeniu blastocysty może rozpocząć się metylacja, a wraz z powstaniem epiblastu następuje fala metylacji, aż do etapu implantacji zarodka. Kolejny okres gwałtownej i prawie całkowitej demetylacji następuje podczas gametogenezy w pierwotnych komórkach zarodkowych (PGC). Poza PGCs, na etapie po implantacji, wzorce metylacji w komórkach somatycznych są specyficzne dla stadium i tkanki, ze zmianami, które przypuszczalnie definiują każdy indywidualny typ komórki i utrzymują się stabilnie przez długi czas.
Rozwój zarodkowy
Genom nasienia myszy jest w 80-90% zmetylowany w swoich miejscach CpG w DNA, co odpowiada około 20 milionom miejsc zmetylowanych. Po zapłodnieniu chromosom ojcowski jest prawie całkowicie demetylowany w ciągu sześciu godzin w aktywnym procesie przed replikacją DNA (niebieska linia na rysunku). W dojrzałym oocytu około 40% jego miejsc CpG jest zmetylowanych. Demetylacja matczynego chromosomu odbywa się w dużej mierze przez blokowanie działania enzymów metylujących na DNA pochodzenia matki oraz przez rozcieńczenie zmetylowanego matczynego DNA podczas replikacji (czerwona linia na rysunku). Morula (w etapie 16 komórek), ma jedynie niewielką ilość metylacji DNA (czarna linia na rysunku). Metylacja zaczyna się zwiększać w 3,5 dniu po zapłodnieniu w blastocyście , a duża fala metylacji występuje następnie w dniach 4,5 do 5,5 w epiblaście , przechodząc od 12% do 62% i osiągając maksymalny poziom po implantacji w macicy. Siódmego dnia po zapłodnieniu nowo utworzone pierwotne komórki rozrodcze (PGC) we wszczepionym zarodku oddzielają się od pozostałych komórek somatycznych . W tym momencie PGCs mają mniej więcej taki sam poziom metylacji jak komórki somatyczne.
Nowo utworzone pierwotne komórki rozrodcze (PGC) we wszczepionym zarodku ewoluują z komórek somatycznych. W tym momencie PGCs mają wysoki poziom metylacji. Komórki te migrują z epiblastu w kierunku grzbietu gonad . Teraz komórki szybko się namnażają i rozpoczynają demetylację w dwóch falach. W pierwszej fali demetylacja następuje przez rozcieńczenie replikacyjne, ale w drugiej fali demetylacja jest procesem aktywnym. Druga fala prowadzi do demetylacji określonych loci. W tym momencie genomy PGC wykazują najniższy poziom metylacji DNA ze wszystkich komórek w całym cyklu życiowym [w 13.5 dniu embrionalnym (E13.5), patrz druga rycina w tej sekcji].
Po zapłodnieniu niektóre komórki nowo powstałego zarodka migrują do listwy zarodkowej i ostatecznie staną się komórkami zarodkowymi (plemnikami i oocytami) następnego pokolenia. Ze względu na zjawisko imprintingu genomowego genomy matki i ojca są różnie znakowane i muszą być odpowiednio przeprogramowane za każdym razem, gdy przechodzą przez linię zarodkową. Dlatego podczas procesu gametogenezy pierwotne komórki rozrodcze muszą mieć wymazane i przywrócone ich oryginalne wzorce metylacji DNA dwurodzicielskiego w oparciu o płeć rodzica przenoszącego.
Po zapłodnieniu genomy ojca i matki są demetylowane w celu wymazania ich sygnatur epigenetycznych i uzyskania totipotencji. W tym momencie występuje asymetria: przedjądrze męskie ulega szybkiej i aktywnej demetylacji. Tymczasem przedjądro żeńskie ulega biernej demetylacji podczas kolejnych podziałów komórkowych. Proces demetylacji DNA obejmuje naprawę przez wycinanie zasad i prawdopodobnie inne mechanizmy oparte na naprawie DNA. Pomimo globalnego charakteru tego procesu, istnieją pewne sekwencje, które go unikają, takie jak regiony różnicowo metylowane (DMRS) związane z imprintowanymi genami, retrotranspozony i heterochromatyna centromerowa . Remetylacja jest potrzebna ponownie, aby zróżnicować zarodek w kompletny organizm.
Wykazano, że manipulacja in vitro zarodków przed implantacją zaburza wzorce metylacji w imprintowanych loci i odgrywa kluczową rolę u sklonowanych zwierząt.
Nauka i pamięć
Uczenie się i pamięć mają poziomy trwałości, różniące się od innych procesów umysłowych, takich jak myślenie, język i świadomość, które mają charakter tymczasowy. Uczenie się i pamięć można akumulować powoli (tabliczki mnożenia) lub szybko (dotykając rozgrzanego pieca), ale raz osiągnięta może być przywołana do świadomego użytku na długi czas. Szczury poddane jednemu przykładowi kontekstowego warunkowania strachowego wytwarzają szczególnie silną pamięć długotrwałą. W 24 godziny po treningu, 9,17% genów w szczurzych genomach neuronów hipokampu było zmetylowanych w różny sposób . Obejmowało to ponad 2000 różnie zmetylowanych genów w 24 godziny po treningu, przy czym ponad 500 genów zostało demetylowanych. Obszar hipokampu w mózgu jest miejscem, w którym najpierw przechowywane są kontekstowe wspomnienia strachu (patrz rysunek mózgu w tej sekcji), ale przechowywanie to jest przejściowe i nie pozostaje w hipokampie. U szczurów warunkowanie kontekstowe strachu jest zniesione, gdy hipokamp poddaje się hipokampektomii zaledwie 1 dzień po kondycjonowaniu, ale szczury zachowują znaczną ilość lęku kontekstowego, gdy nałożone jest duże opóźnienie (28 dni) między czasem warunkowania a hipokampektomią.
Etapy molekularne
Do przeprogramowania metylomu DNA potrzebne są trzy etapy molekularne . Etap 1: Rekrutacja. Enzymy potrzebne do przeprogramowania są rekrutowane do miejsc genomu, które wymagają demetylacji lub metylacji. Etap 2: Wdrożenie. Zachodzą początkowe reakcje enzymatyczne. W przypadku metylacji jest to krótki etap prowadzący do metylacji cytozyny do 5-metylocytozyny. Etap 3: Naprawa DNA poprzez wycinanie zasad. Pośrednie produkty demetylacji są katalizowane przez specyficzne enzymy szlaku naprawy DNA przez wycinanie zasad, które ostatecznie przywracają cystozynę w sekwencji DNA.
Rysunek w tej części wskazuje centralną rolę dziesięciu jedenastu dioksygenaz metylocytozyny (TET) translokacji w demetylacji 5-metylocytozyny z wytworzeniem cytozyny. Jak sprawdzono w 2018 r., 5mC bardzo często jest początkowo utleniane przez dioksygenazy TET w celu wytworzenia 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC). W kolejnych etapach (patrz rysunek) enzymy TET dalej hydroksylują 5hmC, aby wytworzyć 5-formylocytozynę (5fC) i 5-karboksylocytozynę (5caC). Glikozylaza tyminowo -DNA (TDG) rozpoznaje zasady pośrednie 5fC i 5caC i wycina wiązanie glikozydowe, dając miejsce apirymidynowe (miejsce AP). W alternatywnym szlaku deaminacji oksydacyjnej, 5hmC może być dezaminowane oksydacyjnie przez deaminazy APOBEC (AID/APOBEC) z wytworzeniem 5-hydroksymetylouracylu (5hmU) lub 5mC może zostać przekształcone w tyminę (Thy). 5hmU może zostać przecięte przez TDG, SMUG1 , NEIL1 lub MBD4 . Miejsca AP i niedopasowania T:G są następnie naprawiane przez enzymy naprawy przez wycinanie zasad (BER) z wytworzeniem cytozyny (Cyt).
Rodzina TET
Te izoformy enzymów TET zawierać co najmniej dwie izoformy TET1, jeden TET2 i trzy izoformy TET3. Izoforma kanoniczna TET1 o pełnej długości wydaje się być praktycznie ograniczona do wczesnych zarodków, embrionalnych komórek macierzystych i pierwotnych komórek rozrodczych (PGC). Dominująca izoforma TET1 w większości tkanek somatycznych, przynajmniej u myszy, wynika z zastosowania alternatywnego promotora, który powoduje powstanie krótkiego transkryptu i skróconego białka oznaczonego jako TET1. Izoformy TET3 to pełnej długości forma TET3FL, krótka forma wariantu splicingowego TET3 oraz forma występująca w oocytach i neuronach oznaczona jako TET3o. TET3o jest tworzony przez zastosowanie alternatywnego promotora i zawiera dodatkowy pierwszy N-końcowy egzon kodujący 11 aminokwasów. TET3o występuje tylko w oocytach i neuronach i nie ulegał ekspresji w embrionalnych komórkach macierzystych ani w żadnym innym typie komórek lub testowanej tkance dorosłej myszy. Podczas gdy ekspresja TET1 może być ledwo wykryta w oocytach i zygotach, a TET2 jest tylko umiarkowanie eksprymowana, wariant TET3 TET3o wykazuje niezwykle wysoki poziom ekspresji w oocytach i zygotach, ale jest prawie nieobecny w stadium 2-komórkowym. Jest możliwe, że TET3o, bogaty w neurony, oocyty i zygoty w jednym stadium komórkowym, jest głównym enzymem TET wykorzystywanym, gdy w tych komórkach zachodzi bardzo duża skala szybkiej demetylacji.
Rekrutacja TET do DNA
Te enzymy TET nie wiążą się specyficznie z 5-metylocytozyny wyjątkiem rekrutowane. Bez rekrutacji i kierowania, TET1 głównie wiąże się z wysokimi promotorów CG i wysp CpG (CGI) genomu przez jej domenę CXXC który rozpoznaje un-metylowany CGI. TET2 nie ma powinowactwa do 5-metylocytozyny w DNA. Domena CXXC pełnej długości TET3, która jest dominującą formą wyrażaną w neuronach, najsilniej wiąże się z CpG, gdzie C zostało przekształcone do 5-karboksycytozyny (5caC). Jednak wiąże się również z niemetylowanymi CpG .
Aby enzym TET zainicjował demetylację, musi najpierw zostać zrekrutowany do zmetylowanego miejsca CpG w DNA. Wykazano, że dwa z białek, które rekrutują enzym TET do metylowanej cytozyny w DNA, to OGG1 (patrz rysunek Inicjacja demtylacji DNA) i EGR1 .
OGG1
Glikozylaza oksoguaninowa (OGG1) katalizuje pierwszy etap naprawy przez wycinanie zasady uszkodzonej przez utlenianie zasady 8-OHdG . OGG1 znajduje 8-OHdG przesuwając się wzdłuż liniowego DNA na 1000 par zasad DNA w 0,1 sekundy. OGG1 bardzo szybko znajduje 8-OHdG. Białka OGG1 wiążą się z uszkodzonym oksydacyjnie DNA w połowie maksymalnego czasu około 6 sekund. Gdy OGG1 znajdzie 8-OHdG, zmienia konformację i tworzy kompleksy z 8-OHdG w kieszeni wiążącej OGG1. OGG1 nie działa natychmiast w celu usunięcia 8-OHdG. Połowa maksymalnego usunięcia 8-OHdG zajmuje około 30 minut w komórkach HeLa in vitro lub około 11 minut w wątrobach napromieniowanych myszy. Utlenianie DNA przez reaktywne formy tlenu występuje preferencyjnie przy guaninie w metylowanym miejscu CpG, ze względu na obniżony potencjał jonizacji zasad guaninowych sąsiadujących z 5-metylocytozyną. TET1 wiąże się (jest rekrutowany) z OGG1 związanym z 8-OHdG (patrz rysunek). To prawdopodobnie pozwala TET1 na demetylację sąsiedniej metylowanej cytozyny. Gdy ludzkie komórki nabłonka sutka (MCF-10A) potraktowano H 2 O 2 , 8-OHdG wzrosła DNA o 3,5-krotnie, a to spowodowane dużą skalę demetylacja 5-metylocytozyny do około 20% jej początkowej poziomie DNA.
EGR1
Białko odpowiedzi wczesnego wzrostu genu 1 ( EGR1 ) jest genem o natychmiastowym wczesnym wzroście (IEG). Cechą definiującą IEG jest szybka i przejściowa regulacja w górę – w ciągu kilku minut – ich poziomów mRNA, niezależnie od syntezy białek. EGR1 może być szybko indukowany przez aktywność neuronalną. W wieku dorosłym EGR1 jest szeroko eksprymowany w mózgu, utrzymując podstawowe poziomy ekspresji w kilku kluczowych obszarach mózgu, w tym w przyśrodkowej korze przedczołowej, prążkowiu, hipokampie i ciele migdałowatym. To wyrażenie wiąże się z kontrolą poznania, reakcją emocjonalną, zachowaniami społecznymi i wrażliwością na nagrodę. EGR1 wiąże się z DNA w miejscach z motywami 5'-GCGTGGGCG-3' i 5'-GCGGGGGCGG-3' i motywy te występują głównie w regionach promotorowych genów. Krótka izoforma TET1 ulega ekspresji w mózgu. EGR1 i TET1 tworzą kompleks, w którym pośredniczą regiony C-końcowe obu białek, niezależnie od połączenia z DNA. EGR1 rekrutuje TET1 do regionów genomowych flankujących miejsca wiązania EGR1. W obecności EGR1, TET1s są zdolne do demetylacji specyficznej dla locus i aktywacji ekspresji genów w dół rzeki regulowanych przez EGR1.
W systemach hodowli komórkowych
Przeprogramowanie można również wywołać sztucznie poprzez wprowadzenie czynników egzogennych, zazwyczaj czynników transkrypcyjnych . W tym kontekście często odnosi się do tworzenia indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z dojrzałych komórek, takich jak dorosłe fibroblasty . Pozwala to na produkcję komórek macierzystych do badań biomedycznych , takich jak badania nad terapiami komórkami macierzystymi , bez użycia embrionów. Przeprowadza się ją poprzez transfekcję genów związanych z komórkami macierzystymi do dojrzałych komórek przy użyciu wektorów wirusowych, takich jak retrowirusy .
Historia
Pierwszą osobą, która z powodzeniem zademonstrowała przeprogramowanie, był John Gurdon , który w 1962 r. wykazał, że zróżnicowane komórki somatyczne można przeprogramować z powrotem do stanu embrionalnego, gdy udało mu się uzyskać pływające kijanki po przeniesieniu zróżnicowanych komórek nabłonka jelitowego do pozbawionych jąder jaj żab. Za to osiągnięcie otrzymał w 2012 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie medycyny u boku Shinyi Yamanaki . Yamanaka jako pierwszy zademonstrował (w 2006 r.), że ten transfer jądra komórki somatycznej lub proces przeprogramowania oparty na oocytach (patrz poniżej), który odkrył Gurdon, może być podsumowany (u myszy) przez określone czynniki ( Oc4 , Sox2 , Klf4 i c -Myc ) do generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Zastosowano również inne kombinacje genów.
Zmienność
Właściwości ogniw uzyskanych po przeprogramowaniu mogą się znacznie różnić, w szczególności wśród iPSC. Czynniki prowadzące do zmian w wydajności przeprogramowania i cech funkcjonalnych produktów końcowych obejmują podłoże genetyczne, źródło tkanki, stechiometrię czynnika przeprogramowania i stresory związane z hodowlą komórkową.
Transfer jądra komórki somatycznej
Oocytów można przeprogramować jądra dorosłych w stanie po zarodka transferu jądra komórki somatycznej , tak, że nowy organizm może być realizowana z takiej komórki.
Przeprogramowanie różni się od rozwoju epitypu somatycznego , ponieważ epitypy somatyczne mogą potencjalnie ulec zmianie po opuszczeniu przez organizm stadium rozwojowego życia. Podczas transferu jądra komórki somatycznej oocyt wyłącza geny specyficzne tkankowo w jądrze komórki somatycznej i włącza z powrotem geny specyficzne dla embrionu.