Hydroksylazy zależne od alfa-ketoglutaranu - Alpha-ketoglutarate-dependent hydroxylases

Hydroksylazy zależne od alfa-ketoglutaranu to główna klasa niehemowych białek żelaza, które katalizują szeroki zakres reakcji. Reakcje te obejmują reakcje hydroksylacji, demetylacji, rozszerzenia pierścienia, zamknięcia pierścienia i desaturacje. Funkcjonalnie hydroksylazy zależne od αKG są porównywalne z enzymami cytochromu P450 . Oba wykorzystują jako kosubstraty O 2 i równoważniki redukujące i obydwa generują wodę.

Funkcja biologiczna

Hydroksylazy zależne od αKG pełnią różne role. W mikroorganizmach, takich jak bakterie, dioksygenazy zależne od αKG są zaangażowane w wiele szlaków biosyntetycznych i metabolicznych; Na przykład, w E. coli , AlkB enzym jest związany z naprawy uszkodzonego DNA . W roślinach dioksygenazy zależne od αKG biorą udział w różnorodnych reakcjach w metabolizmie roślin. Należą do nich biosynteza flawonoidów i biosyntezy etylenu. U ssaków i ludzi dioksygenaza zależna od αKG odgrywa funkcjonalne role w biosyntezach (np. biosynteza kolagenu i biosynteza L-karnityny), modyfikacjach potranslacyjnych (np. hydroksylacja białek), regulacjach epigenetycznych (np. demetylacja histonów i DNA ), a także jako sensory metabolizm energetyczny .

Wiele dioksygenaz zależnych od αKG również katalizuje niezwiązany obrót, w którym dekarboksylacja oksydacyjna αKG do bursztynianu i dwutlenku węgla zachodzi przy braku substratu. Aktywność katalityczna wielu dioksygenaz zależnych od αKG zależy od środków redukujących (zwłaszcza askorbinianu), chociaż dokładne role nie są zrozumiałe.

Mechanizm katalityczny

Dioksygenazy zależne od αKG katalizują reakcje utleniania poprzez włączenie pojedynczego atomu tlenu z tlenu cząsteczkowego (O 2 ) do swoich substratów. Ta konwersja jest połączona z utlenianiem kosubstratu αKG do bursztynianu i dwutlenku węgla. Z oznaczonym O 2 jako substratem, jedna etykieta pojawia się w bursztynianie, a druga w substracie hydroksylowanym:

R 3 CH + O 2 + − O 2 CC(O)CH 2 CH 2 CO 2 − → R 3 C O H + CO 2 + − O O CCH 2 CH 2 CO 2 −

Pierwszy etap obejmuje wiązanie αKG i substratu z miejscem aktywnym. αKG koordynuje jako dwukleszczowy ligand do Fe(II), podczas gdy podłoże jest utrzymywane przez siły niekowalencyjne w bliskim sąsiedztwie. Następnie tlen cząsteczkowy wiąże się do Fe cis z dwoma dawcami αKG. Nieskoordynowane koniec ataków ponadtlenkowa ligand węgla keto zwiększają wydzielanie CO 2 i tworzące Fe (IV) -okso pośredniego . To centrum Fe=O następnie natlenia podłoże przez mechanizm odbicia tlenu .

Mechanizmy alternatywne nie zyskały poparcia.

Konsensusowy mechanizm katalityczny nadrodziny dioksygenaz zależnej od αKG.

Struktura

Białko

Wszystkie dioksygenazy zależne od αKG zawierają konserwatywną dwuniciową β-helisę (DSBH, znaną również jako cupin), która składa się z dwóch β-kartek.

Metalofaktor

Miejsce aktywne zawiera wysoce konserwowany motyw triady reszt aminokwasowych 2-His-1-karboksylanowych (HXD/E...H), w którym niezbędny katalitycznie Fe(II) jest utrzymywany przez dwie reszty histydyny i jedną kwas asparaginowy/ reszta kwasu glutaminowego. N 2 O Triada wiąże się z jedną powierzchnią środka Fe, pozostawiając trzy miejsca labilne dostępne ośmiościanu do wiązania αKG i O 2 . Podobny motyw wiązania Fe na twarzy, ale zawierający tablicę jego-jego-jego, znajduje się w dioksygenazie cysteinowej .

Wiązanie podłoża i kosubstratu

Wiązanie αKG i substratu zostało przeanalizowane za pomocą krystalografii rentgenowskiej, obliczeń dynamiki molekularnej i spektroskopii NMR. Wiązanie ketoglutaranu zaobserwowano przy użyciu inhibitorów enzymów.

Niektóre dioksygenazy zależne od αKG wiążą swój substrat poprzez mechanizm indukowanego dopasowania. Na przykład, znaczące zmiany strukturalne białka zaobserwowano po związaniu substratu dla ludzkiej izoformy 2 hydroksylazy prolilowej (PHD2), dioksygenazy zależnej od αKG, która bierze udział w wykrywaniu tlenu, i syntazy izopenicyliny N (IPNS), drobnoustrojowej dioksygenazy zależnej od αKG.

Uproszczony widok miejsca aktywnego izoformy 2 hydroksylazy prolilowej (PHD2), ludzkiej dioksygenazy zależnej od αKG. Fe(II) jest koordynowany przez dwa imidazole i jeden karboksylan dostarczany przez białko. Inne ligandy żelaza, które przejściowo zajęte αKG i O 2 , zostały pominięte dla przejrzystości.

Inhibitory

Biorąc pod uwagę ważną rolę biologiczną, jaką odgrywa dioksygenaza zależna od αKG, opracowano wiele inhibitorów dioksygenazy zależnej od αKG. Inhibitory, które były regularnie stosowane do celowania w dioksygenazę zależną od αKG, obejmują N-oksaliloglicynę (NOG), kwas pirydyno-2,4-dikarboksylowy (2,4-PDCA), 5-karboksy-8-hydroksychinolinę, FG-2216 i FG- 4592, które wszystkie zostały zaprojektowane, naśladują kosubstrat aKG i konkurują z wiązaniem aKG w miejscu aktywnym enzymu Fe(II). Chociaż są one silnymi inhibitorami dioksygenazy zależnej od αKG, brakuje im selektywności i dlatego czasami są określane jako tak zwane inhibitory o „szerokim spektrum”. Opracowano również inhibitory, które konkurują z substratem, takie jak inhibitory oparte na peptydylu, których celem jest ludzka domena 2 hydroksylazy prolilowej (PHD2) oraz Mildronate , cząsteczka leku powszechnie stosowana w Rosji i Europie Wschodniej, która działa na dioksygenazę gamma-butyrobetainy . Wreszcie, ponieważ dioksygenazy zależne od αKG wymagają tlenu cząsteczkowego jako kosubstratu, wykazano również, że cząsteczki gazowe, takie jak tlenek węgla i tlenek azotu, są inhibitorami dioksygenaz zależnych od αKG, prawdopodobnie poprzez konkurowanie z tlenem cząsteczkowym o wiązanie na centrum aktywne jonów Fe(II).

Powszechne inhibitory dioksygenaz zależnych od αKG. Konkurują one z kosubstratem αKG o wiązanie z miejscem aktywnym Fe(II).

Testy

Opracowano wiele testów do badania dioksygenaz zależnych od αKG, aby uzyskać informacje, takie jak kinetyka enzymów, hamowanie enzymów i wiązanie ligandów. Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) jest szeroko stosowana do badania dioksygenaz zależnych od αKG. Opracowano na przykład testy do badania wiązania ligandów, kinetyki enzymów, trybów hamowania, a także zmiany konformacji białka. Szeroko stosowana jest również spektrometria mas. Może być stosowany do charakteryzowania kinetyki enzymów, kierowania rozwojem inhibitorów enzymów, badania wiązania ligandów i metali, a także analizy zmian konformacyjnych białek. Wykorzystano również testy wykorzystujące spektrofotometrię, na przykład te, które mierzą utlenianie 2OG, tworzenie się bursztynianu jako produktu ubocznego lub tworzenie produktu. Zastosowano również inne techniki biofizyczne, w tym (ale nie tylko) kalorymetrię izotermiczną (ITC) i elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR). Testy radioaktywne który wykorzystuje 14 substratów C oznaczone zostały również opracowane i stosowane. Biorąc pod uwagę, że dioksygenazy zależne od αKG wymagają tlenu do swojej aktywności katalitycznej, zastosowano również oznaczenie zużycia tlenu.

Dalsza lektura

  • Martinez, Salette; Hausinger, Robert P. (21.08.2015). „Mechanizmy katalityczne Fe(II)- i oksygenaz zależnych od 2-oksoglutaranu” . Czasopismo Chemii Biologicznej . 290 (34): 20702-20711. doi : 10.1074/jbc.R115.648691 . ISSN  0021-9258 . PMC  4543632 . PMID  26152721 .
  • Hegg EL, Que L Jr (grudzień 1997). „Triada twarzy 2-His-1-karboksylan - pojawiający się motyw strukturalny w jednojądrzastych niehemowych enzymach żelaza (II)”. Eur. J. Biochem . 250 (3): 625–629. doi : 10.1111/j.1432-1033.1997.t01-1-00625.x . PMID  9461283 ..
  • Myllylä R, Tuderman L, Kivirikko KI (listopad 1977). „Mechanizm reakcji hydroksylazy prolilowej. 2. Analiza kinetyczna przebiegu reakcji” . Eur. J. Biochem . 80 (2): 349–357. doi : 10.1111/j.1432-1033.1977.tb11889.x . PMID  200425 .
  • Valegård K, Terwisscha van Scheltinga AC, Dubus A, Ranghino G, Oster LM, Hajdu J, Andersson I (styczeń 2004). „Strukturalne podstawy tworzenia cefalosporyn w jednojądrzastym enzymie żelaza” (PDF) . Nat. Struktura. Mol. Biol . 11 (1): 95-101. doi : 10.1038/nsmb712 . PMID  14718929 . S2CID  1205987 .
  • Cena JC, Barr EW, Tirupati B, Bollinger JM Jr, Krebs C (czerwiec 2003). „Pierwsza bezpośrednia charakterystyka wysokowartościowego związku pośredniego żelaza w reakcji dioksygenazy zależnej od alfa-ketoglutaranu: wysokospinowego kompleksu FeIV w dioksygenazie tauryny/alfa-ketoglutaranu (TauD) z Escherichia coli”. Biochemia . 42 (24): 7497–7508. doi : 10.1021/bi030011f . PMID  12809506 .
  • Proshlyakov DA, Henshaw TF, Monterosso GR, Ryle MJ, Hausinger RP (luty 2004). „Bezpośrednie wykrywanie związków pośrednich tlenu w nie-hemowym Fe enzymu tauryna/alfa-ketoglutaran dioksygenazy”. J. Am. Chem. Soc . 126 (4): 1022–1023. doi : 10.1021/ja039113j . PMID  14746461 .
  • Hewitson KS, Granatino N, Welford RW, McDonough MA, Schofield CJ (kwiecień 2005). „Utlenianie przez oksygenazy 2-oksoglutaranowe: niehemowe systemy żelaza w katalizie i sygnalizacji”. Phil. Przeł. R. Soc. . 363 (1829): 807-828. Kod Bib : 2005RSPTA.363..807H . doi : 10.1098/rsta.2004.1540 . PMID  15901537 . S2CID  8568103 .
  • Wick CR, Lanig H, Jäger CM, Burzlaff N, Clark T (listopad 2012). „Wgląd strukturalny w PHD2 hydroksylazy prolilowej: Dynamika molekularna i badanie DFT”. Eur. J. Inorg. Chem . 2012 (31): 4973-4985. doi : 10.1002/ejic.201200391 .

Bibliografia