Analiza bakteriologiczna wody - Bacteriological water analysis
Bakteriologiczna analiza wody to metoda analizy wody w celu oszacowania liczby obecnych bakterii i, w razie potrzeby, ustalenia, jakiego rodzaju są to bakterie. Reprezentuje jeden aspekt jakości wody . Jest to mikrobiologiczna procedura analityczna , w której wykorzystuje się próbki wody i na podstawie tych próbek określa się stężenie bakterii. Na podstawie tych stężeń można zatem wyciągnąć wnioski o przydatności wody do użytku. Proces ten jest używany na przykład do rutynowego potwierdzania, że woda jest bezpieczna do spożycia przez ludzi lub że woda do kąpieli i do celów rekreacyjnych jest bezpieczna w użyciu.
Interpretacja i poziomy wyzwalania działania dla różnych wód różnią się w zależności od sposobu użytkowania wody. Podczas gdy bardzo rygorystyczne poziomy mają zastosowanie do wody pitnej , bardziej łagodne poziomy mają zastosowanie do morskich wód w kąpieliskach, w których oczekuje się, że użytkownicy będą spożywać znacznie mniejsze ilości wody.
Podejście
Wspólną cechą wszystkich tych rutynowych procedur przesiewowych jest to, że pierwotna analiza dotyczy organizmów wskaźnikowych, a nie patogenów, które mogą budzić obawy. Organizmy wskaźnikowe to bakterie, takie jak niespecyficzne bakterie z grupy coli , Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa , które bardzo często występują w jelitach ludzi lub zwierząt i które, jeśli zostaną wykryte, mogą sugerować obecność ścieków . Stosuje się organizmy wskaźnikowe, ponieważ nawet jeśli osoba jest zakażona bardziej patogennymi bakteriami, nadal będą one wydalać wiele milionów razy więcej organizmów wskaźnikowych niż patogenów. Dlatego rozsądne jest przypuszczenie, że jeśli poziomy organizmów wskaźnikowych są niskie, to poziomy patogenów będą znacznie niższe lub nie będzie ich wcale. Oceny przydatności wody do użytku opierają się na bardzo obszernych precedensach i odnoszą się do prawdopodobieństwa zakaźności dowolnej próbki populacji bakterii przy rozsądnym statystycznym poziomie ufności.
Analiza jest zwykle wykonywana przy użyciu metod kulturowych, biochemicznych, a czasem optycznych. Gdy poziomy organizmów wskaźnikowych przekraczają wcześniej ustalone czynniki wyzwalające, można następnie przeprowadzić szczegółową analizę pod kątem patogenów i można je szybko wykryć (w przypadku podejrzenia) przy użyciu określonych metod hodowli lub biologii molekularnej .
Metodologie
Najbardziej niezawodnymi metodami są metoda bezpośredniego zliczania płytek i metoda filtracji membranowej. Agar mEndo jest używany do filtracji membranowej, podczas gdy agar VRBA jest stosowany w metodzie bezpośredniego zliczania płytek. VRBA oznacza agar z fioletowo-czerwoną żółcią. Pożywka zawierająca sole żółciowe, które pobudzają wzrost bakterii Gram-ujemnych i mają charakterystykę hamującą w stosunku do bakterii Gram-dodatnich, chociaż nie są całkowicie hamujące.
Pożywki te zawierają laktozę, która jest zwykle fermentowana przez bakterie fermentujące laktozę, wytwarzające kolonie, które można zidentyfikować i scharakteryzować. W wyniku fermentacji laktozy powstają kolorowe kolonie, podczas gdy bez fermentacji laktozy powstają kolonie bezbarwne. Ponieważ analiza zawsze opiera się na bardzo małej próbce pobranej z bardzo dużej objętości wody, wszystkie metody opierają się na zasadach statystycznych.
</ref>
Metoda wielu probówek
Jedna z najstarszych metod nosi nazwę metody wieloprzewodowej. W tej metodzie odmierzoną podpróbkę (prawdopodobnie 10 ml) rozcieńcza się 100 ml sterylnej pożywki hodowlanej, a następnie do każdej z dziesięciu probówek dekantuje się porcję 10 ml. Pozostałe 10 ml następnie ponownie rozcieńcza się i proces powtarza. Na koniec 5 rozcieńczeń daje to 50 probówek obejmujących zakres rozcieńczeń od 1:10 do 1: 10000.
Probówki są następnie inkubowane w ustalonej temperaturze przez określony czas, a na koniec procesu dla każdego rozcieńczenia zlicza się liczbę probówek ze wzrostem. Następnie wykorzystuje się tabele statystyczne do określenia stężenia organizmów w pierwotnej próbce. Metodę tę można ulepszyć poprzez zastosowanie medium wskaźnikowego, które zmienia kolor, gdy obecne są związki tworzące kwas, oraz poprzez umieszczenie w każdej probówce maleńkiej odwróconej probówki zwanej probówką Durhama . Odwrócona rura Durham wyłapuje wszelki wytworzony gaz. Produkcja gazu w temperaturze 37 stopni Celsjusza jest silnym wskazaniem na obecność Escherichia coli .
Testowanie ATP
Test ATP to proces szybkiego pomiaru aktywnych mikroorganizmów w wodzie poprzez wykrywanie trifosforanu adenozyny (ATP). ATP to cząsteczka znajdująca się tylko w żywych komórkach i wokół nich, i jako taka daje bezpośrednią miarę biologicznego stężenia i zdrowia. ATP określa się ilościowo, mierząc światło wytworzone w wyniku jego reakcji z naturalnie występującym enzymem lucyferazą świetlika przy użyciu luminometru . Ilość wytwarzanego światła jest wprost proporcjonalna do ilości energii biologicznej obecnej w próbce.
Testy ATP drugiej generacji są specjalnie zaprojektowane do zastosowań w wodzie, ściekach i przemyśle, gdzie przeważnie próbki zawierają różnorodne składniki, które mogą zakłócać test ATP.
Liczba talerzy
Metoda zliczania na płytkach polega na tym, że bakterie wyhodowały kolonię na pożywce, dzięki czemu kolonia staje się widoczna gołym okiem i można policzyć liczbę kolonii na płytce. Aby była skuteczna, rozcieńczenie oryginalnej próbki musi być tak ustawione, aby wyrosło średnio od 30 do 300 kolonii docelowej bakterii. Mniej niż 30 kolonii sprawia, że interpretacja jest statystycznie błędna, podczas gdy więcej niż 300 kolonii często powoduje nakładanie się kolonii i nieprecyzyjne obliczenie. Aby zapewnić wytworzenie odpowiedniej liczby kolonii, zwykle hoduje się kilka rozcieńczeń. Podejście to jest szeroko stosowane do oceny skuteczności uzdatniania wody przez inaktywację reprezentatywnych zanieczyszczeń mikrobiologicznych, takich jak E. coli, zgodnie z ASTM D5465.
Procedura laboratoryjna obejmuje wykonanie seryjnych rozcieńczeń próbki (1:10, 1: 100, 1: 1000 itd.) W jałowej wodzie i hodowanie ich na agarze odżywczym w naczyniu, które jest zamknięte i inkubowane. Typowe podłoża obejmują agar do zliczania płytek do ogólnej liczby lub agar MacConkey do zliczania bakterii Gram-ujemnych, takich jak E. coli . Zazwyczaj jeden zestaw płytek inkubuje się w 22 ° C i przez 24 godziny, a drugi w 37 ° C przez 24 godziny. Skład odżywki zazwyczaj obejmuje odczynniki odporne na wzrost organizmów innych niż docelowe i ułatwiające identyfikację organizmu docelowego, często poprzez zmianę koloru pożywki. Niektóre najnowsze metody obejmują środek fluorescencyjny, dzięki czemu zliczanie kolonii może być zautomatyzowane. Pod koniec okresu inkubacji kolonie zlicza się na oko, co zajmuje kilka chwil i nie wymaga mikroskopu, ponieważ kolonie mają zwykle średnicę kilku milimetrów.
Filtracja membranowa
Większość nowoczesnych laboratoriów stosuje udoskonalenie całkowitej liczby drobnoustrojów, w którym seryjne rozcieńczenia próbki są filtrowane próżniowo przez specjalnie wykonane filtry membranowe, a filtry te same są układane na pożywce w szczelnie zamkniętych płytkach. Metodologia jest poza tym podobna do konwencjonalnej liczby drobnoustrojów całkowitych. Membrany mają nadrukowaną milimetrową siatkę i mogą być niezawodnie używane do zliczania liczby kolonii pod mikroskopem dwuokularowym.
Metoda nalewania płyty
Gdy analiza poszukuje gatunków bakterii, które słabo rosną w powietrzu, wstępną analizę przeprowadza się przez mieszanie seryjnych rozcieńczeń próbki w płynnym agarze odżywczym, który następnie wlewa się do butelek, które następnie uszczelnia się i kładzie na bokach, aby uzyskać skośny agar. powierzchnia. Kolonie, które rozwijają się w pożywce można policzyć wzrokowo po inkubacji.
Całkowita liczba kolonii jest określana jako całkowita liczba zdolnych do życia (TVC). Jednostką miary jest cfu / ml (lub jednostki tworzące kolonie na mililitr) i odnosi się do oryginalnej próbki. Obliczenie tego jest wielokrotnością zliczonej liczby kolonii pomnożonej przez zastosowane rozcieńczenie.
Analiza patogenów
Gdy próbki wykazują podwyższony poziom bakterii wskaźnikowych, często przeprowadza się dalsze analizy w celu wyszukania określonych bakterii chorobotwórczych. Gatunki powszechnie badane w strefie umiarkowanej to Salmonella typhi i Salmonella typhimurium . W zależności od prawdopodobnego źródła zanieczyszczenia, badanie może również objąć organizmy, takie jak Cryptosporidium spp . W obszarach tropikalnych rutynowo przeprowadza się również analizę Vibrio cholerae .
Rodzaje pożywek stosowanych w analizie
Agar MacConkey to pożywka hodowlana przeznaczona do hodowli bakterii Gram-ujemnych i barwienia ich w celu fermentacji laktozy. Zawiera sole żółci (które hamują działanie większości bakterii Gram-dodatnich), fiolet krystaliczny (który również hamuje działanie niektórych bakterii Gram-dodatnich), neutralny czerwony barwnik (który zabarwia drobnoustroje fermentujące laktozę), laktozę i pepton . Alfred Theodore MacConkey opracował go, pracując jako bakteriolog dla Królewskiej Komisji ds. Utylizacji Ścieków w Wielkiej Brytanii .
Endo agar zawiera pepton, laktozę, fosforan dipotasowy , agar, siarczyn sodu, zasadową fuksynę i został pierwotnie opracowany do izolacji Salmonella typhi , ale obecnie jest powszechnie stosowany w analizie wody. Podobnie jak w agarze MacConkey, organizmy z grupy coli fermentują laktozę, a kolonie stają się czerwone. Organizmy niefermentujące laktozy tworzą klarowne, bezbarwne kolonie na bladoróżowym tle podłoża.
Pożywka mFC jest stosowana w filtracji membranowej i zawiera czynniki selektywne i różnicujące. Należą do nich kwas rosolowy, który ogólnie hamuje wzrost bakterii, z wyjątkiem bakterii z grupy coli w kale, sole żółciowe hamują bakterie niejelitowe, a błękit anilinowy wskazuje na zdolność bakterii coli w kale do fermentacji laktozy do kwasu, co powoduje zmianę pH w pożywce.
Pożywka TYEA zawiera trypton , ekstrakt drożdżowy , sól kuchenną i L-arabinozę na litr szklanej wody destylowanej i jest nieselektywną pożywką zwykle uprawianą w dwóch temperaturach (22 i 36 ° C) w celu określenia ogólnego poziomu zanieczyszczenia (czyli liczby kolonii) .