Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym - Polyacrylamide gel electrophoresis

„PAGE” przekierowuje tutaj. Aby zapoznać się z inicjatywą administracji Obamy, zobacz Presidential Ambassadors for Global Entrepreneurship . Inne zastosowania, patrz Strona .

Zdjęcie SDS-PAGE. Markery molekularne (drabina) znajdują się na lewym pasie

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym ( PAGE ) jest techniką szeroko stosowaną w biochemii , chemii sądowej , genetyce , biologii molekularnej i biotechnologii do rozdzielania makrocząsteczek biologicznych , zwykle białek lub kwasów nukleinowych , zgodnie z ich ruchliwością elektroforetyczną . Ruchliwość elektroforetyczna jest funkcją długości, konformacji i ładunku cząsteczki. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest potężnym narzędziem do analizy próbek RNA. Kiedy żel poliakrylamidowy jest denaturowany po elektroforezie, dostarcza informacji o składzie próbki różnych rodzajów RNA.

Hydratacja z akrylonitrylu prowadzi do tworzenia się akryloamidu cząsteczek ( C
3h
5NIE ) przez hydratazę nitrylową . Monomer akryloamidowy przed dodaniem wody jest w stanie sproszkowanym. Akrylamid jest toksyczny dla ludzkiego układu nerwowego, dlatego podczas pracy z nim należy przestrzegać wszelkich środków bezpieczeństwa. Akryloamid jest rozpuszczalny w wodzie i po dodaniu inicjatorów wolnorodnikowych polimeryzuje, tworząc poliakryloamid. Przydatne jest wytwarzanie żelu poliakrylamidowego poprzez uwodnienie akryloamidu, ponieważ wielkość porów można regulować. Zwiększone stężenia akryloamidu powodują zmniejszenie rozmiaru porów po polimeryzacji. Żel poliakrylamidowy z małymi porami pomaga lepiej badać mniejsze cząsteczki, ponieważ małe cząsteczki mogą wnikać w pory i przemieszczać się przez żel, podczas gdy duże cząsteczki zostają uwięzione w otworach porów.

Jak w przypadku wszystkich form elektroforezy żelowej , molekuły można prowadzić w stanie natywnym , zachowując strukturę wyższego rzędu molekuł. Ta metoda nazywa się natywną PAGE. Alternatywnie można dodać chemiczny środek denaturujący w celu usunięcia tej struktury i przekształcenia cząsteczki w cząsteczkę bez struktury, której ruchliwość zależy tylko od jej długości (ponieważ wszystkie kompleksy białko-SDS mają podobny stosunek masy do ładunku). Ta procedura nazywa się SDS-PAGE . Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) to metoda rozdzielania cząsteczek na podstawie różnicy ich masy cząsteczkowej. Przy pH, w którym przeprowadza się elektroforezę żelową, cząsteczki SDS są naładowane ujemnie i wiążą się z białkami w ustalonym stosunku, około jedna cząsteczka SDS na każde 2 aminokwasy. W ten sposób detergent zapewnia wszystkim białkom jednolity stosunek ładunku do masy. Wiążąc się z białkami, detergent niszczy ich drugorzędową, trzeciorzędową i/lub czwartorzędową strukturę, denaturując je i zamieniając w ujemnie naładowane liniowe łańcuchy polipeptydowe. Poddane działaniu pola elektrycznego w PAGE, ujemnie naładowane łańcuchy polipeptydowe przemieszczają się w kierunku anody z różną ruchliwością. Ich ruchliwość, czyli odległość przebyta przez cząsteczki, jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu ich masy cząsteczkowej. Porównując względny stosunek odległości przebytej przez każde białko do długości żelu (Rf) można wyciągnąć wnioski na temat względnej masy cząsteczkowej białek, gdzie długość żelu zależy od odległości przebytej przez małą cząsteczkę jak barwnik śledzący.

W przypadku kwasów nukleinowych najczęściej stosowanym środkiem denaturującym jest mocznik . W przypadku białek dodecylosiarczan sodu (SDS) jest detergentem anionowym nakładanym na próbki białek w celu powlekania białek w celu nadania dwóch ładunków ujemnych (z każdej cząsteczki SDS) każdemu dwóm aminokwasom zdenaturowanego białka. 2-merkaptoetanol może być również stosowany do rozerwania wiązań dwusiarczkowych znajdujących się między kompleksami białkowymi, co pomaga w dalszej denaturacji białka. W większości białek wiązanie SDS z łańcuchami polipeptydowymi zapewnia równomierny rozkład ładunku na jednostkę masy, co skutkuje frakcjonowaniem według przybliżonej wielkości podczas elektroforezy. Białka, które mają większą zawartość hydrofobową – na przykład wiele białek błonowych i te, które oddziałują z surfaktantami w ich natywnym środowisku – są z natury trudniejsze do dokładnego leczenia tą metodą, ze względu na większą zmienność w stosunku związanych SDS. Proceduralnie, użycie zarówno natywnego, jak i SDS-PAGE razem może być użyte do oczyszczenia i oddzielenia różnych podjednostek białka. Native-PAGE utrzymuje formę oligomeryczną w stanie nienaruszonym i pokaże prążek na żelu, który jest reprezentatywny dla poziomu aktywności. SDS-PAGE denaturuje i rozdziela formę oligomeryczną na jej monomery, pokazując prążki reprezentatywne dla ich mas cząsteczkowych. Te prążki można wykorzystać do identyfikacji i oceny czystości białka.

Procedura

przygotowanie próbki

Próbki mogą być dowolnym materiałem zawierającym białka lub kwasy nukleinowe. Mogą one pochodzić biologicznie, na przykład z komórek prokariotycznych lub eukariotycznych, tkanek, wirusów, próbek środowiskowych lub oczyszczonych białek. W przypadku tkanek litych lub komórek, często są one najpierw rozkładane mechanicznie za pomocą blendera (w przypadku większych objętości próbek), homogenizatora (mniejsze objętości), sonikatora lub za pomocą cykli wysokiego ciśnienia oraz kombinacji biochemicznych i Techniki mechaniczne – w tym różne rodzaje filtracji i wirowania – mogą być stosowane do oddzielania różnych przedziałów komórkowych i organelli przed elektroforezą. Jako anality można również stosować syntetyczne biocząsteczki, takie jak oligonukleotydy .

Redukcja typowego wiązania disiarczkowego przez DTT poprzez dwie kolejne reakcje wymiany tiolowo-disiarczkowej .

Próbka do analizy jest ewentualnie mieszana z chemicznym środkiem denaturującym, jeśli jest to pożądane, zwykle SDS dla białek lub mocznikiem dla kwasów nukleinowych. SDS jest detergentem anionowym, który denaturuje drugorzędowe i niezwiązane mostkami dwusiarczkowymi struktury trzeciorzędowe, a dodatkowo nadaje każdemu białku ładunek ujemny proporcjonalnie do jego masy. Mocznik rozrywa wiązania wodorowe między parami zasad kwasu nukleinowego, powodując rozdzielanie się nici składowych. Podgrzanie próbek do co najmniej 60 °C dodatkowo sprzyja denaturacji.

Oprócz SDS, białka można opcjonalnie krótko ogrzać do temperatury bliskiej wrzenia w obecności środka redukującego, takiego jak ditiotreitol (DTT) lub 2-merkaptoetanol (beta-merkaptoetanol/BME) , który dodatkowo denaturuje białka poprzez redukcję wiązań disiarczkowych, w ten sposób przezwyciężając niektóre formy fałdowania trzeciorzędowych białek i rozbijając czwartorzędową strukturę białka (podjednostki oligomeryczne). Nazywa się to redukcją SDS-PAGE.

Do roztworu można dodać barwnik śledzący. Ma to zazwyczaj wyższą mobilność elektroforetyczną niż anality, aby umożliwić eksperymentatorowi śledzenie postępu roztworu przez żel podczas przebiegu elektroforetycznego.

SDS-PAGE przykład.png

Przygotowanie żeli akrylamidowych

Żele zazwyczaj składają się z akryloamidu , bisakryloamidu , ewentualnego środka denaturującego (SDS lub mocznika) i buforu o nastawionym pH. Roztwór można odgazować pod próżnią, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza podczas polimeryzacji. Alternatywnie, butanol można dodać do rozdzielającego żelu (w przypadku białek) po jego wlaniu, ponieważ butanol usuwa bąbelki i sprawia, że ​​powierzchnia jest gładka. Źródło wolnych rodników i stabilizator, takie jak nadsiarczan amonu i TEMED są dodawane w celu zainicjowania polimeryzacji. Reakcja polimeryzacji tworzy żel z powodu dodanego bisakrylamidu , który może tworzyć wiązania poprzeczne między dwiema cząsteczkami akryloamidu. Stosunek bisakryloamidu do akryloamidu może być zmieniany dla specjalnych celów, ale zwykle wynosi około 1 część na 35. Stężenie akryloamidu w żelu może się również zmieniać, zwykle w zakresie od 5% do 25%. Żele o niższej zawartości procentowej są lepsze do rozdzielenia cząsteczek o bardzo dużej masie cząsteczkowej, podczas gdy do rozdzielenia mniejszych białek potrzebne są znacznie wyższe zawartości procentowe akryloamidu. Średnia średnica porów żeli poliakrylamidowych jest określona przez całkowite stężenie akryloamidów (% T z T = całkowite stężenie akryloamidu i bisakryloamidu) oraz stężenie środka sieciującego bisakryloamid (% C z C = stężenie bisakryloamidu). Wielkość porów zmniejsza się odwrotnie do %T. Odnośnie %C, stężenie 5% daje najmniejsze pory, ponieważ wpływ bisakrylamidu na wielkość porów ma kształt paraboli z wierzchołkiem 5%.

SDS-PAGE akrylamid stock.png

Żele są zwykle polimeryzowane między dwiema szklanymi płytkami w urządzeniu do odlewania żelu, z grzebieniem włożonym u góry w celu utworzenia dołków próbek. Po spolimeryzowaniu żelu grzebień można wyjąć i żel jest gotowy do elektroforezy.

SDS-PAGE Żel akrylamidowy.png

Elektroforeza

W PAGE stosowane są różne układy buforowe w zależności od charakteru próbki i celu eksperymentu. Bufory stosowane na anodzie i katodzie mogą być takie same lub różne.

Bufory SDS-PAGE.png
Elektroforeza SDS-PAGE.png

Pole elektryczne jest przykładane do żelu, powodując migrację ujemnie naładowanych białek lub kwasów nukleinowych w poprzek żelu od elektrody ujemnej (która jest katodą, ponieważ jest to ogniwo elektrolityczne, a nie galwaniczne) i w kierunku elektrody dodatniej (która jest katodą, ponieważ jest to ogniwo elektrolityczne, a nie galwaniczne). anoda). W zależności od ich wielkości, każda biocząsteczka porusza się inaczej przez matrycę żelową: małe cząsteczki łatwiej przechodzą przez pory w żelu, podczas gdy większe mają większe trudności. Żel działa zwykle przez kilka godzin, chociaż zależy to od napięcia przyłożonego do żelu; migracja następuje szybciej przy wyższych napięciach, ale wyniki te są zazwyczaj mniej dokładne niż przy niższych napięciach. Po upływie określonego czasu biocząsteczki migrowały na różne odległości w zależności od ich wielkości. Mniejsze biomolekuły przemieszczają się dalej w głąb żelu, podczas gdy większe pozostają bliżej miejsca pochodzenia. Biocząsteczki można zatem rozdzielać z grubsza według wielkości, która zależy głównie od masy cząsteczkowej w warunkach denaturujących, ale także zależy od konformacji wyższego rzędu w warunkach natywnych. Ruchliwość żel określa się jako szybkość migracji wyjazd gradient napięcia 1 V / cm, i ma jednostki cm 2 / s / V. Dla celów analitycznych wykreśla się względną ruchliwość biocząsteczek, R f , stosunek odległości, jaką cząsteczka przebyła na żelu do całkowitej odległości przejścia barwnika śledzącego w funkcji masy cząsteczkowej cząsteczki (lub czasami log MW, lub raczej Mr , promień cząsteczkowy). Takie typowo liniowe wykresy reprezentują standardowe markery lub krzywe kalibracyjne, które są szeroko stosowane do ilościowego oszacowania różnych rozmiarów biomolekularnych.

Jednak niektóre glikoproteiny zachowują się nieprawidłowo na żelach SDS. Dodatkowo, analiza większych białek w zakresie od 250 000 do 600 000 Da jest również zgłaszana jako problematyczna ze względu na fakt, że takie polipeptydy poruszają się niewłaściwie w normalnie stosowanych układach żelowych.

Dalsze przetwarzanie

Dwa żele SDS-PAGE po zakończonej serii

Po elektroforezie żel można wybarwić (w przypadku białek, najczęściej za pomocą Coomassie Brilliant Blue R-250 lub autoradiografii; w przypadku kwasów nukleinowych, bromku etydyny ; lub w przypadku jednego z tych sposobów , barwienia srebrem ), umożliwiając wizualizację oddzielonych białek lub poddać dalszej obróbce ( np. Western blot ). Po wybarwieniu biocząsteczki różnych gatunków pojawiają się jako odrębne pasma w żelu. Powszechnie stosuje się markery wielkości masy cząsteczkowej o znanej masie cząsteczkowej w oddzielnym torze w żelu w celu kalibracji żelu i określenia przybliżonej masy cząsteczkowej nieznanych biocząsteczek przez porównanie przebytej odległości względem markera.

W przypadku białek SDS-PAGE jest zwykle pierwszym wyborem jako test czystości ze względu na jego niezawodność i łatwość. Obecność SDS i etap denaturacji powodują separację białek, w przybliżeniu na podstawie wielkości, ale może wystąpić nieprawidłowa migracja niektórych białek. Różne białka mogą również wybarwiać się w różny sposób, co zakłóca ocenę ilościową przez barwienie. PAGE można również stosować jako technikę preparatywną do oczyszczania białek. Na przykład, ilościowa preparatywna ciągła elektroforeza w żelu poliakrylamidowym ( QPNC-PAGE ) jest metodą rozdzielania natywnych metaloprotein w złożonych matrycach biologicznych.

Składniki chemiczne i ich role

Żel poliakrylamidowy (PAG) był znany jako potencjalne podłoże do zatapiania tkanek do skrawania już w 1964 roku, a dwie niezależne grupy stosowały PAG w elektroforezie w 1959 roku. Posiada kilka pożądanych elektroforetycznie właściwości, które czynią go uniwersalnym podłożem. Jest to syntetyczny, termostabilny, przezroczysty, mocny, chemicznie względnie obojętny żel i może być przygotowany z szerokim zakresem średnich rozmiarów porów. Wielkość porów żelu i powtarzalność wielkości porów żelu są określane przez trzy czynniki, całkowitą ilość obecnego akryloamidu (%T) (T = Całkowite stężenie monomeru akryloamidu i bisakryloamidu), ilość środka sieciującego (%C ) (C = stężenie bisakryloamidu) oraz czas polimeryzacji akryloamidu (por. QPNC-PAGE). Rozmiar porów zmniejsza się wraz ze wzrostem %T; z usieciowaniem, 5% C daje najmniejszą wielkość porów. Każdy wzrost lub spadek %C z 5% zwiększa rozmiar porów, ponieważ rozmiar porów w stosunku do %C jest funkcją paraboliczną z wierzchołkiem jako 5%C. Wydaje się, że jest to spowodowane niejednorodnym wiązaniem nici polimerowych w żelu. Ten materiał żelowy może również wytrzymaćgradientywysokiego napięcia , jest podatny na różne procedury barwienia i odbarwiania i może być trawiony w celu ekstrakcji rozdzielonych frakcji lub suszony w celu autoradiografii i trwałej rejestracji.

składniki

Żele poliakrylamidowe składają się z żelu układającego i rozdzielającego. Żele do układania w stos mają wyższą porowatość w stosunku do żelu rozdzielającego i umożliwiają migrację białek w skoncentrowanym obszarze. Dodatkowo, żele do układania w stosy mają zwykle pH 6,8, ponieważ obojętne cząsteczki glicyny pozwalają na szybszą mobilność białek. Żele rozdzielające mają pH 8,8, gdzie anionowa glicyna spowalnia ruchliwość białek. Żele rozdzielające pozwalają na separację białek i mają stosunkowo niższą porowatość. Tutaj białka są rozdzielane na podstawie wielkości (w SDS-PAGE) i wielkości/ładunku (Native PAGE).

Bufor chemiczny stabilizuje wartość pH do pożądanej wartości w samym żelu oraz w buforze do elektroforezy. Wybór buforu wpływa również na ruchliwość elektroforetyczną przeciwjonów buforowych, a tym samym na rozdzielczość żelu. Bufor powinien być również nieaktywny i nie modyfikować ani nie reagować z większością białek. W zależności od zastosowania jako bufory katodowe i anodowe można stosować różne bufory. W jednym żelu można stosować wiele wartości pH, na przykład w elektroforezie DISC. Typowe bufory w PAGE obejmują Tris , Bis-Tris lub imidazol .

Przeciwjon równoważy ładunek wewnętrzny jonu buforowego, a także wpływa na natężenie pola elektrycznego podczas elektroforezy. Wysoko naładowane i ruchome jony są często unikane w buforach katodowych SDS-PAGE, ale mogą być zawarte w samym żelu, gdzie migrują przed białkiem. W zastosowaniach takich jak DISC SDS-PAGE wartości pH w żelu mogą się zmieniać, aby zmienić średni ładunek przeciwjonów podczas przebiegu, aby poprawić rozdzielczość. Popularne przeciwjony to glicyna i tricyna . Glicynę stosowano jako źródło jonu ciągnącego lub jonu wolnego, ponieważ jej pKa wynosi 9,69, a ruchliwość glicynianu jest taka, że ​​efektywną ruchliwość można ustawić na wartości poniżej wartości najwolniejszych znanych białek o ujemnym ładunku netto w zakresie pH. Minimalne pH w tym zakresie wynosi około 8,0.

Akrylamid ( C
3h
5NIE ; mW: 71,08) po rozpuszczeniu w wodzie następuje powolna, spontaniczna autopolimeryzacja akryloamidu, łącząca cząsteczki ze sobą na zasadzie „głowa do ogona” w celu utworzenia długich jednołańcuchowych polimerów. Obecność układu generującego wolne rodniki znacznie przyspiesza polimeryzację. Ten rodzaj reakcji jest znany jako polimeryzacja addycyjna winylu . Roztwór tych łańcuchów polimerowych staje się lepki, ale nie tworzy żelu, ponieważ łańcuchy po prostu ślizgają się po sobie. Tworzenie żelu wymaga połączenia ze sobą różnych łańcuchów. Akrylamid jest rakotwórczy , neurotoksyna i toksyna reprodukcyjna. Niezbędne jest również przechowywanie akryloamidu w chłodnym, ciemnym i suchym miejscu, aby ograniczyć autopolimeryzację i hydrolizę .

Bisakrylamid ( N , N ′-metylenobisakryloamid ) ( C
7h
10n
2O
2; mW: 154,17) jest najczęściej stosowanym środkiem sieciującym w żelach poliakrylamidowych. Chemicznie można to traktować jako dwie cząsteczki akryloamidu połączone „głowa w łeb” na ich niereaktywnych końcach. Bisakrylamid może sieciować ze sobą dwa łańcuchy poliakryloamidowe, tworząc w ten sposób żel.

Dodecylosiarczan sodu (SDS) ( C
12h
25NaO
4S ; mW: 288.38) (stosowany tylko w denaturujących żelach białkowych) jest silnym środkiem detergentowym stosowanym do denaturacji natywnych białek do poszczególnych polipeptydów . Ta denaturacja, która jest określana jako denaturacja rekonstrukcyjna, nie jest osiągana przez całkowitą linearyzację białka, ale zamiast tego przez zmianę konformacyjną na kombinację struktur drugorzędowych kłębka nieuporządkowanego i helisy α. Gdy mieszaninę białek ogrzewa się do 100°C w obecności SDS, detergent owija się wokół szkieletu polipeptydowego. Wiąże się z polipeptydami w stałym stosunku wagowym 1,4 g SDS/g polipeptydu. W tym procesie, wewnętrzne ładunki polipeptydów stają się nieistotne w porównaniu z ładunkami ujemnymi wnoszonymi przez SDS. Zatem polipeptydy po obróbce stają się strukturami podobnymi do pręcików o jednorodnej gęstości ładunku, to znaczy takim samym ujemnym ładunku netto na jednostkę masy. Ruchliwość elektroforetyczna tych białek jest liniową funkcją logarytmów ich mas cząsteczkowych. Bez SDS różne białka o podobnych masach cząsteczkowych migrowałyby inaczej ze względu na różnice w stosunku masy do ładunku, ponieważ każde białko ma punkt izoelektryczny i masę cząsteczkową charakterystyczną dla jego struktury pierwotnej . Nazywa się to natywną PAGE . Dodanie SDS rozwiązuje ten problem, ponieważ wiąże się z białkiem i rozkłada się, dając prawie jednorodny ładunek ujemny na całej długości polipeptydu.

mocznik ( CO(NH
2)
2; mW: 60,06) jest czynnikiem chaotropowym, który zwiększa entropię układu poprzez zakłócanie oddziaływań wewnątrzcząsteczkowych, w których pośredniczą siły niekowalencyjne , takie jak wiązania wodorowe i siły van der Waalsa . Struktura makromolekularna jest zależna od efektu netto tych sił, stąd wynika, że ​​wzrost chaotropowych substancji rozpuszczonych powoduje denaturację makromolekuł,

Nadsiarczan amonu (APS) ( N
2h
8S
2O
8; mW: 228,2) jest źródłem wolnych rodników i jest często stosowany jako inicjator tworzenia żelu. Alternatywnym źródłem wolnych rodników jest ryboflawina , która w reakcji fotochemicznej wytwarza wolne rodniki .

TEMED ( N , N , N ′, N ′-tetrametyloetylenodiamina) ( C
6h
16n
2; mW: 116,21) stabilizuje wolne rodniki i poprawia polimeryzację. Szybkość polimeryzacji i właściwości powstałego żelu zależą od stężenia wolnych rodników. Zwiększenie ilości wolnych rodników powoduje zmniejszenie średniej długości łańcucha polimeru, wzrost zmętnienia żelu oraz spadek elastyczności żelu. Zmniejszenie kwoty pokazuje efekt odwrotny. Należy stosować najniższe stężenia katalityczne, które pozwalają na polimeryzację w rozsądnym czasie. APS i TEMED są zwykle stosowane w przybliżeniu w stężeniach równomolowych w zakresie od 1 do 10 mM.

Chemia do przetwarzania i wizualizacji

PAGE białek rotawirusa wybarwionych błękitem Coomassie

Do obróbki żelu i wizualizowanych w nim próbek białek stosuje się następujące chemikalia i procedury.

Barwnik śledzący; ponieważ białka i kwasy nukleinowe są w większości bezbarwne, ich przechodzenie przez żel podczas elektroforezy nie jest łatwe do śledzenia. Barwniki anionowe o znanej ruchliwości elektroforetycznej są zatem zwykle zawarte w buforze próbki PAGE. Bardzo popularnym barwnikiem śledzącym jest błękit bromofenolowy (BPB, 3',3",5',5"tetrabromofenolosulfonoftaleina). Barwnik ten jest barwiony przy alkalicznym i neutralnym pH i jest małą ujemnie naładowaną cząsteczką, która porusza się w kierunku anody . Będąc wysoce mobilną cząsteczką, wyprzedza większość białek. Po osiągnięciu końca anodowego elektroforezy elektroforeza w medium zostaje zatrzymana. Może słabo wiązać się z niektórymi białkami i nadawać niebieski kolor. Inne popularne barwniki śledzące to cyjanol ksylenu , który ma niższą mobilność i Orange G , który ma wyższą mobilność.

Pomoce ładujące; większość systemów PAGE jest ładowana od góry do dołków w żelu. Aby próbka opadła na dno żelu, bufor próbki jest uzupełniany dodatkami zwiększającymi gęstość próbki. Dodatki te powinny być niejonowe i niereaktywne w stosunku do białek, aby uniknąć zakłócania elektroforezy. Powszechnymi dodatkami są glicerol i sacharoza .

Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB)( C
45h
44n
3NaO
7S
2; mW: 825,97 jest najpopularniejszym barwnikiem białkowym. Jest to barwnik anionowy, który niespecyficznie wiąże się z białkami. Struktura CBB jest w przeważającej mierze niepolarna i jest zwykle stosowana w roztworze metanolowym zakwaszonym kwasem octowym. Białka w żelu są utrwalane kwasem octowym i jednocześnie barwione. Nadmiar barwnika wprowadzony do żelu można usunąć przez odbarwienie tym samym roztworem bez barwnika. Białka są wykrywane jako niebieskie prążki na czystym tle. Ponieważ SDS jest również anionowy, może zakłócać proces barwienia. Dlatego zaleca się dużą objętość roztworu barwiącego, co najmniej dziesięciokrotną objętość żelu.

Bromek etydyny (EtBr) jest popularnym barwnikiem kwasu nukleinowego. EtBr umożliwia łatwą wizualizację DNA lub RNA na żelu, ponieważ EtBr fluoryzuje pomarańczowy kolor w świetle UV. Bromek etydyny wiąże łańcuchy kwasów nukleinowych w procesie interkalacji. Chociaż bromek etydyny jest popularnym barwnikiem, należy zachować ostrożność podczas stosowania EtBr, ponieważ jest to znany czynnik rakotwórczy . Z tego powodu wielu badaczy decyduje się na stosowanie barwników, takich jak SYBR Green i SYBR Safe, które są bezpieczniejszą alternatywą dla EtBr. EtBr stosuje się po prostu dodając go do mieszaniny żelu. Po rozpuszczeniu żelu można go obejrzeć za pomocą systemu dokumentacji fotograficznej.

Barwienie srebrem jest stosowane, gdy potrzebna jest bardziej czuła metoda wykrywania, ponieważ klasyczne barwienie błękitem Coomassie Brilliant Blue może zwykle wykryć prążek białka 50 ng, barwienie srebrem zwiększa czułość zazwyczaj 10-100 razy bardziej. Opiera się to na chemii rozwoju fotograficznego. Białka są utrwalane w żelu rozcieńczonym roztworem metanolu, a następnie inkubowane z kwaśnym roztworem azotanu srebra. Jony srebra są redukowane do postaci metalicznej przez formaldehyd przy alkalicznym pH. Kwaśny roztwór, taki jak kwas octowy, zatrzymuje rozwój. Barwienie srebrem zostało wprowadzone przez Kerenyi i Gallyasa jako czułą procedurę wykrywania śladowych ilości białek w żelach . Technika została rozszerzona o badanie innych makrocząsteczek biologicznych , które zostały rozdzielone na różnych podłożach. Na intensywność koloru może wpływać wiele zmiennych, a każde białko ma swoją własną charakterystykę barwienia; czyste naczynia szklane, czyste odczynniki i woda o najwyższej czystości to kluczowe elementy udanego barwienia. Barwienie srebrem zostało opracowane w XIV wieku do barwienia powierzchni szkła. W tym celu był szeroko wykorzystywany od XVI wieku. Barwa uzyskana przez wczesne plamy srebra wahała się od jasnożółtego do pomarańczowo-czerwonego. Camillo Golgi udoskonalił barwienie srebrem do badania układu nerwowego . Metoda Golgiego barwi losowo ograniczoną liczbę komórek w całości.

Autoradiografia, stosowana również do wykrywania prążków białkowych po elektroforezie żelowej, wykorzystuje izotopy radioaktywne do znakowania białek, które są następnie wykrywane za pomocą kliszy rentgenowskiej.

Western blot to proces, w którym białka oddzielone w żelu akrylamidowym są przenoszone elektroforetycznie na stabilną, podatną na manipulację membranę, taką jak membrana nitrocelulozowa , nylonowa lub PVDF . Następnie możliwe jest zastosowanie technik immunochemicznych do wizualizacji przeniesionych białek, jak również dokładna identyfikacja względnych wzrostów lub spadków białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Zobacz też

Bibliografia

Zewnętrzne linki

Zasoby biblioteczne dotyczące
elektroforezy w żelu poliakrylamidowym