Immunodyfuzja promieniowa - Radial immunodiffusion

Immunodyfuzja radialna (RID) lub metoda Mancini Mancini immunodyfuzji lub pojedynczym teście immunodyfuzji promieniowy jest immunodyfuzji techniki stosowane w immunologii do określania ilości lub stężenia danego antygenu w próbce.

Opis

Przygotowanie

Roztwór zawierający przeciwciało jest dodawany do ogrzanego podłoża, takiego jak agar lub agaroza, rozpuszczone w buforowanym roztworze soli fizjologicznej . Stopioną pożywkę wylewa się następnie na szkiełko mikroskopowe lub do otwartego pojemnika, takiego jak szalka Petriego i pozostawia do ostygnięcia i utworzenia żelu . Roztwór zawierający antygen jest następnie umieszczany w studzience, którą wbija się w żel. Szkiełko lub pojemnik jest następnie przykrywany lub zamykany, aby zapobiec parowaniu.

Antygen dyfunduje promieniście do podłoża, tworząc krąg precypityny, który wyznacza granicę między przeciwciałem a antygenem. Średnica zwiększa się koła w czasie co dyfunduje z antygenem w podłożu, poddaje się reakcji z przeciwciałem, i tworzy nierozpuszczalne kompleksy precypitacji . Antygen określa się ilościowo mierząc średnicę okręgu precypityny i porównując go ze średnicami okręgu precypityny utworzonych przez znane ilości lub stężenia antygenu.

Kompleksy antygen-przeciwciało są małe i rozpuszczalne w nadmiarze antygenu. Dlatego opady w pobliżu środka okręgu są zwykle mniej gęste niż w pobliżu zewnętrznej krawędzi okręgu, gdzie antygen jest mniej skoncentrowany.

Ekspansja okręgu osiąga punkt końcowy i zatrzymuje się, gdy wolny antygen jest wyczerpany i gdy antygen i przeciwciało osiągają równoważność. Jednak klarowność i gęstość zewnętrznej krawędzi koła może nadal rosnąć po tym, jak okrąg przestanie się rozszerzać.

Interpretacja

W przypadku większości antygenów pole i kwadrat średnicy okręgu w punkcie końcowym okręgu są wprost proporcjonalne do ilości antygenu i odwrotnie proporcjonalne do stężenia przeciwciała. Dlatego wykres porównujący ilości lub stężenia antygenu w oryginalnych próbkach z powierzchniami lub kwadratami średnic okręgów precypityny na skalach liniowych będzie zwykle linią prostą po osiągnięciu przez wszystkie okręgi punktów końcowych (metoda równoważności) .

Kręgi, które tworzą małe ilości antygenu, osiągają swoje punkty końcowe, zanim zrobią to kręgi utworzone przez duże ilości. Dlatego też, jeśli mierzy się obszary lub średnice okręgów, podczas gdy niektóre, ale nie wszystkie, okręgi przestały się rozszerzać, taki wykres będzie prosty w części zawierającej mniejsze ilości lub stężenia antygenu i będzie zakrzywiony w części zawierającej większe ilości lub stężenia.

Podczas gdy kółka wciąż się rozszerzają, wykres porównujący ilości lub stężenia antygenu w skali logarytmicznej ze średnicami lub obszarami kół w skali liniowej może być linią prostą (metoda kinetyczna). Jednakże kręgi osadu są mniejsze i mniej wyraźne podczas ekspansji niż po zakończeniu ekspansji. Ponadto temperatura wpływa na szybkość rozszerzania się, ale nie wpływa na wielkość okręgu w jego punkcie końcowym. Ponadto zakres średnic okręgów dla tych samych ilości lub stężeń antygenu jest mniejszy, podczas gdy niektóre okręgi powiększają się niż po osiągnięciu przez wszystkie okręgi punktów końcowych.

Ilość i stężenie nierozpuszczalnych kompleksów antygen-przeciwciało na zewnętrznej krawędzi okręgu wzrasta z czasem. Przejrzystość i gęstość zewnętrznej krawędzi koła również wzrastają z czasem. W rezultacie pomiary rozmiarów okręgów i wykresy utworzone na podstawie tych pomiarów są często dokładniejsze po tym, jak okręgi przestają się rozszerzać, niż gdy okręgi wciąż się powiększają. Z tych powodów często bardziej pożądane jest wykonywanie pomiarów, gdy wszystkie okręgi osiągnęły swoje punkty końcowe, niż wykonywanie pomiarów, gdy niektóre lub wszystkie okręgi wciąż się powiększają.

Pomiary dużych okręgów są dokładniejsze niż pomiary małych okręgów. Dlatego często pożądane jest dostosowanie stężenia przeciwciała i ilości antygenu, aby zapewnić, że pierścienie precypityny będą duże.

Techniki immunodyfuzji promieniowej

Można określić stężenie antygenu w próbce, której stężenie jest nieznane, znajdując jego położenie na wykresie, który przedstawia średnice okręgów precypityny wytworzonych przez trzy lub więcej próbek referencyjnych o znanych stężeniach antygenu. Na takich wykresach dwie techniki często tworzą linie proste. Techniki wytwarzają te linie na różnych typach wykresów.

Techniki i ich wykresy to:

• Pomiar kółek, gdy wszystkie się rozszerzają (metoda kinetyczna): wykres przedstawiający logarytmy stężeń antygenu w funkcji średnicy kółek precypityny.
• Pomiarowe kółka po tym, jak wszystkie osiągną swoje punkty końcowe (metoda równoważności): wykres przedstawiający stężenia antygenu w funkcji kwadratów średnic kółek precypityny.

Bibliografia

Dalsza lektura

Zewnętrzne linki