Pojemność - Capacitation

Kapacytacji jest przedostatnim krokiem w dojrzewaniu ssaków plemników i jest niezbędny w celu nadania im właściwe do zapłodnienia się komórkę jajową . Ten krok jest wydarzeniem biochemicznym; plemniki poruszają się normalnie i wyglądają na dojrzałe przed kapacytacją. In vivo kapacytacja występuje po wytrysku , kiedy plemniki opuszczają pochwę i dostają się do górnych dróg rodnych samicy . W macicy pomaga w stopniach kapacytacji wydzielając steroli wiązania albuminy , lipoproteiny i proteolityczne i glycosidasic enzymy , takie jak heparyna.

Do celów zapłodnienia in vitro kapacytacja następuje poprzez inkubację plemników, które albo uległy wytryskowi, albo zostały wyekstrahowane z najądrza i inkubowane w określonym podłożu przez kilka godzin. Istnieją różne techniki wykonywania etapu kapacytacji: proste płukanie, migracja (podpływanie), gradienty gęstości i filtrowanie. Celem jest wyizolowanie jak największej liczby ruchliwych plemników i wyeliminowanie nieruchliwych lub martwych plemników. Po kapacytacji in vivo lub in vitro plemniki muszą przejść końcowy etap dojrzewania, aktywację, obejmującą reakcję akrosomową .

Plemniki inne niż ssaki nie wymagają tego etapu kapacytacji i są gotowe do zapłodnienia oocytu natychmiast po uwolnieniu od samca.

Funkcja i mechanizm

Kapacytacja ma dwa skutki: destabilizację błony akrosomalnej główki plemnika, która umożliwia jej penetrację zewnętrznej warstwy jaja oraz zmiany chemiczne w ogonie, które umożliwiają większą ruchliwość plemnika. Zmiany są ułatwiane przez usunięcie steroli ( np . cholesterolu ) i niekowalencyjnie związanych glikoprotein najądrza / nasienia . Rezultatem jest bardziej płynna membrana o zwiększonej przepuszczalności dla jonów Ca ²⁺ .

Napływ Ca ²⁺ powoduje wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu cAMP , a tym samym wzrost ruchliwości. Hiperaktywacja zbiega się z początkiem kapacytacji i jest wynikiem zwiększonych poziomów Ca ²⁺ . Wykazuje synergistyczne działanie stymulujące z adenozyną, która zwiększa aktywność cyklazy adenylylowej w plemnikach.

Peptyd promujący zapłodnienie tripeptydowe (FPP) jest niezbędny do kontrolowania kapacytacji. FPP jest produkowany w gruczole krokowym jako składnik płynu nasiennego. FPP wchodzi w kontakt z plemnikami podczas wytrysku, gdy plemnik miesza się z płynem nasiennym. Wysoki poziom aktywnego FPP zapobiega kapacytacji. Po wytrysku stężenie FPP spada w żeńskim układzie rozrodczym.

Wprowadzenie

Ponieważ technologie wspomaganego rozrodu lub ART, takie jak zapłodnienie in vitro (IVF) lub inseminacja domaciczna (IUI) wymagają indukcji kapacytacji plemników poza normalnymi parametrami biologicznymi, opracowano wiele metod indukowania tego procesu w komórkach plemników ssaków. Plemniki są zbierane przez wytrysk lub z najądrza ogonowego i pozostawiane do upłynnienia w temperaturze pokojowej. Kapacytację można następnie wywołać przez dodanie pożywki zaprojektowanej tak, aby naśladować skład elektrolityczny jajowodów , w których następuje zapłodnienie. Pożywki te różnią się w zależności od gatunku, ale są oparte na soli fizjologicznej i zawierają substraty energetyczne, takie jak mleczan, pirogronian i prawdopodobnie glukoza. Akceptor cholesterolu jest niezbędny do ułatwienia usuwania cholesterolu z błony plemnika, którym zawsze jest albumina. Albuminę surowicy bydlęcej typowo stosuje się w badaniach na zwierzętach in vitro , a albuminę surowicy ludzkiej (HSA) stosuje się w indukcji kapacytacji nasienia ludzkiego.

Wodorowęglan jest niezbędnym składnikiem pożywek indukujących kapacytację, ponieważ jest współtransportowany do cytozolu, gdzie aktywuje rozpuszczalną cyklazę adenylylową (sAC) oraz działa jako bufor pH niezbędny do zapobiegania spadkowi pH w hodowli, co jest niezbędnym dodatkiem po inkubacji komórek w 5% cO ₂ jak to jest powszechnie stosowane, chociaż nie konieczne. Chlorek wapnia jest dodawany w celu ułatwienia napływu kationów wapnia. W modelach zwierzęcych podłoże Tyrode's albumin mleczan pirogronian (TALP) jest zwykle używane jako baza, która zawiera każdy z tych składników. U ludzi stosuje się ludzki płyn jajowodowy (HTF).

Pożywki te można uzupełnić innymi chemikaliami w celu wywołania nadaktywnej ruchliwości plemników i/lub reakcji akrosomowej. Do zapłodnienia zwierząt in vitro kofeina w stężeniu 5 mM jest silnym induktorem kapacytacji plemników in vitro . Jonofory wapnia są również idealne do indukowania kapacytacji. Dodanie heparyny kapacytacji podłoża indukującego naśladuje wydzielanie heparynopodobne gycosaminoglycans (GAG) w pobliżu komórki jajowej i inicjuje reakcję akrosomową. Efekt ten jest spotęgowany po dodaniu lizofosfatydylocholiny (LC) w połączeniu z heparyną. Wykazano, że katecholaminy, takie jak noradrenalina w niskich stężeniach, wspomagają indukcję reakcji akrosomów.

Techniki kapacytacji in vitro

Tradycyjne metody wykonywania kapacytacji in vitro to:

• Proste mycie: ta metoda eliminuje jedynie osocze nasienia, nie wybiera najlepszych plemników. Próbkę odwirowuje się, a następnie usuwa się supernatant. Stosuje się go w próbkach z ciężkiej oligozoospermii, kryptozoospermii lub biopsji jąder. Jest wykonywany również przed innymi technikami kapacytacyjnymi.

• Migracja (podpływ). Po pierwsze następuje wirowanie i eliminacja osocza nasiennego. Następnie od góry dodaje się 0,5-1 ml pożywki hodowlanej i po okresie inkubacji w temperaturze 37°C najlepiej poruszające się plemniki wzniosą się od dołu do góry probówki (zdrowe plemniki trafiają do pożywki hodowlanej). W celu uzyskania frakcji bogatej w plemniki pobierana jest warstwa wierzchnia. Jest nadal szeroko stosowany i przydatny w normozoospermii. Pozwala na uzyskanie frakcji zawierających ponad 90% plemników PR.

• Gradienty gęstości. W tej technice rurkę wypełnia się warstwami płynów o różnej gęstości, a na wierzchnią warstwę umieszcza się nasienie. Następnie probówka przechodzi przez wirowanie w celu odfiltrowania szczątków komórkowych i nieruchliwych komórek. Po odwirowaniu zdrowe plemniki znajdują się na bardzo dolnej warstwie płynu w probówce, natomiast szczątki i nieruchome plemniki znajdują się w górnych warstwach. Procedura ta trwa około 60 minut i jest szczególnie wskazana w próbkach oligozoospermii, astenozoospermii i obfitych szczątków. W końcu wszystkie komórki dotrą na dno, ale te o większej ruchliwości dotrą wcześniej. Ta procedura jest często nazywana po prostu „metodą Percolla”, ponieważ Percoll był często używany jako nośnik gęstości, ale obecnie używane są inne nośniki gęstości.

• Filtrowanie. Polega na filtrze, który nie przepuszcza każdego plemnika. Obecnie jest rzadziej stosowany i przez filtr przejdą tylko plemniki o lepszej ruchliwości.

Jednak w dzisiejszych czasach pojawiają się nowe techniki, które przewyższają te. Na przykład mamy chipy PICSI, MACS lub mikroprzepływowe.

Pomiar

Opracowano wiele metod oceny stopnia kapacytacji plemników in vitro. Wspomagana komputerowo analiza nasienia (CASA) została opracowana w latach 80. XX wieku w celu pomiaru kinematyki plemników. CASA wykorzystuje mikroskopię z kontrastem fazowym w połączeniu z oprogramowaniem do śledzenia plemników do analizy parametrów ruchliwości plemników. Wykazano, że niektóre parametry, takie jak prędkość krzywoliniowa (VCL), prędkość w linii prostej (VSL), średnia prędkość drogi (VAP) i amplituda bocznego przemieszczenia głowy (ALH) są dodatnio skorelowane z nabywaniem kompetencji w zakresie nawożenia, a zatem są wykorzystywane do identyfikacji nadaktywnej ruchliwości plemników.

Chociaż pomiary ruchliwości mają kluczowe znaczenie dla identyfikacji obecności nadpobudliwej ruchliwości, opracowano dodatkowe metody identyfikacji występowania reakcji akrosomowej. Prosta metoda wykorzystuje brylantowy błękit Coomassie G250 do barwienia komórek, zapewniając wizualne dowody nienaruszonych lub przereagowanych akrosomów. Bardziej zaawansowane techniki wykorzystują metody mikroskopii fluorescencyjnej lub elektronowej . Do fluorescencyjnego znakowania akrosomu plemników można użyć aglutyninę orzechową sprzężoną z fluoresceiną (FITC-PNA) lub aglutyninę Pisum sativum (FITC-PSA), którą można następnie wykorzystać do oceny stanu akrosomu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego .

Odkrycie

Odkrycie tego procesu zostało niezależnie odnotowane w 1951 roku przez Min Chueh Chang i Colina Russella Austina .

Zobacz też

• Reakcja korowa
• Reakcja akrosomowa

Bibliografia

Dalsza lektura

Zewnętrzne linki

• Plemnik+Capacitation w Narodowej Bibliotece Medycznej USA Medical Subject Headings (MeSH)