Kinetyka enzymów - Enzyme kinetics

Reduktaza dihydrofolianowa z E. coli z jej dwoma substratami dihydrofolianem (po prawej) i NADPH (po lewej), związanymi w miejscu aktywnym. Białko jest pokazane jako diagram wstęgowy , z alfa helisami na czerwono, beta osłonkami na żółto i pętlami na niebiesko. Generowany z 7DFR .

Kinetyka enzymatyczna to badanie szybkości katalizowanych przez enzymy reakcji chemicznych . W kinetyce enzymów mierzy się szybkość reakcji i bada skutki zmiany warunków reakcji. Badanie kinetyki enzymu w ten sposób może ujawnić mechanizm katalityczny tego enzymu, jego rolę w metabolizmie , sposób kontrolowania jego aktywności oraz sposób, w jaki lek lub modyfikator ( inhibitor lub aktywator ) może wpływać na szybkość.

Enzym (E) jest zazwyczaj cząsteczką białka , która promuje reakcję innej cząsteczki, jej substratu (S). Wiąże się on z miejscem aktywnym enzymu, tworząc kompleks enzym-substrat ES i jest przekształcany w kompleks enzym-produkt EP, a stamtąd w produkt P, poprzez stan przejściowy ES*. Szereg kroków jest znany jako mechanizm :

E + S ⇄ ES ⇄ ES* ⇄ EP ⇄ E + P

Ten przykład zakłada najprostszy przypadek reakcji z jednym substratem i jednym produktem. Takie przypadki istnieją: na przykład mutaza, taka jak fosfoglukomutaza, katalizuje przeniesienie grupy fosfo z jednej pozycji do drugiej, a izomeraza jest bardziej ogólnym określeniem enzymu, który katalizuje każdą jednosubstratową reakcję jednego produktu, taką jak izomeraza triosefosforanowa . Jednak takie enzymy nie są bardzo powszechne i mają przewagę liczebną enzymów, które katalizują dwusubstratowe reakcje dwuproduktowe: są to na przykład dehydrogenazy zależne od NAD, takie jak dehydrogenaza alkoholowa , która katalizuje utlenianie etanolu przez NAD ⁺ . Reakcje z trzema lub czterema substratami lub produktami są mniej powszechne, ale istnieją. Nie ma konieczności, aby liczba produktów była równa liczbie podłoży; na przykład dehydrogenaza 3-fosforanu aldehydu glicerynowego ma trzy substraty i dwa produkty.

Gdy enzymy wiążą wiele substratów, takich jak reduktaza dihydrofolianowa (pokazana po prawej), kinetyka enzymów może również pokazać sekwencję, w której te substraty wiążą się i sekwencję, w której produkty są uwalniane. Przykładem enzymów, które wiążą pojedynczy substrat i uwalniają wiele produktów, są proteazy , które rozszczepiają jeden substrat białkowy na dwa produkty polipeptydowe. Inne łączą ze sobą dwa substraty, takie jak polimeraza DNA łącząca nukleotyd z DNA . Chociaż mechanizmy te są często złożonymi seriami etapów, zazwyczaj istnieje jeden etap determinujący szybkość, który określa ogólną kinetykę. Ten etap determinujący szybkość może być reakcją chemiczną lub zmianą konformacyjną enzymu lub substratów, takich jak te zaangażowane w uwalnianie produktu(ów) z enzymu.

Znajomość budowy enzymu jest pomocna w interpretacji danych kinetycznych. Na przykład struktura może sugerować, jak substraty i produkty wiążą się podczas katalizy; jakie zmiany zachodzą podczas reakcji; a nawet rola poszczególnych reszt aminokwasowych w mechanizmie. Niektóre enzymy znacząco zmieniają kształt podczas mechanizmu; w takich przypadkach pomocne jest określenie struktury enzymu zi bez związanych analogów substratu, które nie ulegają reakcji enzymatycznej.

Nie wszystkie katalizatory biologiczne są enzymami białkowymi: katalizatory oparte na RNA , takie jak rybozymy i rybosomy, są niezbędne dla wielu funkcji komórkowych, takich jak składanie i translacja RNA . Główna różnica między rybozymami a enzymami polega na tym, że katalizatory RNA składają się z nukleotydów, podczas gdy enzymy składają się z aminokwasów. Rybozymy wykonują również bardziej ograniczony zestaw reakcji, chociaż ich mechanizmy reakcji i kinetykę można analizować i klasyfikować tymi samymi metodami.

Ogólne zasady

Gdy do reakcji dodawane są większe ilości substratu , dostępne miejsca wiązania enzymów wypełniają się do granicy . Po przekroczeniu tej granicy enzym jest wysycony substratem i szybkość reakcji przestaje rosnąć.${\displaystyle V_{\max}}$

Reakcja katalizowana przez enzym wykorzystuje dokładnie te same reagenty i wytwarza dokładnie te same produkty, co reakcja niekatalizowana. Podobnie jak inne katalizatory , enzymy nie zmieniają położenia równowagi między substratami a produktami. Jednak w przeciwieństwie do niekatalizowanych reakcji chemicznych, reakcje katalizowane enzymami wykazują kinetykę nasycenia. Przy danym stężeniu enzymu i przy stosunkowo niskich stężeniach substratu szybkość reakcji wzrasta liniowo wraz ze stężeniem substratu; cząsteczki enzymu mogą w dużej mierze katalizować reakcję, a rosnące stężenie substratu oznacza rosnące tempo, w jakim cząsteczki enzymu i substratu spotykają się ze sobą. Jednak przy stosunkowo wysokich stężeniach substratu szybkość reakcji asymptotycznie zbliża się do teoretycznego maksimum; miejsca aktywne enzymu są prawie w całości zajęte przez substraty, co skutkuje nasyceniem, a szybkość reakcji jest określona przez wewnętrzną szybkość obrotu enzymu. Stężenie substratu pośrednich pomiędzy tymi dwoma przypadkami ograniczającym jest oznaczony K _M . A zatem, K _M oznacza stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji jest połową prędkości maksymalnej.

Dwie najważniejsze właściwości kinetyczne enzymu to łatwość nasycenia enzymu określonym substratem i maksymalna szybkość, jaką może osiągnąć. Znajomość tych właściwości sugeruje, co enzym może zrobić w komórce i może pokazać, w jaki sposób enzym zareaguje na zmiany w tych warunkach.

Testy enzymatyczne

Krzywa postępu reakcji enzymatycznej. Nachylenie w początkowym okresie szybkości to początkowa szybkość reakcji v . Równania Michaelisa-Mentena opisano sposób zbocza zmienia się wraz ze stężeniem substratu.

Testy enzymatyczne to procedury laboratoryjne, które mierzą szybkość reakcji enzymatycznych. Ponieważ enzymy nie są zużywane w katalizowanych przez nie reakcjach, testy enzymatyczne zwykle śledzą zmiany stężenia substratów lub produktów w celu zmierzenia szybkości reakcji. Istnieje wiele metod pomiaru. W testach spektrofotometrycznych obserwuje się zmianę absorbancji światła między produktami i reagentami; Testy radiometryczne obejmują włączanie lub uwalnianie radioaktywności w celu pomiaru ilości produktu wytworzonego w czasie. Testy spektrofotometryczne są najwygodniejsze, ponieważ pozwalają na ciągły pomiar szybkości reakcji. Chociaż testy radiometryczne wymagają usunięcia i zliczenia próbek (tj. są testami nieciągłymi), są zwykle niezwykle czułe i mogą mierzyć bardzo niskie poziomy aktywności enzymu. Analogicznym podejściem jest zastosowanie spektrometrii masowej do monitorowania włączania lub uwalniania stabilnych izotopów w miarę przekształcania substratu w produkt. Czasami test kończy się niepowodzeniem i podejścia są niezbędne do wskrzeszenia nieudanego testu.

Najbardziej czułe testy enzymatyczne wykorzystują lasery skupione pod mikroskopem do obserwacji zmian w pojedynczych cząsteczkach enzymu, które katalizują ich reakcje. Pomiary te używa się albo zmiany w fluorescencji z kofaktorów podczas mechanizmu reakcji enzymu, albo z barwników fluorescencyjnych dodane do konkretnych miejsc w białku dla przemieszczania raportów, które występują podczas katalizy. Badania te dostarczają nowego spojrzenia na kinetykę i dynamikę pojedynczych enzymów, w przeciwieństwie do tradycyjnej kinetyki enzymów, w której obserwuje się przeciętne zachowanie populacji milionów cząsteczek enzymów.

Przykładowa krzywa postępu dla testu enzymatycznego jest pokazana powyżej. Enzym wytwarza produkt z początkową szybkością, która jest w przybliżeniu liniowa przez krótki okres po rozpoczęciu reakcji. W miarę postępu reakcji i zużycia substratu, szybkość stale spada (dopóki substrat nie jest jeszcze na poziomie nasycenia). Aby zmierzyć początkową (i maksymalną) szybkość, testy enzymatyczne są zazwyczaj przeprowadzane, gdy reakcja postępuje tylko o kilka procent w kierunku całkowitego zakończenia. Długość początkowego okresu szybkości zależy od warunków testu i może wynosić od milisekund do godzin. Jednak sprzęt do szybkiego mieszania cieczy umożliwia szybkie pomiary kinetyczne przy początkowych szybkościach poniżej jednej sekundy. Te bardzo szybkie testy są niezbędne do pomiaru kinetyki przed stanem ustalonym, które omówiono poniżej.

Większość badań kinetyki enzymów koncentruje się na tej początkowej, w przybliżeniu liniowej części reakcji enzymatycznych. Jednak możliwe jest również zmierzenie całej krzywej reakcji i dopasowanie tych danych do nieliniowego równania szybkości . Ten sposób pomiaru reakcji enzymatycznych nazywa się analizą krzywych postępu. To podejście jest przydatne jako alternatywa dla szybkiej kinetyki, gdy początkowa szybkość jest zbyt duża, aby można ją było dokładnie zmierzyć.

Reakcje jednosubstratowe

Enzymy z mechanizmami jednosubstratowymi obejmują izomerazy, takie jak izomeraza triozofosforanowa lub mutaza bisfosfoglicerynianowa , liazy wewnątrzcząsteczkowe, takie jak cyklaza adenylanowa i rybozym typu hammerhead , liaza RNA. Jednak niektóre enzymy, które mają tylko jeden substrat, nie należą do tej kategorii mechanizmów. Przykładem tego jest katalaza , ponieważ enzym reaguje z pierwszą cząsteczką substratu nadtlenku wodoru , utlenia się, a następnie jest redukowany przez drugą cząsteczkę substratu. Chociaż w grę wchodzi pojedynczy substrat, istnienie zmodyfikowanego produktu pośredniego enzymu oznacza, że ​​mechanizm katalazy jest w rzeczywistości mechanizmem ping-pong, rodzajem mechanizmu omówionym w sekcji Reakcje wielosubstratowe poniżej.

Kinetyka Michaelisa-Mentena

Mechanizm reakcji chemicznej z katalizą enzymatyczną lub bez niej . Enzym (E) wiąże substrat (S) z wytworzeniem produktu (P).

Krzywa nasycenia dla reakcji enzymatycznej pokazująca zależność między stężeniem substratu a szybkością reakcji.

Ponieważ reakcje katalizowane enzymatycznie są nasycalne, ich szybkość katalizy nie wykazuje liniowej odpowiedzi na wzrost substratu. Jeśli początkowa szybkość reakcji jest mierzona w zakresie stężeń substratów (oznaczonych jako [S]), początkowa szybkość reakcji ( ) wzrasta wraz ze wzrostem [S], jak pokazano po prawej stronie. Jednakże, [S] jest wyższa, enzym zostaje nasycony podłoża i początkowa szybkość osiąga V _max , maksymalnej szybkości enzymu. ${\displaystyle v_{0}}$

Kinetyka Michaelisa-Mentena model reakcji jednego podłoża jest pokazana po prawej stronie. Następuje początkowa dwucząsteczkowa reakcja pomiędzy enzymem E i substratem S, w wyniku której powstaje kompleks enzym-substrat ES. Szybkość reakcji enzymatycznej wzrasta wraz ze wzrostem stężenia substratu do pewnego poziomu zwanego V _max ; przy _Vmax wzrost stężenia substratu nie powoduje żadnego wzrostu szybkości reakcji, ponieważ nie ma już enzymu (E) dostępnego do reakcji z substratem (S). Tutaj szybkość reakcji staje się zależna od kompleksu ES i reakcja staje się reakcją jednocząsteczkową o rzędzie zerowym. Chociaż mechanizm enzymatycznego na jednocząsteczkową reakcji może być dość skomplikowany, to zwykle jeden enzymatyczną szybkość reakcji, stwierdzając, że na to pozwala reakcja być modelowane jako jeden etap katalitycznego z pozorną jednocząsteczkową stałą szybkości k _cat . Jeżeli ścieżka reakcji przebiega przez jeden lub kilka związków pośrednich, k _cat będzie funkcją kilku elementarnych stałych szybkości, natomiast w najprostszym przypadku pojedynczej reakcji elementarnej (np. brak związków pośrednich) będzie identyczna z elementarną jednocząsteczkową stałą szybkości k ₂ . Widoczna jednocząsteczkowy stałą szybkości k _cat nazywa się również liczba obrotów i oznacza liczby maksymalnej reakcji enzymatycznych katalizowanych na sekundę. ${\ Displaystyle {\ ce {ES -> [k_ {cat}] E + P}}}$

Równania Michaelisa-Mentena opisuje sposób stosunek (początkowej) reakcja v ₀ zależy od położenia podłoża wiązania stanu równowagi i stałą szybkości k ₂ .

${\ Displaystyle v_ {0}= {\ Frac {V_ {\ max} [{\ ce {S}}]} {K_ {M} + [{\ ce {S}}]}}}$    (Równanie Michaelisa-Mentena)

ze stałymi

${\ Displaystyle {\ zacząć {wyrównany} K_ {M} \ & {\ stackrel {\ operatorname {def}} {=}} \ {\ Frac {k_ {2}+ k_ {-1}} {k_ {1} }}\ok K_{D}\\V_{\max }\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ k_{cat}{\ce {[E]}}_{tot}\ koniec{wyrównany}}}$

To równanie Michaelisa-Mentena jest podstawą większości kinetyki enzymów jednosubstratowych. U podstaw tego równania leżą dwa kluczowe założenia (poza ogólnym założeniem, że mechanizm nie obejmuje jedynie hamowania pośredniego lub produktu i nie ma allosteryczności ani kooperatywności ). Pierwszym założeniem jest tak zwane założenie stanu quasi-stacjonarnego (lub hipoteza stanu pseudo-stacjonarnego), a mianowicie, że stężenie enzymu związanego z substratem (a tym samym również enzymu niezwiązanego) zmienia się znacznie wolniej niż stężenie produktu i substratu, a tym samym zmianę kompleksu w czasie można ustawić na zero . Drugim założeniem jest to, że całkowite stężenie enzymu nie zmienia się w czasie, a zatem . Pełne wyprowadzenie można znaleźć tutaj . ${\ Displaystyle d {\ ce {[ES]}} / {dt} \; {\ overset {!} {=}} \; 0}$${\ Displaystyle {\ ce {[e]}} _ {\ tekst {tot}} = {\ ce {[e]}} + {\ ce {[ES]}} \; {\ overset {!} {= }}\;{\text{const}}}$

Stała Michaelisa K _K eksperymentalnie zdefiniowane jako stężenie, przy którym szybkość reakcji enzymatycznej jest połowa V _max , które może być zweryfikowane przez zastąpienie [S] = K _K do równania Michaelis-Menten z i może być graficznie. Jeśli etap enzymatycznej szybkość ustalania się wolno w stosunku do podłoża (dysocjacji ), stałe Michaelisa K _M jest w przybliżeniu stała dysocjacji K _D ES złożone. ${\displaystyle k_{2}\ll k_{-1}}$

Jeśli jest mały w porównaniu z tym terminem, a także tworzy się bardzo mało kompleksu ES, a więc . Dlatego tempo tworzenia produktu wynosi ${\displaystyle {\ce {[S]}}}$${\ Displaystyle K_ {M}}$${\ Displaystyle [{\ ce {S}}] / (K_ {M} + [{\ ce {S}}]) \ około [{\ ce {S}}] / K_ {M}}$${\ Displaystyle {\ ce {[e] _ {\ rm {tot}} \ około [e]}}}$

${\displaystyle v_{0}\ok {\frac {k_{cat}}{K_{M}}}{\ce {[E][S]}}\qquad \qquad {\text{jeśli}}[{ \ce {S}}]\ll K_{M}}$

Tak więc szybkość tworzenia produktu zależy od stężenia enzymu, a także od stężenia substratu, równanie przypomina reakcję dwucząsteczkową z odpowiednią stałą szybkości pseudo-drugiego rzędu . Ta stała jest miarą wydajności katalitycznej . Najskuteczniejsze enzymy osiągają a w zakresie 10 ⁸ – 10 ¹⁰ M ^-1 s ^-1 . Enzymy te są tak wydajne, że skutecznie katalizują reakcję za każdym razem, gdy napotkają cząsteczkę substratu i tym samym osiągnęły górną teoretyczną granicę wydajności ( granica dyfuzji ); i są czasami określane jako enzymy kinetycznie doskonałe . Jednak większość enzymów jest daleka od doskonałości: średnie wartości i wynoszą odpowiednio około i . ${\displaystyle k_{2}/K_{M}}$${\displaystyle k_{2}/K_{M}}$  ${\ Displaystyle k_ {2}/K_ {\ rm {M}}}$${\displaystyle k_{2}}$${\ Displaystyle 10 ^ {5} {\ RM {s}} ^ {-1} {\ RM {M}} ^ {-1}}$${\ Displaystyle 10 {\ rm {s}} ^ {-1}}$

Bezpośrednie wykorzystanie równania Michaelisa-Mentena do analizy kinetycznej przebiegu w czasie

Obserwowane prędkości przewidywane za pomocą równania Michaelisa-Mentena można wykorzystać do bezpośredniego modelowania zaniku substratu w czasie i wytwarzania produktu poprzez włączenie równania Michaelisa-Mentena do równania kinetyki chemicznej pierwszego rzędu. Można to jednak osiągnąć tylko wtedy, gdy rozpozna się problem związany z wykorzystaniem liczby Eulera w opisie kinetyki chemicznej pierwszego rzędu. tj. e ^{− k} jest stałą podziału, która wprowadza błąd systematyczny do obliczeń i może być przepisana jako pojedyncza stała, która reprezentuje pozostały substrat po każdym okresie czasu.

${\ Displaystyle [S] = [S] _ {0} (1-k) ^ {t} \}$

${\ Displaystyle [S] = [S] _ {0} (1-V / [S] _ {0}) ^ {T} \,}$

${\ Displaystyle [S] = [S] _ {0} (1-(V_ {\ max} [S] _ {0}/(K_ {M} + [S] _ {0}) / [S] _ {0}))^{t}\,}$

W 1983 Stuart Beal (a także niezależnie Santiago Schnell i Claudio Mendoza w 1997) wypracowali rozwiązanie w postaci zamkniętej dla analizy kinetyki przebiegu czasowego mechanizmu Michaelisa-Mentena. Rozwiązanie, znane jako równanie Schnella-Mendozy, ma postać:

${\ Displaystyle {\ Frac {[S]} {K_ {M}}} = W \ lewo [F (t) \ prawo] \,}$

gdzie W[] jest funkcją Lamberta-W . i gdzie F(t) to

${\ Displaystyle F (t) = {\ Frac {[S] _ {0}} {K_ {M}}} \ exp \! \ lewo ({\ Frac {[S] _ {0}} {K_ {M }}}-{\frac {V_{\max }}{K_{M}}}\,t\prawo)\,}$

Równanie to obejmuje poniższe równanie, uzyskane przez Berberana-Santosa, które jest również ważne, gdy początkowe stężenie substratu jest zbliżone do stężenia enzymu,

${\ Displaystyle {\ Frac {[S]} {K_ {M}}} = W \ lewo [F (t) \ prawo] - {\ Frac {V_ {\ max}} {k_ {kot} K_ {M} }}\ {\frac {W\lewo[F(t)\prawo]}{1+W\lewo[F(t)\prawo]}}\,}$

gdzie W[ ] jest ponownie funkcją Lamberta-W .

Wykresy liniowe równania Michaelisa-Mentena

Lineweaver-Burk lub podwójnie odwrotny wykres danych kinetycznych, pokazujący znaczenie przecięć osi i gradientu.

Wykres v versus [S] powyżej nie jest liniowy; chociaż początkowo liniowy przy niskim [S], pochyla się do nasycenia przy wysokim [S]. Przed nowoczesnej ery nieliniowego dopasowania krzywej na komputerach, to nieliniowość mogłyby utrudnić oszacowanie K _M i V _max dokładnie. Dlatego kilka opracowali linearisations równania Michaelis-Menten, takie jak wykresu Lineweavera-Burka , w schemacie Eadie-Hofstee i działki Hanes, Woolf . Wszystkie te liniowe reprezentacje mogą być przydatne do wizualizacji danych, ale żadna nie powinna być używana do określania parametrów kinetycznych, ponieważ oprogramowanie komputerowe jest łatwo dostępne, co pozwala na dokładniejsze określenie metodami regresji nieliniowej .

Działka Lineweavera-Burka lub podwójne wzajemny działka jest powszechnym sposobem ilustrującym danych kinetycznych. Wynika to z odwrotności obu stron równania Michaelisa-Mentena. Jak pokazano po prawej, jest to liniowa forma równania Michaelisa-Mentena i tworzy linię prostą z równaniem y = m x + c z punktem przecięcia y równoważnym 1/ V _max i punktem przecięcia x wykresu stanowiących -1 / K _K .

${\ Displaystyle {\ Frac {1} {v}} = {\ Frac {K_ {M}} {V_ {\ max} [{\ mbox {S}}]}} + {\ Frac {1} {V_ { \maks }}}}$

Oczywiście nie można przyjąć żadnych wartości doświadczalnych przy ujemnym 1/[S]; dolna wartość graniczna 1/[S] = 0 (punkt przecięcia y ) odpowiada nieskończonemu stężeniu substratu, gdzie 1/v=1/ _Vmax jak pokazano po prawej; zatem punkt przecięcia x jest ekstrapolacją danych eksperymentalnych pobranych przy dodatnich stężeniach. Bardziej ogólnie, wykres Lineweavera-Burka pochylenie znaczenie pomiarów przy niskich stężeniach substratów, a więc może dostarczyć niedokładne oszacowania V _max i K, _M . Bardziej dokładną metodą wykreślania liniowego jest wykres Eadie-Hofstee . W tym przypadku v jest wykreślane względem v /[S]. W trzeciej wspólnej reprezentacji liniowej wykres Hanesa–Wolfa , [S]/ v jest wykreślany względem [S]. Ogólnie rzecz biorąc, normalizacja danych może pomóc w zmniejszeniu ilości pracy eksperymentalnej i może zwiększyć wiarygodność wyników, i jest odpowiednia zarówno do analizy graficznej, jak i numerycznej.

Praktyczne znaczenie stałych kinetycznych

Badanie kinetyki enzymów jest ważne z dwóch podstawowych powodów. Po pierwsze, pomaga wyjaśnić, jak działają enzymy, a po drugie, pomaga przewidzieć, jak zachowują się enzymy w żywych organizmach. Stałe kinetyczne określono powyżej, K _K i V _max , są krytyczne dla prób rozumieją, jak enzymy działają razem na regulację metabolizmu .

Dokonywanie tych przewidywań nie jest trywialne, nawet dla prostych systemów. Na przykład szczawiooctan jest tworzony przez dehydrogenazę jabłczanową w mitochondrium . Szczawiooctan może być następnie zużywany przez syntazę cytrynianową , karboksykinazę fosfoenolopirogronianową lub aminotransferazę asparaginianową , zasilając odpowiednio cykl kwasu cytrynowego , glukoneogenezę lub biosyntezę kwasu asparaginowego . Możliwość przewidzenia, ile szczawiooctanu wchodzi w który szlak, wymaga znajomości stężenia szczawiooctanu, a także stężenia i kinetyki każdego z tych enzymów. Ten cel przewidywania zachowania szlaków metabolicznych osiąga najbardziej złożoną ekspresję w syntezie ogromnych ilości danych kinetycznych i dotyczących ekspresji genów w matematyczne modele całych organizmów. Alternatywnie, użytecznym uproszczeniem problemu modelowania metabolicznego jest zignorowanie podstawowej kinetyki enzymów i poleganie tylko na informacjach o stechiometrii sieci reakcyjnej, technice zwanej analizą równowagi strumieni .

Kinetyka Michaelisa-Mentena z pośrednim

Można też rozważyć mniej prosty przypadek

${\displaystyle {\ce {{E}+S<=>[k_{1}][k_{-1}]ES->[k_{2}]EI->[k_{3}]{E}+ P}}}$

gdzie istnieje kompleks z enzymem i półproduktem i półprodukt jest przekształcany w produkt w drugim etapie. W tym przypadku mamy bardzo podobne równanie

${\ Displaystyle v_ {0}= k_ {kot} {\ Frac {{\ ce {[S] [E]_0}}} {K_ {M} ^ {\ prime} + {\ ce {[S]}} }}}$

ale stałe są różne

${\ Displaystyle {\ zacząć {wyrównany} K_ {M} ^ {\ prime} \ i {\ stackrel {\ operatorname {def} }{=}} \ {\ Frac {k_ {3}}{k_ {2}+ k_{3}}}K_{M}={\frac {k_{3}}{k_{2}+k_{3}}}\cdot {\frac {k_{2}+k_{-1}}{ k_{1}}}\\k_{cat}\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\dfrac {k_{3}k_{2}}{k_{2}+k_{ 3}}}\end{wyrównany}}}$

Widzimy, że dla przypadku granicznego , a więc gdy ostatni krok od jest znacznie szybszy niż poprzedni, otrzymujemy ponownie oryginalne równanie. Matematycznie mamy wtedy i . ${\displaystyle k_{3}\gg k_{2}}$${\ Displaystyle {\ ce {EI -> E + P}}}$${\ Displaystyle K_ {M} ^ {\ Prime} \ około K_ {M}}$${\displaystyle k_{kot}\ok k_{2}}$

Reakcje wielosubstratowe

Reakcje wielosubstratowe są zgodne ze złożonymi równaniami szybkości, które opisują sposób wiązania substratów iw jakiej kolejności. Analiza tych reakcji jest znacznie prostsza, jeśli stężenie substratu A jest utrzymywane na stałym poziomie, a substrat B zmienia się. W tych warunkach, enzym zachowuje się tak jak jednym substratem enzymu i wykresu V o [S] daje widocznych K _M i V _max stałe do podłoża B. Jeśli zestaw pomiarów wykonuje się w różnych stężeniach stałych z A, dane te można wykorzystać do ustalenia mechanizmu reakcji. W przypadku enzymu, który pobiera dwa substraty A i B i zamienia je w dwa produkty P i Q, istnieją dwa rodzaje mechanizmów: kompleks trójskładnikowy i ping-pong.

Mechanizmy trójczłonowe złożone

Mechanizm trójskładnikowego kompleksu losowego dla reakcji enzymatycznej. Ścieżka reakcji jest pokazana jako linia, a półprodukty enzymatyczne zawierające substraty A i B lub produkty P i Q są napisane poniżej linii.

W tych enzymach oba substraty wiążą się z enzymem w tym samym czasie, tworząc trójskładnikowy kompleks EAB. Kolejność wiązania może być losowa (w mechanizmie losowym) lub substraty muszą wiązać się w określonej kolejności (w uporządkowanym mechanizmie). Kiedy zestaw krzywych v przez [S] (stała A, zmienna B) z enzymu z mechanizmem potrójnie złożonym zostanie wykreślony na wykresie Lineweavera-Burka , zestaw utworzonych linii przetnie się.

Enzymy o mechanizmach kompleksów trójskładnikowych obejmują transferazę S- glutationową , reduktazę dihydrofolianową i polimerazę DNA . Poniższe linki przedstawiają krótkie animacje mechanizmów trójskładnikowych kompleksów enzymów reduktazy dihydrofolianowej i polimerazy DNA.

Mechanizmy ping-ponga

${\ Displaystyle {\ ce {\ przesunięty {}{E -> [{\ ce {A \ atop \ strzałka w dół}}] EA <=> E ^ {\ ast} P -> [{\ ce {P \ atop \ uparrow }}]E^{\ast }->[{\ce {B \atop \downarrow }}]E^{\ast }B<=>EQ->[{\ce {Q \atop \uparrow }} ]MI}}}}$

Mechanizm ping-ponga dla reakcji enzymatycznej. Półprodukty zawierają substraty A i B lub produkty P i Q.

Jak pokazano po prawej, enzymy z mechanizmem ping-ponga mogą występować w dwóch stanach, E i chemicznie zmodyfikowanej formie enzymu E*; ten zmodyfikowany enzym jest znany jako półprodukt . W takich mechanizmach substrat A wiąże się, zmienia enzym na E* poprzez np. przeniesienie grupy chemicznej do miejsca aktywnego, a następnie jest uwalniany. Dopiero po uwolnieniu pierwszego substratu substrat B może wiązać się i reagować ze zmodyfikowanym enzymem, regenerując niezmodyfikowaną formę E. Kiedy zestaw krzywych v przez [S] (stała A, zmienna B) z enzymu z mechanizmem ping-pong zostanie wykreślona na wykresie Lineweaver-Burk, zostanie utworzony zestaw równoległych linii. Nazywa się to fabułą wtórną .

Enzymy z mechanizmem ping-pong obejmują niektóre oksydoreduktazy, takie jak peroksydaza tioredoksynowa , transferazy, takie jak cytydylilotransferaza acyloneuraminowa i proteazy serynowe, takie jak trypsyna i chymotrypsyna . Proteazy serynowe to bardzo powszechna i zróżnicowana rodzina enzymów, w tym enzymy trawienne (trypsyna, chymotrypsyna i elastaza), kilka enzymów kaskady krzepnięcia krwi i wiele innych. W tych proteazach serynowych, związek pośredni E* jest acylo-enzymem utworzonym przez atak reszty seryny w miejscu aktywnym na wiązanie peptydowe w podłożu białkowym. Krótka animacja ukazująca mechanizm działania chymotrypsyny znajduje się tutaj.

Kataliza odwracalna i równanie Haldane'a

Czynniki zewnętrzne mogą ograniczać zdolność enzymu do katalizowania reakcji w obu kierunkach (podczas gdy sam charakter katalizatora oznacza, że ​​nie może on katalizować tylko jednego kierunku, zgodnie z zasadą mikroskopowej odwracalności ). Rozważamy przypadek enzymu, który katalizuje reakcję w obu kierunkach:

${\displaystyle {\ce {{E}+{S}<=>[k_{1}][k_{-1}]ES<=>[k_{2}][k_{-2}]{E} +{P}}}}$

Stan stacjonarny, początkowa szybkość reakcji wynosi ${\ Displaystyle V_ {0}= {\ Frac {d \, [{\ rm {P}}]} {dt}} = {\ Frac {(k_ {1} k_ {2} \ [{\ rm { S}}]-k_{-1}k_{-2}[{\rm {P}}])[{\rm {E}}]_{0}}{k_{-1}+k_{2} +k_{1}\,[{\rm {S}}]+k_{-2}\,[{\rm {P}}]}}}$

${\displaystyle v_{0}}$jest dodatnia, jeśli reakcja przebiega w kierunku do przodu ( ), a ujemna w przeciwnym razie. ${\displaystyle S\rightarrow P}$

Równowaga tego wymaga , co ma miejsce, gdy . To pokazuje, że termodynamika wymusza związek między wartościami 4 stałych szybkości. ${\displaystyle v=0}$${\ Displaystyle {\ Frac {[{\ rm {P}}] _ {\ rm {równ.}}} {[{\ rm {S}}] _ {\ rm {równ.}}}} = {\ Frac { k_{1}k_{2}}{k_{-1}k_{-2}}}=K_{\rm {równ.}}}$

Wartości przodu i do tyłu maksymalnych stawek, uzyskanych za , i , odpowiednio, są i , odpowiednio. Ich stosunek nie jest równy stałej równowagi, co oznacza, że termodynamika nie ogranicza stosunku maksymalnych szybkości. To wyjaśnia, że ​​enzymy mogą być znacznie „lepszymi katalizatorami” ( w kategoriach maksymalnych szybkości ) w jednym szczególnym kierunku reakcji. ${\ Displaystyle [{\ rm {S}}] \ rightarrow \ infty}$${\ Displaystyle [{\ RM {P}}] = 0}$${\ Displaystyle [{\ rm {S}}] = 0}$${\displaystyle [{\rm {P}}]\rightarrow \infty}$${\ Displaystyle V_ {\ rm {max}} ^ {f} = k_ {2} {\ rm {[e]}} _ {tot}}$${\ Displaystyle V_ {\ rm {max}} ^ {b} = - k_ {-1} {\ rm {[e]}} _ {tot}}$

On może również wyprowadzić dwie stałe Michaelisa i . Równanie Haldane'a jest relacją . ${\ Displaystyle K_ {M} ^ {S} = (k_ {-1} + k_ {2}) / k_ {1}}$${\ Displaystyle K_ {M} ^ {P} = (k_ {-1} + k_ {2}) / k_ {-2}}$${\ Displaystyle K_ {\ rm {eq}} = {\ Frac {[{\ rm {P}}] _ {\ rm {eq}}} {[{\ rm {S}}] _ {\ rm {eq }}}}={\frac {V_{\rm {max}}^{f}/K_{M}^{S}}{V_{\rm {max}}^{b}/K_{M}^ {P}}}}$

Dlatego termodynamika ogranicza stosunek między wartościami do przodu i do tyłu , a nie stosunek wartości. ${\ Displaystyle V_ {\ rm {max}} / K_ {M}}$${\displaystyle V_{\rm {maks}}}$

Kinetyka nie-Michaelisa-Mentena

Krzywa nasycenia dla reakcji enzymatycznej wykazująca kinetykę esicy.

Wiele różnych systemów enzymatycznych nie zachowuje się zgodnie z zachowaniem Michaelisa-Mentena. Kilka wybranych przykładów obejmuje kinetykę enzymów samokatalitycznych, enzymów kooperatywnych i allosterycznych, enzymów międzyfazowych i wewnątrzkomórkowych, enzymów procesywnych i tak dalej. Niektóre enzymy wytwarzają wykres sigmoidalny v przez [S], który często wskazuje na wspólne wiązanie substratu z miejscem aktywnym. Oznacza to, że wiązanie jednej cząsteczki substratu wpływa na wiązanie kolejnych cząsteczek substratu. To zachowanie jest najbardziej powszechne w enzymach multimerycznych z kilkoma oddziałującymi miejscami aktywnymi. Tutaj mechanizm współpracy jest podobny do mechanizmu hemoglobiny , przy czym wiązanie substratu do jednego miejsca aktywnego zmienia powinowactwo innych miejsc aktywnych do cząsteczek substratu. Dodatnia kooperacja występuje, gdy wiązanie pierwszej cząsteczki substratu zwiększa powinowactwo innych miejsc aktywnych do substratu. Kooperatywność negatywna występuje, gdy wiązanie pierwszego substratu zmniejsza powinowactwo enzymu do innych cząsteczek substratu.

Enzymy allosteryczne obejmują ssaczą syntetazę tyrozylowego tRNA, która wykazuje negatywną kooperację, oraz bakteryjną transkarbamoylazę asparaginianową i fosfofruktokinazę , która wykazuje pozytywną kooperację.

Kooperatywność jest zaskakująco powszechna i może pomóc w regulacji odpowiedzi enzymów na zmiany stężeń ich substratów. Dodatnia kooperacja sprawia, że ​​enzymy są znacznie bardziej wrażliwe na [S], a ich aktywność może wykazywać duże zmiany w wąskim zakresie stężenia substratu. Odwrotnie, negatywna kooperacyjność sprawia, że ​​enzymy są niewrażliwe na małe zmiany w [S].

Równanie Hill jest często używany do opisania stopnia kooperatywność ilościowo kinetyki non-Michaelis-Menten. Pochodny współczynnik Hilla n mierzy, jak bardzo wiązanie substratu z jednym miejscem aktywnym wpływa na wiązanie substratu z innymi miejscami aktywnymi. Współczynnik Hilla <1 wskazuje na negatywną kooperację, a współczynnik >1 wskazuje na pozytywną kooperację .

Kinetyka przed stanem ustalonym

Krzywa postępu stanu wstępnego, przedstawiająca fazę wybuchu reakcji enzymatycznej.

W pierwszej chwili po zmieszaniu enzymu z substratem nie powstał żaden produkt i nie istnieją żadne półprodukty . Badanie następnych kilku milisekund reakcji nosi nazwę kinetyki stanu przedstacjonarnego. Kinetyka stanu przed-stacjonarnego dotyczy zatem tworzenia i zużycia półproduktów enzym-substrat (takich jak ES lub E*) aż do osiągnięcia ich stężeń w stanie stacjonarnym .

Podejście to zostało po raz pierwszy zastosowane w reakcji hydrolizy katalizowanej przez chymotrypsynę . Często wykrycie półproduktu jest istotnym dowodem w badaniach mechanizmu działania enzymu. Na przykład w mechanizmach ping-pong, które pokazano powyżej, szybkie pomiary kinetyczne mogą śledzić uwalnianie produktu P i mierzyć tworzenie się zmodyfikowanego enzymu pośredniego E*. W przypadku chymotrypsyny, ten związek pośredni powstaje w wyniku ataku nukleofilowej seryny w miejscu aktywnym na substrat i tworzenia związku pośredniego acyloenzymu.

Na rysunku po prawej stronie enzym szybko wytwarza E* w ciągu pierwszych kilku sekund reakcji. Tempo spada następnie po osiągnięciu stanu ustalonego. Ta szybka faza wybuchu reakcji mierzy pojedynczy obrót enzymu. W konsekwencji ilość produktu uwolnionego w tym wybuchu, pokazana jako punkt przecięcia na osi y wykresu, również podaje ilość funkcjonalnego enzymu obecnego w teście.

Mechanizm chemiczny

Ważnym celem pomiaru kinetyki enzymów jest określenie mechanizmu chemicznego reakcji enzymatycznej, tj. sekwencji etapów chemicznych, które przekształcają substrat w produkt. Omówione powyżej podejścia kinetyczne pokażą, z jaką szybkością powstają i ulegają wzajemnej przemianie półprodukty , ale nie mogą one dokładnie określić, czym są te półprodukty.

Pomiary kinetyczne wykonane w różnych warunkach roztworów lub na nieznacznie zmodyfikowanych enzymach lub substratach często rzucają światło na ten mechanizm chemiczny, ponieważ ujawniają etap determinujący szybkość lub związki pośrednie w reakcji. Na przykład zerwanie wiązania kowalencyjnego z atomem wodoru jest powszechnym etapem determinującym szybkość. Który z możliwych transferów wodoru determinuje szybkość, można wykazać, mierząc efekty kinetyczne podstawienia każdego wodoru deuterem , jego stabilnym izotopem . Szybkość zmieni się, gdy krytyczny wodór zostanie zastąpiony, ze względu na pierwotny kinetyczny efekt izotopowy , który występuje, ponieważ wiązania z deuterem są trudniejsze do zerwania niż wiązania z wodorem. Możliwe jest również zmierzenie podobnych efektów przy użyciu innych podstawień izotopowych, takich jak ¹³ C/ ¹² C i ¹⁸ O/ ¹⁶ O, ale efekty te są bardziej subtelne.

Izotopy można również wykorzystać do poznania losów różnych części cząsteczek substratu w produktach końcowych. Na przykład czasami trudno jest rozpoznać pochodzenie atomu tlenu w produkcie końcowym; ponieważ może pochodzić z wody lub z części podłoża. Moment ten można określić przez systematyczne podstawienie atomów tlenu stabilnym izotopem ¹⁸ O do różnych cząsteczek, które biorą udział w reakcji oraz sprawdzenie znacznika w produkcie. Mechanizm chemiczny można również wyjaśnić, badając kinetykę i efekty izotopowe w różnych warunkach pH, ​​zmieniając jony metali lub inne związane kofaktory , ukierunkowaną mutagenezę konserwowanych reszt aminokwasowych lub badając zachowanie enzymu w obecność analogów substratu(ów).

Hamowanie i aktywacja enzymów

Schemat kinetyczny dla odwracalnych inhibitorów enzymów.

Inhibitory enzymów to cząsteczki, które zmniejszają lub znoszą aktywność enzymów, podczas gdy aktywatory enzymów to cząsteczki, które zwiększają szybkość katalityczną enzymów. Te interakcje mogą być odwracalne (tj. usunięcie inhibitora przywraca aktywność enzymu) lub nieodwracalne (tj. inhibitor trwale dezaktywuje enzym).

Odwracalne inhibitory

Tradycyjnie odwracalne inhibitory enzymów zostały sklasyfikowane jako konkurencyjny , niekonkurencyjny lub niekonkurencyjne , w zależności od ich wpływu na K, _M i V _max . Te różne efekty wynikają z wiązania się inhibitora z enzymem E, z kompleksem enzym-substrat ES lub odpowiednio z obydwoma. Podział tych klas wynika z problemu w ich wyprowadzeniu i powoduje konieczność użycia dwóch różnych stałych wiążących dla jednego zdarzenia wiążącego. Wiązanie inhibitora i jego wpływ na aktywność enzymatyczną to dwie zupełnie różne rzeczy, kolejny problem, którego tradycyjne równania nie uwzględniają. W niekonkurencyjnym hamowaniu wiązanie inhibitora skutkuje 100% hamowaniem tylko enzymu i nie bierze pod uwagę możliwości wystąpienia czegokolwiek pomiędzy. W niekonkurencyjnym hamowaniu inhibitor będzie wiązał się z enzymem w jego miejscu allosterycznym; Dlatego, powinowactwo wiązania lub odwrotność K, _M , z substratu enzymu pozostaje taka sama. Z drugiej strony _Vmax zmniejszy się w stosunku do niehamowanego enzymu. Na wykresie Lineweavera-Burka obecność niekonkurencyjnego inhibitora ilustruje zmiana punktu przecięcia y, zdefiniowanego jako 1/ _Vmax . Punkt przecięcia osi x, zdefiniowany jako −1/ K _M , pozostanie taki sam. W hamowaniu kompetycyjnym inhibitor będzie wiązał się z enzymem w miejscu aktywnym, konkurując z substratem. W rezultacie, K _M wzrośnie, V _max pozostają takie same. Powszechna forma terminu hamującego zaciemnia również związek między wiązaniem inhibitora z enzymem i jego związkiem z jakimkolwiek innym terminem wiążącym, czy to równaniem Michaelisa-Mentena, czy krzywą odpowiedzi na dawkę związaną z wiązaniem receptora ligandu. Aby zademonstrować związek, można dokonać następującego przegrupowania:

${\ Displaystyle {\ cfrac {V_ {\ max}} {1 + {\ cfrac {[I]} {K_ {i}}}}} = {\ cfrac {V_ {\ max}} {\ cfrac {[ja ]+K_{i}}{K_{i}}}}$

Dodanie zera na dole ([I]-[I])

${\ Displaystyle {\ cfrac {V_ {\ max}} {\ cfrac {[I] + K_ {i}} {[I] + K_ {i}-[I]}}}}$

Dzielenie przez [I]+K _i

${\ Displaystyle {\ cfrac {V_ {\ maks}} {\ cfrac {1} {1-{\ cfrac {[I]} {[I] + K_ {i}}}}}} = V_ {\ maks} -V_{\max }{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

Ta notacja pokazuje, że podobnie jak w równaniu Michaelisa-Mentena, gdzie szybkość reakcji zależy od procentu populacji enzymów oddziałującej z substratem, efekt inhibitora jest wynikiem procentu populacji enzymów oddziałującej z inhibitorem. Jedynym problemem związanym z tym równaniem w jego obecnej postaci jest to, że zakłada ono bezwzględne hamowanie enzymu z wiązaniem inhibitora, podczas gdy w rzeczywistości może wystąpić szeroki zakres efektów w dowolnym miejscu, od 100% hamowania przemiany substratu do zaledwie >0%. W celu uwzględnienia tego równania może być łatwo modyfikowany w celu umożliwienia różnym stopniu hamowania włączając delta V _max określenia.

${\ Displaystyle V_ {\ max} - \ Delta V_ {\ max} {\ cfrac {[I]} {[I] + K_ {i}}}}$

lub

${\ Displaystyle V_ {\ max 1} - (V_ {\ max 1} - V_ {\ max 2}) {\ cfrac {[I]}{[I] + K_ {i}}}}$

Termin ten może następnie określać resztkową aktywność enzymatyczną obecną, gdy inhibitor oddziałuje z poszczególnymi enzymami w populacji. Jednakże włączenie tego terminu ma wartość dodaną dzięki czemu możliwość aktywacji, jeśli średnie V _max termin okazuje się być większe niż okresu początkowego. Aby uwzględnić możliwą aktywację, a także notację można przepisać, zastępując inhibitor „I” terminem modyfikującym, oznaczonym tutaj jako „X”.

${\ Displaystyle V_ {\ max 1} - (V_ {\ max 1} - V_ {\ max 2}) {\ cfrac {[X]} {[X] + K_ {x}}}}$

Podczas tej terminologii wyniki w uproszczony sposób postępowania z efekty kinetyczne w odniesieniu do maksymalnej prędkości równania Michaelis-Menten, że podkreśla potencjalne problemy z terminem używanym do opisania działania związane z K _M . K _K dotycząca powinowactwo enzymu do substratu powinna w większości przypadków odnoszą się do ewentualnych zmian w miejscu wiązania enzymu, która jest bezpośrednio wynikiem interakcji inhibitorów enzymów. Jako taki termin podobny do zaproponowanego powyżej do modulowania V _max powinien być odpowiedni w większości sytuacji:

${\ Displaystyle K_ {m1} - (K_ {m1} -K_ {m2}) {\ cfrac {[X]} {[X] + K_ {x}}}}$

Kilka przykładów odwracalnego hamowania należących do modeli konkurencyjnych i niekonkurencyjnych zostało omówionych w poniższych artykułach.

Nieodwracalne inhibitory

Inhibitory enzymów mogą również nieodwracalnie dezaktywować enzymy, zwykle poprzez kowalencyjną modyfikację reszt miejsca aktywnego. Reakcje te, które można nazwać substratami samobójczymi, podążają za wykładniczymi funkcjami rozpadu i są zwykle nasycalne. Poniżej nasycenia są one zgodne z kinetyką pierwszego rzędu względem inhibitora. Nieodwracalne hamowanie można podzielić na dwa różne typy. Znakowanie powinowactwa jest rodzajem nieodwracalnego hamowania, w którym grupa funkcyjna, która jest wysoce reaktywna, modyfikuje katalitycznie krytyczną resztę na białku będącym przedmiotem zainteresowania, aby wywołać hamowanie. Z drugiej strony hamowanie oparte na mechanizmie obejmuje wiązanie inhibitora, po którym następują zmiany za pośrednictwem enzymu, które przekształcają ten ostatni w grupę reaktywną, która nieodwracalnie modyfikuje enzym.

Filozoficzny dyskurs o odwracalności i nieodwracalności hamowania

Po omówieniu odwracalnego hamowania i nieodwracalnego hamowania w powyższych dwóch nagłówkach, należy podkreślić, że koncepcja odwracalności (lub nieodwracalności) jest czysto teoretyczną konstrukcją zależną wyłącznie od ram czasowych testu, tj. testu odwracalnego obejmujące asocjację i dysocjację cząsteczki inhibitora w minutowych skalach czasowych wydaje się nieodwracalne, jeśli test ocenia wynik w sekundach i vice versa. Istnieje ciągłość zachowań inhibitorów obejmujących odwracalność i nieodwracalność w danym niearbitralnym przedziale czasowym testu. Istnieją inhibitory, które wykazują powolne działanie, a większość z tych inhibitorów niezmiennie wykazuje również ścisłe wiązanie z celem białkowym będącym przedmiotem zainteresowania.

Mechanizmy katalizy

Zmienność energii w funkcji współrzędnej reakcji pokazuje stabilizację stanu przejściowego przez enzym.

Preferowanym modelem interakcji enzym-substrat jest model indukowanego dopasowania. Model ten sugeruje, że początkowe oddziaływanie między enzymem a substratem jest stosunkowo słabe, ale te słabe oddziaływania szybko wywołują zmiany konformacyjne w enzymie, które wzmacniają wiązanie. Te zmiany konformacyjne również zbliżają reszty katalityczne w miejscu aktywnym do wiązań chemicznych w podłożu, które zostaną zmienione w reakcji. Zmiany konformacyjne można mierzyć za pomocą dichroizmu kołowego lub interferometrii dwupolaryzacyjnej . Po zaistnieniu wiązania jeden lub więcej mechanizmów katalizy obniża energię stanu przejściowego reakcji, zapewniając alternatywny szlak chemiczny dla reakcji. Mechanizmy katalizy obejmują katalizę przez odkształcenie wiązania; przez bliskość i orientację; przez donory lub akceptory protonów w miejscu aktywnym; kataliza kowalencyjna i tunelowanie kwantowe .

Kinetyka enzymów nie może udowodnić, jakie tryby katalizy są używane przez enzym. Jednak niektóre dane kinetyczne mogą sugerować możliwości zbadania innymi technikami. Na przykład mechanizm ping-ponga z kinetyką w fazie burst przed stanem ustalonym sugerowałby, że kataliza kowalencyjna może być ważna w mechanizmie tego enzymu. Alternatywnie zaobserwowania silnego wpływu pH na V _max ale K _K może oznaczać, że pozostałości w miejscu aktywnym musi być w szczególności jonizacji stanie do katalizy wystąpić.

Historia

W 1902 Victor Henri zaproponował ilościową teorię kinetyki enzymów, ale w tym czasie eksperymentalne znaczenie stężenia jonów wodorowych nie było jeszcze rozpoznane. Po tym, jak Peter Lauritz Sørensen zdefiniował logarytmiczną skalę pH i wprowadził koncepcję buforowania w 1909 roku, niemiecki chemik Leonor Michaelis i dr Maud Leonora Menten (wówczas badaczka podoktorancka w laboratorium Michaelisa) powtórzyli eksperymenty Henriego i potwierdzili jego równanie, które jest obecnie ogólnie określana jako kinetyka Michaelisa-Mentena (czasami także kinetyka Henri-Michaelisa-Mentena ). Ich prace zostały dalej rozwinięte przez GE Briggsa i JBS Haldane'a , którzy wyprowadzili równania kinetyczne, które nadal są powszechnie uważane za punkt wyjścia w modelowaniu aktywności enzymatycznej.

Głównym wkładem podejścia Henri-Michaelis-Menten było myślenie o reakcjach enzymatycznych w dwóch etapach. W pierwszym substrat wiąże się odwracalnie z enzymem, tworząc kompleks enzym-substrat. Jest to czasami nazywane kompleksem Michaelisa. Enzym następnie katalizuje etap chemiczny w reakcji i uwalnia produkt. Kinetykę wielu enzymów odpowiednio opisuje prosty model Michaelisa-Mentena, ale wszystkie enzymy mają ruchy wewnętrzne , które nie są uwzględniane w modelu i mogą mieć znaczący udział w ogólnej kinetyce reakcji. Można to zamodelować, wprowadzając kilka ścieżek Michaelisa-Mentena, które są związane z fluktuacją szybkości, co jest matematycznym rozszerzeniem podstawowego mechanizmu Michaelisa Mentena.

Oprogramowanie

ENZO (Enzyme Kinetics) to graficzne narzędzie interfejsu do budowania modeli kinetycznych reakcji katalizowanych enzymami. ENZO automatycznie generuje odpowiednie równania różniczkowe na podstawie ustalonego schematu reakcji enzymatycznej. Te równania różniczkowe są przetwarzane przez solwer numeryczny i algorytm regresji, który dopasowuje współczynniki równań różniczkowych do obserwowanych eksperymentalnie krzywych przebiegu czasu. ENZO umożliwia szybką ocenę konkurencyjnych schematów reakcji i może być stosowany do rutynowych testów kinetyki enzymów.

Zobacz też

• Dynamika białka
• Enzym o ograniczonej dyfuzji
• Model adsorpcji Langmuira

Przypisy

α. ^{^} Link: Interaktywny samouczek kinetyki Michaelisa-Mentena (wymagana Java)

β. ^{^} Link: mechanizm reduktazy dihydrofolianowej (Gif)

γ. ^{^} Link: mechanizm polimerazy DNA (Gif)

. ^{^} Link: mechanizm chymotrypsyny (wymagany Flash)

Bibliografia

Dalsza lektura

Wprowadzający

• Cornish-Bowden, Athel (2012). Podstawy kinetyki enzymów (wyd. 4). Weinheim: Wiley-Blackwell. Numer ISBN 978-3-527-33074-4.
• Stevens L, Cena NC (1999). Podstawy enzymologii: biologia komórkowa i molekularna białek katalitycznych . Oxford [Oxfordshire]: Oxford University Press. Numer ISBN 978-0-19-850229-6.
• Bugg, Tim (2004). Wprowadzenie do chemii enzymów i koenzymów . Cambridge, MA: Blackwell Publishers. Numer ISBN 978-1-4051-1452-3.
• Segel, Irwin H. (1993). Kinetyka enzymatyczna: zachowanie i analiza układów enzymatycznych szybkiej równowagi i stanu ustalonego . Nowy Jork: Wiley. Numer ISBN 978-0-471-30309-1.

Zaawansowany

• Ferszt, Alan (1999). Struktura i mechanizm w naukach o białkach: przewodnik po katalizie enzymatycznej i fałdowaniu białek . San Francisco: WH Freeman. Numer ISBN 978-0-7167-3268-6.
• Schnell S, Maini PK (2004). „Sto od kinetyki enzymów Wiarygodność K _M i V _max wartościami” . Komentarze na temat biologii teoretycznej . 8 (2–3): 169–87. CiteSeerX  10.1.1.493.7178 . doi : 10.1080/08948550302453 . Źródło 22 września 2020 .
• Walsh, Christopher (1979). Mechanizmy reakcji enzymatycznych . San Francisco: WH Freeman. Numer ISBN 978-0-7167-0070-8.
• Cleland WW, Cook P (2007). Kinetyka i mechanizm enzymów . Nowy Jork: Garland Science. Numer ISBN 978-0-8153-4140-6.

Zewnętrzne linki

• Animacja testu enzymatycznego — pokazuje efekty manipulacji warunkami testu
• MACiE — Baza danych mechanizmów reakcji enzymatycznych
• Enzym - enzym ExPASy bazie nomenklatura
• ENZO — aplikacja internetowa do łatwej budowy i szybkiego testowania modeli kinetycznych reakcji katalizowanych enzymami.
• ExCatDB — Baza danych mechanizmów katalitycznych enzymów
• BRENDA — Kompleksowa baza danych enzymów, zawierająca substraty, inhibitory i diagramy reakcji
• SABIO-RK — Baza danych kinetyki reakcji
• Grupa badawcza Josepha Krauta, Uniwersytet Kalifornijski w San Diego — Animacje kilku mechanizmów reakcji enzymatycznych
• Symbolizm i terminologia w kinetyce enzymów — Kompleksowe wyjaśnienie pojęć i terminologii w kinetyce enzymów
• Wprowadzenie do kinetyki enzymów — dostępny zestaw samouczków on-line na temat kinetyki enzymów
• Animowany samouczek kinetyki enzymów — animowany samouczek z dźwiękiem