Śledzenie wsteczne — Retrograde tracing

Neurony PVH szczura Long-Evans oznaczone znacznikiem wstecznym fluoro-złoto

Śledzenie wsteczne jest metodą badawczą stosowaną w neuronauce do śledzenia połączeń nerwowych od punktu ich zakończenia ( synapsy ) do ich źródła ( ciała komórki ). Techniki śledzenia wstecznego pozwalają na szczegółową ocenę połączeń neuronalnych między docelową populacją neuronów a ich wejściami do układu nerwowego . Techniki te pozwalają na "mapowanie" połączeń między neuronami w określonej strukturze (np. oku ) a docelowymi neuronami w mózgu . Odwrotną techniką jest śledzenie postępowe , które służy do śledzenia połączeń nerwowych od ich źródła do punktu ich zakończenia (tj. od ciała komórki do synapsy). Techniki śledzenia wstecznego i wstecznego opierają się na wizualizacji transportu aksonów .

Techniki

Śledzenie wsteczne można osiągnąć różnymi sposobami, w tym przy użyciu szczepów wirusowych jako markerów łączności komórki z miejscem wstrzyknięcia. Na przykład wirus wścieklizny rzekomej (PRV; szczep Bartha) może być stosowany jako odpowiedni znacznik ze względu na skłonność infekcji do rozprzestrzeniania się w górę szlakiem neuronów połączonych synaptycznie, ujawniając w ten sposób naturę ich obwodów.

Wykazano, że wścieklizna jest skuteczna w tym systemie śledzenia obwodów ze względu na niski poziom uszkodzeń zakażonych komórek, specyficzność infekowania tylko neuronów i ścisłe ograniczenie rozprzestrzeniania się wirusa między neuronami a regionami synaptycznymi. Czynniki te pozwalają na bardzo specyficzne ślady, które mogą ujawnić poszczególne połączenia neuronalne w obwodzie bez powodowania fizycznych uszkodzeń komórek.

Inna technika polega na wstrzykiwaniu specjalnych „kulek” do jąder mózgu znieczulonych zwierząt. Zwierzętom pozwala się przeżyć kilka dni, a następnie poddaje się eutanazji. Komórki na początku projekcji są wizualizowane przez odwrócony mikroskop fluorescencyjny .

Wickersham i współpracownicy opracowali specjalistyczną technikę, która wykorzystywała zmodyfikowany wirus wścieklizny . Wirus ten był w stanie zainfekować pojedynczą komórkę i przeskoczyć przez jedną synapsę; pozwoliło to naukowcom zbadać lokalną łączność neuronów.

Wirus wścieklizny

Wirus wścieklizny po wchłonięciu na końcu synaptycznym lub aksonie neuronu docelowego jest otoczony pęcherzykiem, który jest transportowany w kierunku ciała komórki przez dyneinę aksonów . W przypadku wirusa wścieklizny typu dzikiego wirus będzie kontynuował replikację i rozprzestrzenianie się w ośrodkowym układzie nerwowym, aż do systemowego zakażenia całego mózgu. Delecja genu kodującego glikoproteinę (białko G) we wściekliźnie ogranicza rozprzestrzenianie się wirusa wyłącznie do komórek, które zostały początkowo zakażone. Transsynaptyczne rozprzestrzenianie się wirusa można ograniczyć do transmisji monosynaptycznej do neuronu pochodzenia przez pseudotypowanie białka G i umieszczenie genu pod kontrolą Cre . To rozprzestrzenianie się wirusa można wizualizować metodami obejmującymi dodanie genu fluorescencji, takiego jak białko zielonej fluorescencji, do kasety wirusa lub za pomocą immunohistochemii .

Wirus pseudorabii

Wirus wścieklizny rzekomej , należący do rodziny herpesviridae , rozprzestrzenia się przez CNS zarówno wstecznie, jak i wstecznie, przesuwając się w górę aksonu nerwowego do somy i dendrytów we wstecznej aplikacji. Delecja trzech kluczowych genów białek błonowych w szczepie wścieklizny rzekomej PRV-Bartha blokuje postępujące rozprzestrzenianie się wirusa i pozwala na dodatkowe manipulacje wirusowym DNA, takie jak dodanie fluorescencji, co pozwala na wsteczne śledzenie obwodów.

Fluoro-Złoty

Fluoro-Gold, znany również jako hydroksystilbamidyna , jest niewirusowym fluorescencyjnym znacznikiem wstecznym, którego ruch w górę aksonu i przez drzewo dendrytyczne można uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub immunohistochemii.

Zobacz też

Bibliografia

Dalsza lektura

Śledzenie wsteczne jest szeroko stosowane w wielu badaniach neurologicznych, w tym w następujących przykładach: